本发明属于生物制药中抗体治疗剂领域，具体涉及鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺。
背景技术：
：鸡卵黄抗体(eggyolkim-munoglobulin)是存在于卵黄中的免疫球蛋白，它是由母鸡血清中的免疫球蛋白转移而来。卵黄抗体可以应用于临床疾病的治疗，如鸡传染性法氏囊病、新城疫、鸭瘟、小鹅瘟、猪瘟等等。在临床实践中，卵黄抗体的预防和治疗效果非常理想，同时卵黄抗体的制造工艺简单价廉，几年前在养禽业生产中用量很大，发挥过十分重要的作用。但是，没有经过病原微生物灭活的抗体类治疗剂存在十分明显的问题。其原因在于制备抗体采用的禽极易携带垂直传播性病原，如大肠杆菌、沙门氏菌、减蛋综合征病毒、禽流感病毒等；另外，由于一些企业生产条件简单，生产过程中容易混杂入一些外源性病毒。鉴于这些情况，脱脂卵黄抗体必须进行禽源、外源性病原微生物的灭活处理，防止使用卵黄抗体后造成传播病原的扩散甚至疾病的爆发。β-丙内酯(bpl)是一种杂环化合物，对病毒具有很强的灭活作用，比福尔马林作用强25倍，但对病毒抗原影响或破坏作用较小。其作用机制通过与嘌呤碱基(主要是鸟嘌呤)反应改变病毒核酸结构达到灭活病毒的目的，蛋白不发生反应，不影响抗体的效价。β-丙内酯虽是一种致癌物，但极易水解，37℃2小时可以完全水解，水解后形成人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸，对人体无害，在国外已广泛用于各种疫苗的灭活。将bpl用于卵黄抗体外源型病毒灭活，具有安全的和不影响抗体效价等优点。但是灭活剂β-丙内酯成本较高，在国内的实际生产中应用较少，多数使用甲醛灭活。有研究报道，bpl的浓度和反应时间与灭活效果存在一定关系。所以优选出bpl的最佳灭活条件，在合理节约的条件下，获得良好的灭活效果是关键。此外，由于兽用高免卵黄液价格低廉和针对地方变异病原株的特殊性要求，在我国现有条件下，绝大多数生产厂家只能使用非spf蛋。所以除了病毒以外，高免卵黄液中还容易携带垂直传播性的细菌性病原，比如沙门氏菌、大肠杆菌等。此外，在制备的过程中也可能带来一些细菌的污染。60coγ射线具有较强的穿透力，在生物体中能均匀地产生作用，主要是通过作用于病毒核酸(dna、rna)而造成病毒失活，可以完全杀灭高免卵黄液中的大肠杆菌、沙门氏菌和霉形体，且不影响卵黄抗体的效价和理想性质。60coγ射线对微生物有较强的杀灭作用，不同类型的病毒对60coγ射线的敏感性是有较大差别的。控制辐射的剂量和剂量率，在灭活微生物的同时不影响卵黄抗体的效价和理化性质是关键。本发明采用bpl联合使用60coγ射线灭活鸭坦布苏病毒中的外源病毒，来获得更安全、有效、稳定的产品。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺。本发明所采取的技术方案是：鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺，是利用β-丙内酯加入到脱脂卵黄抗体中，混合作用，再以60coγ射线进行照射，灭活卵黄中的病毒。优选的，脱脂卵黄抗体的制备方法为：按照卵黄与酸化水为1：(4-8)的体积比加入酸化水并降温至2-8℃，搅拌均匀，2-8℃静置4-6小时，酸化完成后，加入终浓度为0.2％正辛酸，搅拌并在室温放置3-5小时，分离上清液，取上清液即为脱脂卵黄抗体。优选的，脱脂卵黄抗体的制备方法为：按照卵黄与酸化水为1：6的体积比加入酸化水并降温至2-8℃，搅拌均匀，2-8℃静置5小时，酸化完成后，加入终浓度为0.2％正辛酸，搅拌并在室温放置3-5小时，分离上清液，取上清液即为脱脂卵黄抗体。优选的，.酸化水为纯化水利用盐酸调节ph为4.0-5.0得到的。优选的，酸化水为纯化水利用盐酸调节ph为4.5得到的。优选的，加入终浓度为0.02％-0.06％的β-丙内酯，与脱脂卵黄抗体混合后，在4℃反应24-36小时。优选的，利用37℃反应2小时终止β-丙内酯的灭活后，再以60coγ射线进行照射。优选的，60coγ射线所用的剂量为2.5-6.5kgy，剂量率为12-15gy/min。在辐射损伤的整个发展过程中，吸收剂量相同时，吸收剂量率高，所需照射时间就短，在单位时间内病毒或细菌的核酸分子被破坏的几率增高，且在较短时间内又不利于病毒或细菌本身修复，因此灭活效果好。本发明的有益效果是：本发明采用β-丙内酯联合使用60coγ射线灭活鸭坦布苏病毒中的外源病毒，来获得更安全、有效、稳定的产品。其中β-丙内酯的使用量最低只需0.02％即可，加上剂量为3.0kgy的60coγ射线，经过充分的灭活反应，所获得的产品经过盲传三代，仍然安全可靠。本发明方法安全，因为β-丙内酯极易水解，水解后形成人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸，对人体无害；60coγ射线不会残留，经过60coγ射线照射后的抗体稳定无菌。本发明方法简单、易于操作：操作相对比较简便，没有复杂的程序。本发明的灭活方法不影响效价：β-丙内酯、60coγ射线灭活都不直接作用于病毒蛋白，不影响抗体效价，对抗体的治疗效果没影响。具体实施方式l、材料1.1灭活剂β-丙内酯：(β-propionolactone，bpl)，深圳迈瑞尔化学技术有限公司进口分装，cas号69-65-7。1.2钴源华南农业大学生物技术开发公司。1.3正辛酸，广东中鹏化工有限公司，批号：520168。1.4指示病毒：鸭坦布苏病毒0.25ml。剂型：冻干毒。广东农科院。1.5spf鸡胚：10日龄鸡胚购自广东永顺生物制药有限公司。2、方法1)脱脂卵黄的制备：采集鸭坦布苏灭活疫苗免疫后高免蛋，经检验消毒后，采取手工或机械方式分离蛋清和卵黄。将鸡蛋用清水洗去污物，再放入含0.5％新洁尔灭溶液浸泡20min，然后晾干。用75％酒精棉擦拭蛋壳，无菌操作打开蛋壳，将蛋清和蛋黄分开，把蛋黄放于灭菌烧杯中，按照卵黄与酸化水1：6体积加入酸化水(用1mol/l盐酸调ph值至4.5)并降温至2-8℃，搅拌均匀，2-8℃静置5小时，酸化完成后，加入适量正辛酸溶液，所添加的辛酸终浓度为体积百分比m，其中0<m≤1％；搅拌并在室温(15-25℃)放置3-5小时，分离上清液，取上清液即为脱脂卵黄抗体。2)β-丙内酯灭活：将β-丙内酯加入上述制备的脱脂卵黄抗体，β-丙内酯添加的终浓度为0.01％-0.06％。震荡30min，置4℃，作用20-36小时，然后在37℃水浴中水解2h。3)60coγ射线照射将第2)步所得卵黄抗体60coγ射线进行照射灭活病毒和杀灭细菌，60coγ射线所用的剂量为2.5-6.5kgy，剂量率为12-15gy/min。4)灭活结果的检验。下面利用实施例进一步阐述本发明，但不限于此。β-丙内酯灭活鸭坦布苏病毒试验中：在卵黄抗体中加入指示病毒nd，使病毒终浓度为106eid50/0.1ml。随后分为三组，每组300ml，加入适量的β-丙内酯，边加边摇，使其充分混合。根据所加入β-丙内酯终浓度不同分别得到实施例1-6。然后将胚液倒于另一灭菌容器中。置4℃下进行灭活反应20-36小时，每小时振摇1次。于20小时、24小时、30小时、36小时分别取样，于37℃水浴中水解2h。实施例1-6的β-丙内酯终浓度分别为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％。进一步以60coγ射线进行照射，60coγ射线所用的剂量为3.0kgy，剂量率为12-15gy/min。然后进行盲传，做灭活检验。ha<4为阴性，即病毒被灭活。对所获产品进行效果检测一、hi效价检测灭活检验：将灭活后的卵黄抗体接种spf鸡胚，0.1m1/枚接种尿囊腔，5枚为一组，盲传三代。分别取脱脂卵黄(未灭活)和灭活36小时+60coγ射线照射后卵黄，检测鸭坦布苏病毒抗体hi效价为例，比较抗体损失情况。结果见表1。表1灭活前后鸭坦布苏病毒抗体hi效价表1结果显示：脱脂卵黄原hi效价为7，分别加入0.01％-0.06％β-丙内酯后，检测hi效价均为7。灭活前后h9n2抗体效价没有损失。二、ha效价/胚体病变检测β-丙内酯联用60coγ射线灭活结果见表2。表2β-丙内酯联用60coγ射线灭活结果注：ha>4为阳性，ha<4为阴性。表2显示β-丙内酯浓度在0.02％-0.06％，20-36h作用后，盲传三代，ha<4。即β-丙内酯浓度在0.02％-0.03％，4℃作用20小时并以3.0kgy的60coγ射线进行照射后可将病毒完全灭活。表2中也反应了β-丙内酯对于病毒的灭活效果与剂量和时间相关，如果仅仅利用β-丙内酯进行灭活，剂量太低达不到灭活的效果，剂量过高会大大破坏卵黄液中的蛋白质，使抗体失去应有的效价。三、蛋白质含量检测以nd为例，测定以不同浓度β-丙内酯，并在3.0kgy的60coγ射线进行照射灭活后卵黄抗体中蛋白质含量。表3蛋白质含量检测结果(g/l)剂量00.01％0.02％0.03％0.04％0.05％0.06％含量平均7.767.697.787.797.717.687.80表3结果表明，卵黄抗体添加0.01％-0.06％浓度β-丙内酯，并在3.0kgy的60coγ射线进行照射后，卵黄液中蛋白质含量无明显变化。四、其他相关检测灭活卵黄抗体液通过严格的无菌检验、支原体检验、安检和攻毒防治试验，表明β-丙内酯加上60coγ射线辐照工艺生产的卵黄液完全符合兽医生物制品的要求。本实验中污染卵黄液nd病毒含量为为106eid50/0.1ml，都己接近复壮毒的滴度，虽然自然污染物中的病毒粒子数是无法得知的，但根据文献推测在自然污染条件下，一般不会超过这个浓度，所以这一试验对一般感染条件下是适用的。对比实验一其他条件同实施例，对比例添加的β-丙内酯终浓度分别为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％，然后将胚液倒于另一灭菌容器中。置4℃下进行灭活反应20-36h，每小时振摇1次。20小时、24小时、30小时、36小时分别取样，于37℃水浴中水解2h。不同之处在于，不进行60coγ射线的照射。进行盲传，做灭活检验。ha<4为阴性，即病毒被灭活。结果见表4。表4β-丙内酯灭活结果表4结果显示，如果不联用60coγ射线灭活处理，在低浓度0.01％的β-丙内酯灭活处理下，盲传三代后，病毒容易恢复毒性，从而β-丙内酯不能起到完全灭活的作用。对比实验二其他同实施例，不同之处在于，去掉β-丙内酯灭活的步骤，仅利用2.0-4.0kgy的60coγ射线的照射进行灭活处理。结果见表5表560coγ灭活结果表5结果显示，如果不联用bpl灭活处理，仅利用2.0-4.0kgy的60coγ灭活处理下，盲传三代后，病毒未能完全灭活。终上所述，从时间和成本方面综合，经过0.02％-0.03％β-丙内酯反应20h，联合3.0kgy的60coγ射线照射可以完全可以将卵黄抗体中的nd病毒降低6个滴度，起到很好的灭活作用。本发明的设计是根据“人用血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则”而进行的，用生物制品的检验标准核心思路在于添加一定的指示病毒，经过灭活处理后，然后进行该几种病毒的毒力检测，以病毒毒力单位降低6个单位为标准，大于等于6且盲传三代不发病则表明该灭活方法有效。本发明经过0.02％-0.03％β-丙内酯联合3.0kgy的60coγ射线照射可以完全将卵黄抗体中的nd病毒降低6个滴度，达到灭活外源性病毒的目的。所用β-丙内酯剂量低，所花费的时间短且节省成本，而且β-丙内酯、60coγ射线不与抗体反应，加入卵黄中，抗体效价不变，不影响抗体效价，对抗体的治疗效果没影响。当前第1页12