一种组合物和药物制剂及其应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种组合物和药物制剂及其应用。

背景技术：

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，根据病理类型包括腺癌、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌，其中前列腺腺癌占95％以上，因此，通常我们所说的前列腺癌就是指前列腺腺癌。前列腺癌是欧美男性中发病最频繁的癌症之一，并且是男性癌症患者中致死率排名第二的癌症。随着环境和饮食的变化，近几年，在亚洲地区，前列腺癌患者也呈现出明显的上升趋势。

对于转移性的雄激素敏感的前列腺癌最常用的治疗手段是雄激素剥夺疗法，但是这种方法只是在2-3年内有效，最终患者会进展为转移性的去势抵抗性前列腺癌，到了这一阶段最常用的方法就是以多西他赛为主的化学疗法。多西他赛是一个疗效非常好的抗肿瘤化疗药物，然而，随着用药时间以及用药剂量的增加，患者容易产生对多西他赛的耐药性，往往导致救治无效而死亡。因此，急需研发一种药物制剂，用于改善以多西他赛为基础的抗癌药物的敏感性，从而提高多西他赛的治疗效果。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种组合物和药物制剂及其应用，用于改善以多西他赛为基础的抗癌药物的敏感性，从而提高多西他赛的治疗效果。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供了一种组合物，包括：多西他赛和YK-4-279。

优选的，所述多西他赛和YK-4-279的摩尔浓度比为1：100～1000。

更优选的，所述多西他赛和YK-4-279的摩尔浓度比为1：1000。

本发明还提供了一种药物制剂，包括上述组合物和药学上可接受的辅料。

优选的，所述药物制剂的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂。

本发明还提供了上述组合物或上述药物制剂在制备抗癌药物中的应用。

优选的，所述癌为前列腺癌。

本发明提供了一种组合物和药物制剂，包含摩尔浓度比为1:1000的多西他赛和YK-4-279，配伍合理，两者联合用药既能改善多西他赛的药物敏感性，又发挥了YK-4-279作为一种ETV1小分子抑制剂在抗前列腺癌方面的作用，协同增强了多西他赛的治疗效果。经实验证明，多西他赛和YK-4-279两者联合用药较单独用药时对人前列腺癌细胞的抑制活性明显增强，而且降低了癌症治疗中的给药剂量，减少药物的毒副作用，减少对人体的伤害，有望成为一种高效低毒的抗前列腺癌药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为实施例1中人前列腺癌细胞株LNCaP的细胞活力检测结果；

图2为实施例1中人前列腺癌细胞株PC-3的细胞活力检测结果；

图3为实施例2中人前列腺癌细胞株LNCaP的细胞活力检测结果；

图4为实施例2中人前列腺癌细胞株PC-3的细胞活力检测结果；

图5为实施例3中多西他赛和YK-4-279单独给药和联合用药下人前列腺癌细胞LNCaP凋亡情况的形态学评估结果；

图6为实施例3中多西他赛和YK-4-279单独给药和联合用药下人前列腺癌细胞PC-3凋亡情况的形态学评估结果。

具体实施方式

本发明的目的在于降低多西他赛在治疗前列腺癌时的耐药性，改善以多西他赛为基础的抗癌药物的敏感性，从而提高多西他赛的治疗效果。研究表明不同的药物联合使用时可以达到多靶点多抑制的效果，在恶性肿瘤的治疗中，联合用药已经成为一种趋势。不同的药物联合使用可能会产生一定的协同作用，从而降低单独用药的剂量，减少药物毒性在体内的积累，避免不良反应的叠加，增加药物的疗效。

本研究选多西他赛作为联合药物组合之一是因为多西他赛作为一线抗癌药物在癌症治疗中一直处于中流砥柱之位，尽管在治疗前列腺癌的过程中会产生耐药性，但仍在多种癌症治疗中具有积极的作用，因此我们希望找到一种有效的小分子抑制剂和其及进行联合，从而减少多西他赛的用药剂量和毒性，延迟耐药性的产生。基于此思路，我们进行了大量的前期研究和文献调研，发现在前列腺癌的治疗中，多西他赛的药物敏感性与雄激素受体通路有关，而ETV1蛋白的过表达又会激活雄激素受体通路，因此我们选择ETV1小分子抑制剂YK-4-279和多西他赛联合使用来研究对前列腺癌的影响。首先我们通过MTT实验筛选出单药对前列腺癌细胞的细胞生长抑制率在20％以内的药物浓度，得出多西他赛为1nM以内，YK-4-279为1uM以内，最终以多西他赛1nM，YK-4-279 0.1uM、0.5uM、1.0uM进行联合筛选最合适的药物配比。确定了最合适的药物配比为1:1000，设置好一系列浓度梯度进行研究，得出两者联合具有协同作用，并且得出优选的低剂量组合为多西他赛0.5nM，YK-4-279 0.5uM。根据优选的剂量组合又进一步探究了单独和联合用药对LNCaP和PC-3细胞的细胞凋亡和死亡的影响以及对细胞迁移和侵袭的影响。从而证明了该低剂量的联合使用抑制了前列腺癌细胞LNCaP和PC-3的增殖和转移，并促进了前列腺癌细胞LNCaP和PC-3的凋亡，表明YK-4-279和多西他赛联合用药会更有效地抑制前列腺癌的进展。

本发明提供了一种组合物，包括：多西他赛和YK-4-279。

多西他赛，是被分类为“taxene”、“抗微管剂”或“植物类生物碱”的抗癌药物，其通过干扰微管(微管是用于分裂和细胞分裂期间的自我克隆的结构)的分离而抑制癌细胞生长。目前作为一种针对转移性的去势抵抗性前列腺癌的常用化学药物。

YK-4-279，是一种ETV1的小分子抑制剂，其分子结构式如图(I)所示。现有研究表明，转移性去势抵抗性前列腺癌与ETS基因融合有很大的联系，根据统计，大约50％的患者出现ETV1基因融合。

本发明对多西他赛和YK-4-279的来源不做特殊限制，采用本领域技术人员熟知的即可，如市售来源，或者采用本领域常规技术制备进行即可。

进一步的，所述多西他赛和YK-4-279的摩尔浓度比为1：100～1000。

更进一步的，所述多西他赛和YK-4-279的摩尔浓度比为1：1000。

本发明还提供了一种药物制剂，包括上述组合物和药学上可接受的辅料。

优选的，所述药物制剂的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂。

本发明还提供了上述组合物或上述药物制剂在制备抗癌药物中的应用。

进一步的，所述癌为前列腺癌。

下面将结合本发明说明书附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。

实施例1

采用CCK-8实验测定前列腺癌细胞的细胞活力，具体过程如下：

1、获取受试细胞：人前列腺癌细胞株LNCaP和PC-3。

2、分别配制不同配比的多西他赛和YK-4-279组合物，该组合物中多西他赛和YK-4-279的摩尔浓度分别设为1:100、1:500和1:1000，并设1组空白对照和4组阳性对照。其中，阳性对照组的多西他赛组浓度设为1nM，YK-4-279组的浓度分别设为0.1μM、0.5μM和1μM。

3、将受试细胞按2×10⁴个/ml接种于96孔板中，每孔添加细胞悬液100ul，置于细胞培养箱中培养24h，然后分别加入步骤2中配制好的样品溶液处理72h，移除旧的培养基加入新的培养基，每孔加入10ul的CCK-8试剂，孵育1h后，采用酶标仪在450nm波长下进行检测，记录数据。

如图1和图2所示，多西他赛和YK-4-279单独用药时，两种前列腺癌细胞的细胞活力均在80％以上。然而，多西他赛和YK-4-279配伍使用时，LNCaP和PC-3的细胞活力均有所下降，说明多西他赛和YK-4-279联合用药对前列腺癌细胞的生长具有较强的抑制活性，其中，以多西他赛和YK-4-279的摩尔浓度比例为1:1000时的抗癌效果最佳。

实施例2

通过台盼蓝拒染实验进行测定多西他赛和YK-4-279按1:1000的摩尔浓度联合用药时前列腺癌细胞LNCaP和PC-3的活细胞数，具体实施方案如下：

将LNCaP和PC-3细胞按2×10⁴个/ml接种于直径为35mm规格的培养皿中，每皿添加细胞悬液2ml，置于细胞培养箱中培养24h，然后用受试样品处理72h，再用胰蛋白酶消化并制备单细胞悬浮液。取80ul细胞悬浮液和20ul的0.4％台盼蓝溶液混合，染色5min后，在倒置显微镜下用血球计数板计数，被染成蓝色的是死细胞，反之则是活细胞。其中，受试样品多西他赛(nM)-YK-4-279(μM)的浓度设为0.1、0.5、1、2这4个梯度，且均以单独使用相同浓度的多西他赛或YK-4-279作为阳性对照。

如图3和图4所示，无论多西他赛和YK-4-279单独作用还是联合作用，其对LNCaP和PC-3细胞生长的影响呈剂量依赖性。当多西他赛浓度为0.1nM、YK-4-279浓度为0.1uM时，联合用药对LNCaP和PC-3细胞生长的影响基本和单独用药的影响基本一致；当多西他赛浓度为0.5nM、YK-4-279浓度为0.5uM时，联合用药对LNCaP和PC-3细胞生长的影响明显比单独用药效果明显。而且，浓度为0.5nM的多西他赛和浓度为0.5uM的YK-4-279联合作用时，基本和单独作用的高剂量的浓度为2nM的多西他赛和浓度为2uM的YK-4-279对LNCaP和PC-3细胞的生长抑制率一致，说明本发明联合用药可以降低给药剂量，抑制高剂量给药时可能会给人体带来的毒副作用。

根据数据统计，多西他赛和YK-4-279联合用药时，对于LNCaP和PC-3细胞而言，其联合作用指数(CI)均为0.64，表明多西他赛和YK-4-279联合用药能够协同地抑制LNCaP和PC-3细胞的生长。

实施例3

以0.5nM多西他赛和0.5uM YK-4-279单独及其联合用药对人前列腺癌细胞LNCaP和PC-3细胞凋亡的影响的进行研究。采用台盼蓝拒染实验测定死细胞数，以及通过碘化丙啶染色结合形态学评估的方法来研究细胞凋亡，具体实施方案如下：

将LNCaP和PC-3细胞按2×10⁴个/ml接种于直径为35mm规格的培养皿中，每皿添加细胞悬液2ml，置于细胞培养箱中培养24h，然后用0.5nM多西他赛和0.5uM YK-4-279单独或者联合处理72h，再用胰蛋白酶消化并制备单细胞悬浮液，接着用涂片离心机制备成单细胞层涂片，在室温下用固定液(丙酮:甲醇＝1:1)固定10min。用PI(1ug/ml in PBS)染液染色10min，在倒置荧光显微镜下，随机选取视野拍照，出现核碎裂、核固索、凋亡小体的细胞被计为凋亡的细胞。其中，空白对照为DMSO溶液。

图5和图6中的白色箭头代表凋亡的前列腺癌细胞，如图所示，多西他赛和YK-4-279单独用药时对LNCaP和PC-3细胞的凋亡影响较小，凋亡细胞数量很少；当多西他赛和YK-4-279联合用药时，凋亡细胞的数量增多，有较强的促进细胞凋亡的作用。

表1为0.5nM多西他赛和0.5uMYK-4-279单独以及联合用药对人前列腺癌细胞LNCaP和PC-3细胞凋亡率和死亡率的影响结果，如表1所示，0.5nM多西他赛和0.5uM YK-4-279单独用药对细胞的凋亡率和死亡率的影响较小，联合用药时癌细胞的凋亡率和死亡率是单独用药时的2-3倍，效果明显。

表1