一种靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针及制备和应用的制作方法

本发明涉及一种靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针及制备和应用。具体涉及靶向多肽连接的磷脂包裹油相纳米Zn-Fe₃O₄，同时兼有荧光/核磁双模态成像探针的制备方法。本发明在载药领域具有应用前景。

背景技术：

脑部肿瘤的生存期短、死亡率高，严重危害人类健康，目前临床应用的药物制剂和纳米药物均难以奏效。因此，肿瘤早期诊断尤为重要。要实现脑外科手术中肿瘤的安全、完整的切除，主要取决于对肿瘤边界的精确界定。其中作为颅内肿瘤的主要类型，神经胶质瘤的分化程度差、增殖及侵袭能力强，呈弥漫性生长、无明确的边界，肉眼很难将其与周边正常组织区分开来。又由于病灶部位通常与中枢神经血管结构毗邻，不当的手术操作可能导致严重的非可逆损伤。因此，我们发明了一种荧光/磁共振双模态探针，不仅能够实现手术前肿瘤的精确定位，还能在手术中帮助指导肿瘤边缘的精准界定，同时生物相容性好，是一种实时、精准的可视化技术。

磷脂的包裹相对于单纯的无机纳米颗粒具有更好的生物相容性，增加了体内循环时间和稳定性。多模态探针显像技术能够克服单个显像技术的自身局限，综合多种优势，同时满足定量、实时以及灵敏度等的要求。因此开发荧光/核磁双模态探针具有重要意义。

技术实现要素：

本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针及制备和应用。以锌掺杂的纳米四氧化三铁 为主体，使用靶向修饰的磷脂包裹Zn-Fe₃O₄复合物的制备方法。该方法通过控制反应条件，在磷脂表面连接不同靶向的多肽及抗体分子，成功包裹了油相纳米颗粒。具有包裹量大，性能稳定，生物相容性好的特点。所得产物具有较好的临床应用前景。

一种靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）和靶向分子-DSPE（P-DSPE）溶于氯仿或环己烷溶液，加入锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒（Zn-Fe₃O₄），使得磷脂与Zn-Fe₃O₄的质量比为1:1-10:1；将混合溶液置于圆底烧瓶中，加入适量超纯水，超声混匀，再将上述混合液旋转蒸发，40℃-80℃，10min-30min；通过磁性吸附锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒于容器底部，去上清，可以将未包覆的磷脂去除，最终得到靶向磷脂包裹的纳米四氧化三铁；

（2）靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针的制备：

将荧光（FITC）修饰好的DSPE（FITC-DSPE），DSPE-PEG和靶向DSPE（P-DSPE）溶于氯仿溶液，加入锌掺杂的纳米四氧化三铁（Zn-Fe₃O₄），使得磷脂与Zn-Fe₃O₄的质量比为1:1-10:1；将混合溶液置于圆底烧瓶中，加入适量超纯水，超声混匀；再将上述混合液旋转蒸发，40℃-80℃，10min-30min，通过磁性吸附锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒于容器底部，去上清，可以将未包覆的磷脂去除，最终得到靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针。

所述的靶向分子为靶向神经鞭毛素蛋白（Neuropilin-1）的多肽分子的一种，或靶向Toll样受体4抗体（TLR4）。

FITC-DSPE: P-DSPE: DSPE-PEG的质量比为0.2:1:10。

磷脂与Zn-Fe₃O₄的质量比为1:1-10:1。

一种靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针，其特征在于，根据上述任一所述方法制备得到。

一种靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针的应用。

本发明的方法具体为：

（1）靶向磷脂的制备

将巯基修饰的多肽分子溶解于磷酸盐缓冲溶液中（PBS，pH=7.0），马来酰亚胺修饰的磷脂分子（DSPE-PEG-MAL）溶解于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中。然后将DSPE-PEG-MAL溶液加入到多肽溶液中。超声除去溶液中的气泡，然后磁力搅拌1小时。

反应液稀释3-5倍，装入透析袋透析，以除去DMF，PBS，以及未连接的多肽分子等。得到多肽(P)连接的磷脂分子（P-DSPE）。冷冻干燥得到固体产物。

（2）靶向磷脂包裹锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒

将DSPE-PEG和上述1中靶向DSPE（P-DSPE）溶于氯仿溶液。加入锌掺杂的纳米四氧化三铁（Zn-Fe₃O₄），使得磷脂与Zn-Fe₃O₄的质量比为1:1-10:1。将混合溶液置于圆底烧瓶中，加入适量Q水，超声混匀。再将上述混合液旋转蒸发，40℃-80℃，10min-30min。通过磁性吸附锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒于容器底部，去上清，可以将未包覆的磷脂去除，最终得到靶向磷脂包裹的纳米四氧化三铁。

（3）靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针的制备

将荧光（FITC）修饰的DSPE（FITC-DSPE），DSPE-PEG和上述1中靶向DSPE（P-DSPE）溶于氯仿溶液。加入锌掺杂的纳米四氧化三铁（Zn-Fe₃O₄），使得磷脂与Zn-Fe₃O₄的质量比为1:1-10:1。将混合溶液置于圆底烧瓶中，加入适量Q水，超声混匀。再将上述混合液旋转蒸发，40℃-80℃，10min-30min。通过磁铁吸附Zn-Fe₃O₄颗粒于容器底部，去上清，可以将未包覆的磷脂去除，最终得到靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针。

具体涉及靶向多肽连接的磷脂包裹油相纳米无机颗粒，同时兼有荧光/核磁双模态成像探针的制备方法。

本发明的优点在于：本发明采用靶向磷脂包裹锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒的结构。所用原料生物安全性高，部分原料已经形成商品，具有一定的应用前景。）本发明制备的靶向磷脂包裹的纳米颗粒，性质稳定，生物相容性好，兼具靶向性，荧光和核磁共振成像功能。）本发明中的制备方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用。

附图说明

图1为所制备的靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针的透射电镜图。

图2为所制备靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针的粒度图。

其中a为油相Zn-Fe₃O₄纳米颗粒；b为靶向多肽磷脂包裹的Zn-Fe₃O₄纳米颗粒； c为磷脂包裹的Zn-Fe₃O₄纳米颗粒。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

实施例1：

将荧光（FITC）修饰好的DSPE（FITC-DSPE），DSPE-PEG和上述1中靶向DSPE（该靶向多肽的序列为CPVTRPPR）溶于氯仿溶液。加入锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒（Zn-Fe₃O₄），使得磷脂与Zn-Fe₃O₄的质量比为2:1。将混合溶液置于圆底烧瓶中，加入适量Q水，超声混匀。再将上述混合液旋转蒸发，70℃，15min。通过磁铁吸附锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒于容器底部，去上清，可以将未包覆的磷脂去除，最终得到靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针。

实施例2：

将荧光（FITC）修饰好的DSPE（FITC-DSPE），DSPE-PEG和上述1中靶向DSPE（该靶向多肽的序列为CRPAKPAR）溶于氯仿溶液。加入锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒（Zn-Fe₃O₄），使得磷脂与Zn-Fe₃O₄的质量比为3:1。将混合溶液置于圆底烧瓶中，加入适量Q水，超声混匀。再将上述混合液旋转蒸发，60℃，20min。通过磁铁吸附锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒于容器底部，去上清，可以将未包覆的磷脂去除，最终得到靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针。

实施例3：

将荧光（FITC）修饰好的DSPE（FITC-DSPE），DSPE-PEG和上述1中靶向DSPE（该靶向多肽的序列为CRGERPPR）溶于氯仿溶液2.5ml。加入锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒（Zn-Fe₃O₄）胶体溶液2.5ml，使得磷脂与Zn-Fe₃O₄的质量比为5:1。将混合溶液置于圆底烧瓶中，加入Q水5ml，超声混匀。再将上述混合液旋转蒸发，80℃，30min。通过磁铁吸附锌掺杂的四氧化三铁纳米颗粒于容器底部，去上清，可以将未包覆的磷脂去除，最终得到靶向磷脂包裹的荧光/核磁双模态探针。