一种装载全氟碳的氟化共价有机聚合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及药物领域，尤其涉及一种装载全氟碳的氟化共价有机聚合物及其制备方法和应用。

背景技术

21世纪以来，随着新增癌症病例的不断增多，传统的手术、化疗和放疗等肿瘤治疗手段由于其自身的缺点而难以满足现今临床肿瘤治疗的需要。因此，发展新型安全高效的肿瘤治疗手段得到了广泛而深入的研究。近年来，肿瘤光动力因其创性小、毒副作性低和靶向性高等优点而备受关注。肿瘤光动力治疗的基本原理为：光敏分子在特定波长的激光照射下，将氧气转化为单线态氧单线态氧对细胞造成损伤，并诱导细胞凋亡。

然而，由于不规整的血管结构以及肿瘤细胞新陈代谢快速等问题，会导致肿瘤部位形成乏氧的微环境，从而大大限制了光动力治疗物质的治疗的效果。因此，如何提高聚合物的光动力学治疗效果，是目前需要解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种装载全氟碳的氟化共价有机聚合物及其制备方法和应用，本发明提供的装载全氟碳的氟化共价有机聚合物作为光动力法治疗肿瘤的药物，具有很好的光动力学治疗效果。

本发明提供了一种装载全氟碳的氟化共价有机聚合物，通过将由羧基封端的聚乙二醇、全氟癸二酸和meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉混合反应得到的氟化共价有机聚合物与全氟碳混合得到。

优选的，所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与全氟癸二酸的摩尔比为1∶(1～2)。

优选的，所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与羧基封端的聚乙二醇的摩尔比为1∶(1～4)。

优选的，所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与全氟碳的质量比为1∶(2.5～15)。

优选的，所述羧基封端的聚乙二醇的分子量为5000～6000da。

优选的，所述装载全氟碳的氟化共价有机聚合物的粒径为50～250nm。

本发明还提供了一种装载全氟碳的氟化共价有机聚合物的制备方法，包括：

1)将羧基封端的聚乙二醇、全氟癸二酸和meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉混合反应得到氟化共价有机聚合物；

2)将步骤1)得到的氟化共价有机聚合物与全氟碳混合得到装载全氟碳的氟化共价有机聚合物。

优选的，所述步骤1)反应的催化剂为二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶。

优选的，所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶(1～1.5)；

所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶(1～1.5)。

本发明还提供了一种本发明所述的装载全氟碳的氟化共价有机聚合物在制备光动力治疗与改善肿瘤乏氧情况的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明提供了一种装载全氟碳的氟化共价有机聚合物，通过将由羧基封端的聚乙二醇、全氟癸二酸和meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉混合反应得到的氟化共价有机聚合物与全氟碳混合得到，通过实验发现，本发明提供的装载全氟碳的氟化共价有机聚合物(记为pfc@thpp-pfsea)，在激光照射下，能够通过全氟碳吸附氧气来提高单线态氧的产生；具体的，通过标记放射性元素锝99，尾静脉注射进小鼠体内，并用单光子发射计算机化断层显像技术对在肿瘤部位的富集进行检测，发现其在肿瘤部位有很高的富集；此外，通过免疫荧光染色技术对肿瘤组织的冷冻切片进行观察，该复合物可以有效改善肿瘤部位的乏氧微环境；经过激光照射后，光动力治疗效果在14天内具有显著提高；因此，本发明提供的装载全氟碳的氟化共价有机聚合物不仅可以作为光动力治疗的纳米材料，而且还可以改善肿瘤乏氧微环境，进一步提高光动力治疗效果，从而达到高效的肿瘤光动力治疗。

附图说明

图1为实施例1所述的thpp-pfsea纳米颗粒在水化前后的动态激光粒径分布图；

图2为实施例1所述的thpp-pfsea纳米颗粒在装载全氟碳前后的动态激光粒径分布图；

图3为实施例1所述的thpp-pfsea纳米颗粒与未修饰过的meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉化合物的紫外-可见吸收谱图；

图4为thpp-pfsea纳米颗粒的透射电镜照片图；

图5为实施例1所述的thpp-pfsea纳米颗粒在660nm激光照射下sosg的相对荧光强度图；

图6为实施例1所述的thpp-pfsea和对比例1所述的thpp-sea纳米颗粒在加入全氟碳后的装载量；

图7为thpp-pfsea纳米颗粒与pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在660nm激光照射下与小鼠乳腺癌细胞(4t1细胞)共同孵育的细胞存活率图；

图8为标记有放射性锝元素的pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠体内的单光子发射计算机断层成像图(spect)；

图9为pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠主要器官中的生物分布情况；

图10为pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠尾静脉注射24小时内，血液循环的数据；

图11为pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠尾静脉注射后进行光动力治疗的肿瘤相对生长情况。

具体实施方式

本发明提供了一种装载全氟碳的氟化共价有机聚合物，通过将由羧基封端的聚乙二醇、全氟癸二酸和meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉混合反应得到的氟化共价有机聚合物与全氟碳混合得到。其中，所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与全氟癸二酸的摩尔比优选为1∶(1～2)，更优选为1∶1.5；所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与羧基封端的聚乙二醇的摩尔比为1∶(1～4)，更优选为1∶(2～3)；所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与全氟碳的质量比为1∶(2.5～15)，更优选为1∶(4～10)；所述全氟碳优选为全氟-15冠-5醚；本发明对各个原料的来源没有特殊要求，直接购买即可；其中，所述羧基封端的聚乙二醇的分子量优选为5000～6000da；所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉的结构式如式(i)所示；

本发明中，所述装载全氟碳的氟化共价有机聚合物的粒径优选为50～250nm，更优选为80～100nm。

本发明还提供了一种装载全氟碳的氟化共价有机聚合物的制备方法，包括：

1)将羧基封端的聚乙二醇、全氟癸二酸和meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉混合反应得到氟化共价有机聚合物；

2)将步骤1)得到的氟化共价有机聚合物与全氟碳混合得到装载全氟碳的氟化共价有机聚合物。

按照本发明，本发明将羧基封端的聚乙二醇、全氟癸二酸和meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉混合反应得到氟化共价有机聚合物；其中，所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与全氟癸二酸的摩尔比优选为1∶(1～2)，更优选为1∶1.5；所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与羧基封端的聚乙二醇的摩尔比为1∶(1～4)，更优选为1∶(2～3)；所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与全氟碳的质量比为1∶(2.5～15)，更优选为1∶(4～10)；本发明对各个原料的来源没有特殊要求，直接购买即可；其中，所述全氟碳优选为全氟-15冠-5醚；所述羧基封端的聚乙二醇的分子量优选为5000～6000da；所述混合反应的催化剂优选为二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶；所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉与二环己基碳二亚胺的摩尔比优选为1∶(1～1.5)，更优选为1∶1；所述meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉4-二甲氨基吡啶的摩尔比优选为1∶(1～1.5)，更优选为1∶1。

具体的，为了使反应能够更好的进行，本发明优选首先将meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉，全氟癸二酸溶于超干溶剂四氢呋喃中，再加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶作为催化剂，45摄氏度油浴反应24h后，再加入羧基封端的聚乙二醇反应24h，得到氟化共价有机聚合物。

按照本发明，本发明还将步骤1)得到的聚合物与全氟碳混合得到装载全氟碳的氟化共价有机聚合物。具体的，本发明优选将氟化共价有机聚合物溶于水中，再加入全氟碳，超声混合，得到装载全氟碳的氟化共价有机聚合物。

本发明提供了一种装载全氟碳的氟化共价有机聚合物，通过将由羧基封端的聚乙二醇、全氟癸二酸和meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉混合反应得到的氟化共价有机聚合物与全氟碳混合得到，实验结果表明，本发明提供的装载全氟碳的氟化共价有机聚合物(记为pfc@thpp-pfsea)，通过标记放射性元素锝99，尾静脉注射进小鼠体内，并用单光子发射计算机化断层显像技术对在肿瘤部位的富集进行检测，发现其在肿瘤有很高的富集；此外，通过免疫荧光染色技术对肿瘤组织的冷冻切片进行观察，该复合物可以有效改善肿瘤部位的乏氧微环境；经过激光照射后，光动力治疗效果在14天内具有显著提高；因此，本发明提供的装载全氟碳的氟化共价有机聚合物不仅可以作为光动力治疗的纳米材料，而且还可以改善肿瘤乏氧微环境，进一步提高光动力治疗效果，从而达到高效的肿瘤光动力治疗。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、装载全氟碳的氟化共价有机聚合物(pfc@thpp-pfsea)的制备

将meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉(0.04mmol)(thpp)与全氟癸二酸(0.06mmol)溶于50ml超干四氢呋喃溶液中，然后加入二环己基碳二亚胺(0.8mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.8mmol)，油浴加热至45摄氏度，避光反应24小时。再向反应体系中投入羧基封端的聚乙二醇(0.16mmol)，在45℃条件下反应24小时后，终止反应。为了纯化产物中游离的meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉和pfsea小分子，通过旋转蒸发仪将反应溶剂四氢呋喃除去，加入少量甲醇溶解反应产物并用大量冰乙醚进行沉淀，5000rpm离心5分钟后倒去上清，重复这一步骤至上清无色。将反应体系用超纯水在室温条件下透析24小时，将透析袋中的液体经过4000转离心后取上清液，经冻干成粉末后置于4℃冰箱避光保存，即为氟化共价有机聚合物(缩写为thpp-pfsea)。为了装载全氟碳，将1mg上述复合物溶于1ml超纯水中，加入5μl全氟碳(全氟-15冠-5醚)后水浴超声10分钟，3000rpm离心2分钟除去不稳定大颗粒，得到装载全氟碳的氟化共价有机聚合物(pfc@thpp-pfsea)。

对比例1

将meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉(0.04mmol)(thpp)与癸二酸(sea)(0.06mmol)溶于50ml超干四氢呋喃溶液中，然后加入二环己基碳二亚胺(0.8mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.8mmol)，油浴加热至45摄氏度，避光反应24小时。再向反应体系中投入羧基封端的聚乙二醇(0.16mmol)，在45℃条件下反应24小时后，终止反应。为了纯化产物中游离的meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉和sea小分子，通过旋转蒸发仪将反应溶剂四氢呋喃除去，加入少量甲醇溶解反应产物并用大量冰乙醚进行沉淀，5000rpm离心5分钟后倒去上清，重复这一步骤至上清无色。将反应体系用超纯水在室温条件下透析24小时，将透析袋中的液体经过4000转离心后取上清液，经冻干成粉末后置于4℃冰箱避光保存，即为有机聚合物(缩写为thpp-sea)。为了检验是否能够装载全氟碳，将1mg上述复合物溶于1ml超纯水中，分别加入不同体积的全氟碳(全氟-15冠-5醚)后水浴超声10分钟，3000rpm离心2分钟除去不稳定大颗粒，得到装载全氟碳的共价有机聚合物(pfc@thpp-sea)。

实施例2

对实施例1得到的氟化共价有机聚合物进行表征(包括：紫外-可见吸收光谱、动态光散射、透射电镜、单线态氧产生能力)，结果见图1～图5；

图1为实施例1所述的thpp-pfsea纳米颗粒在水化前后的动态激光粒径分布图。从图中可以看出材料在水化前后的粒径并没有发生很大的变化，表明该复合物可以经冻干后制备成粉末产物，便于长期的储存和运输。

图2为实施例1所述的thpp-pfsea纳米颗粒在装载全氟碳前后的动态激光粒径分布图。从图中可见，thpp-pfsea所形成的纳米颗粒直径约为80nm，在装载全氟碳之后，粒径保持稳定。

图3为实施例1所述的thpp-pfsea纳米颗粒与未修饰过的meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉化合物的紫外-可见吸收谱图。thpp-pfsea纳米颗粒与未修饰过的meso-5-10-15-20-四(4-羟基苯基)卟啉化合物的特征吸收峰重叠，表明了材料的成功制备。

图4为thpp-pfsea纳米颗粒的透射电镜照片图。从图片中可以看出，thpp-pfsea纳米颗粒的尺寸均一，并且呈球状外貌。

图5为实施例1所述的thpp-pfsea纳米颗粒在660nm激光照射下sosg的相对荧光强度图。与水相比，所制备的thpp-pfsea纳米颗粒具有良好的产生单线态氧的能力。而在装载全氟碳之后，pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在660nm激光照射下的单线态氧产生能力得到了加强，进一步验证了全氟碳增强光动力治疗的可能。

对实施例1和对比例1得到的聚合物装载全氟碳，结果见图6，图6为实施例1所述的thpp-pfsea和thpp-sea纳米颗粒在加入全氟碳后的装载量。通过气相色谱仪的测试，所制备的thpp-pfsea装载全氟碳的量随投料增加而增加，其全氟碳装载饱和值在5μl/mgthpp。作为对比，加癸二酸的共价有机聚合物thpp-sea几乎没有装载全氟碳的能力。

实施例3、thpp-pfsea纳米颗粒在细胞水平的光动力治疗实验

为了研究thpp-pfsea纳米颗粒对细胞的杀伤性，thpp-pfsea纳米颗粒和pfc@thpp-pfsea纳米颗粒与小鼠乳腺癌细胞(4t1细胞)共同孵育4小时后经过660nm激光照射30分钟，结果见图7，图7为thpp-pfsea纳米颗粒与pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在660nm激光照射下与小鼠乳腺癌细胞(4t1细胞)共同孵育的细胞存活率图；从图7可以看出，在图7中thpp-pfsea显示了一定的细胞毒性。结果表明，随着卟啉浓度的增加，细胞光动力治疗效果不断增强，且全氟碳的装载对肿瘤细胞的毒性略有增加。

实施例4、标记有放射性锝元素的pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠体内分布的实时成像以及在各器官中的分布情况和血液循环实验

由于卟啉环的共轭环状结构可与放射性元素锝进行螯合，因此可用于thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠体内的分布以及血液循环的追踪。结果见图8，图8为标记有放射性锝元素的pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠体内的单光子发射计算机断层成像图(spect)，在图8中，利用放射性pfc@thpp-pfsea纳米颗粒通过小鼠尾静脉注射，采用单光子发射计算机断层成像术(spect)进行体内成像，可以观察到pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在肿瘤部位的富集随时间的推移而增加。将小鼠肝脾肾心肺等器官取出后测试其锝元素的放射信号值，结果见图9，图9为pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠主要器官中的生物分布情况；从图9可以看出pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠主要器官中的分布较好，肿瘤部位的信号值较高。通过在不同时间点对小鼠进行眼眶取血，并且测量该时间点血液中锝元素的放射信号，结果见图10，图10为pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠尾静脉注射24小时内，血液循环的数据；从图10可以看出pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠尾静脉注射24小时后，血液内存在的浓度依旧有8％左右，表明该纳米颗粒具有相对较长的血液循环时间。

实施例5、thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠活体水平的光动力治疗实验

为了在活体水平进行光动力治疗，将4t1肿瘤荷瘤小鼠分为四组，其中包括：第一组，对照组(仅注射生理盐水)；第二组，注射pfc@thpp-pfsea纳米颗粒(不照光)；第三组，注射thpp-pfsea纳米颗粒24小时后进行光动力治疗；第四组；注射pfc@thpp-pfsea纳米颗粒24小时后进行光动力治疗。对小鼠进行相应的治疗后，测量其肿瘤的生长，结果见图11，图11为pfc@thpp-pfsea纳米颗粒在小鼠尾静脉注射后进行光动力治疗的肿瘤相对生长情况。根据肿瘤的相对生长情况，与对照组相比，第二组未被激光照射的小鼠未见明显治疗效果，第三、四组的肿瘤得到了抑制，并且在第四组中的肿瘤生长抑制效果最佳。表明pfc@thpp-pfsea纳米颗粒可以实现对肿瘤光动力治疗效果的显著提高。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。