一种单宁酸/Fe3+纳米颗粒体系、药物递送方法与流程

本发明涉及一种生物医药技术领域，具体涉及一种纳米颗粒体系以及基于该纳米颗粒体系的药物递送方法。

背景技术：

二型糖尿病(t2d)病例占所有糖尿病病例的90％，这种病在世界范围内造成了沉重的公共卫生负担。胰高血糖素样肽-1(glp-1)是t2d治疗中最有效的药物之一，但是其能被蛋白水解酶二肽基肽酶-4(ddp-4)快速清除，故在血液中的半衰期较短(小于2分钟)，因此在临床应用中面临重大挑战。近年来，人们一直在努力制备glp-1的类似物来提高其在体内的循环时间。约翰等人在毒蜥的唾液中分离一种由39个氨基酸组成的glp-1类似物艾塞那肽(exendin-4)，半衰期是glp-1的20-30倍，序列同源性高达53％，同时具有很多相似的血糖调节作用，包括促进葡萄糖依赖性促胰岛素分泌、抑制葡萄糖依赖性的不合理的胰高血糖素分泌、延迟胃排空、减少食物的摄入量。此外，exendin-4已经被证明在体外和体内均可以促进β-cell的增殖和胰岛新生，但是由于其血清稳定性差，需要每天注射两次，导致患者顺应性差。

目前已经有多种方法来提高exendin-4治疗的持久性和有效性。聚乙二醇化、偶联白蛋白等化学修饰可增加其血清稳定性和循环时间，但这些化学结构修饰可能降低药物的生物活性。另一种方式是利用生物材料，如聚乳酸-共-乙醇酸(plga)微球负载exendin-4，从而实现药物的缓释。但由于粒径分布较宽，胶体稳定性较差，药物负载量较低(～5％)，导致释放曲线不理想。同时以上这些策略均存在加工费力、产量低、重现性差等诸多问题，最终阻碍其临床转化。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种粒径均匀、胶体稳定性好的纳米颗粒体系以及基于该纳米颗粒体系的药物递送方法。

本发明的第一个目的是提供一种纳米颗粒。

本发明的第二个目的是提供一种药物递送方法。

本发明的第三个目的是提供一种连续地生成粒径均匀纳米颗粒的快速络合方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案给予实现：

一种纳米颗粒，包括单宁酸、水溶性三价金属离子和药剂，所述药剂是包含水溶性蛋白质、水溶性肽或其组合的药剂，所述单宁酸与水溶性三价金属离子的质量比为10-100、15-95、20-90、25-85、30-80、35-75或40-70。

优选地，所述水溶性三价金属离子选自fe(iii)、al(iii)或其组合。

最优选地，所述水溶性三价金属离子是fe(iii)。

优选地，所述肽包含5-150、5-100或5-50个氨基酸残基。

最优选地，所述肽是艾塞那肽。

优选地，所述水溶性蛋白分子量大小包含5-200、5-150或5-100kda。

优选地，所述水溶性肽或所述水溶性蛋白质选自抗体、抗体片段、激素、激素受体、受体配体、细胞因子、生长因子或其组合。

在一些实施方案中，所述纳米颗粒包括30-60或40-50％(w/w)的单宁酸、0.1-20、1-15或2-10％(w/w)的水溶性三价金属离子和1-50、5-45、10-40或15-35％(w/w)的药剂。

在一些实施方案中，所述纳米颗粒包括65.6％(w/w)的单宁酸、32.8％(w/w)的艾塞那肽和1.6％(w/w)的fe(iii)。

在一些实施方案中，所述纳米颗粒包括79.2％(w/w)的单宁酸，19.8％(w/w)的艾塞那肽和1.0％(w/w)的fe(iii)。

基于上述纳米颗粒，本发明提供了一种药物递送方法，包括以下步骤：提供纳米颗粒；将纳米颗粒施用给受试者；纳米颗粒粘附到受试者的细胞上；和药剂递送到细胞中。

优选地，所述纳米颗粒通过口服递送、静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或其组合施用。

为了连续地生成粒径均匀的单宁酸/(肽或蛋白质)/三价金属离子纳米颗粒，本发明还提供了一种快速纳米络合(fnc)方法，包括：

(a)将包含单宁酸的第一流体以第一可变流速流入封闭室中，所述单宁酸溶解于水中，浓度为0.2-40、1.0-30或2.0-30mg/ml；

(b)将包含一种或多种的水溶性肽或水溶性蛋白质的第二流体以第二可变流速流入所述封闭室中，所述水溶性肽或水溶性蛋白质的浓度为0.1-20、1.0-15或1.5-10mg/ml；

(c)将包含一种或多种水溶性三价金属离子的第三流体以第三可变流速流入所述封闭室中，所述水溶性三价金属离子的浓度为0.005-1、0.05-0.9或0.5-0.8mg/ml；

(d)使所述第一流体、第二流体和第三流体在所述封闭室内充分混合，从而使得所述单宁酸、所述一种或多种水溶性三价金属离子和所述一种或多种水溶性肽或水溶性蛋白质经历连续地生成单宁酸/(肽或蛋白质)/三价金属离子三元纳米颗粒的络合过程。

优选地，所述封闭室是一个三入口限定撞击射流混合装置。

优选地，第一、第二和第三可变流速各自为0.5-100、1.0-90、5.0-80、10-70或20-70ml/min。

优选地，所述一种或多种水溶性三价金属离子选自fe(iii)、al(iii)或其组合。

优选地，所述单宁酸浓度为0.5-10、1-9、2-8、3-7或4-6mg/ml，第一流体的ph为3.0-7.0或4.0-6.0。

优选地，所述水溶性肽或水溶性蛋白质的浓度为0.5-5、1-4或2-3mg/ml，第二流体的ph为5.5-8.0或6.5-7.5。

优选地，所述水溶性三价金属离子浓度为0.005-0.5、0.05-0.4、0.5-0.3或0.1-0.2mg/ml，第三流体的ph为1.0-4.0或2.0-3.0。

优选地，所述单宁酸/(肽或蛋白质)/三价金属离子纳米颗粒的直径为20nm至500nm。

优选地，所述单宁酸/(肽或蛋白质)/三价金属离子纳米颗粒的多分散指数为0.02-0.4或0.05-0.2。

尽管本文中采用了特定术语，但它们仅用于一般的和描述性的意义，而非用于限制的目的。除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

下列参考资料为本领域普通技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology，第2版，singleton等，1994；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology，walker，1988；theglossaryofgenetics，第5版，r.rieger等，springerverlag，1991；theharpercollinsdictionaryofbiology，hale&marham,1991。如本文中所用，除非另有所指，否则下列术语在下文中具有归于它们的含义。

术语“活性”是指药剂在被本发明的单宁酸/fe(iii)纳米颗粒转运后发挥其功能的能力。

如在本文中使用的，术语“抗体”指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且包括包含抗原结合位点的任何多肽，无论它是在体外还是在体内产生的。该术语包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体和移植抗体。

除非另外用术语“完整(intact)”修饰(如“完整抗体(intactantibodies)”)，出于本发明公开内容的目的，术语“抗体”还包括抗体片段，诸如fab、f(ab＇)2、fv、scfv、fd、dab和保留抗原结合功能(即，特异性结合例如pd-l1的能力)的其它抗体片段。通常，此类片段将包括抗原结合结构域。

术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”指包括负责抗体和抗原之间的特异性结合的氨基酸的抗体分子的部分。在实例中，在抗原大的情况下，抗原结合结构域可以仅结合该抗原的一部分。负责与抗原结合结构域的特异性相互作用的抗原分子的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域通常包括抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，然而，它不一定必须包括二者。例如，所谓的fd抗体片段仅由vh结构域组成，但仍保留完整抗体的一些抗原结合功能。

抗体的结合片段通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促裂解或化学裂解产生。结合片段包括fab、fab”、f(ab”)2、fv和单链抗体。除“双特异性”或“双功能”抗体以外的抗体被理解为具有其结合位点的每一个都相同。用酶木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(也被称为“fab”片段)和一个“fc”片段(不具有抗原结合活性但具有结晶能力)。用酶胃蛋白酶消化抗体产生f(ab”)2片段，其中抗体分子的两个臂保持连接且包括两个抗原结合位点。f(ab”)2片段具有交联抗原的能力。当在本文中使用时，“fv”指保留抗原识别和抗原结合位点二者的抗体的最小片段。当在本文中使用时，“fab”指包括轻链的恒定结构域和重链的chi结构域的抗体的片段。

“剂(agent)”意指任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。

“改善(ameliorate)”意指降低(decrease)、抑制、减弱(attenuate)或减少(diminish)疾病的发展或进展或使疾病的发展或进展停止(arrest)或稳定。

“类似物(analog)”意指不相同但具有相似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留对应的天然存在的多肽的生物学活性，同时具有相对于天然存在的多肽增强类似物的功能的某些生物化学修饰。此类生物化学修饰可以增强类似物的蛋白酶耐受性、膜通透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可以包括非天然氨基酸。

“疾病”意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况或紊乱。疾病的实例包括胰腺癌。

“有效量”意指相对于未治疗的患者改善疾病的症状所需的量。用于实践本发明进行疾病的治疗性处理的活性化合物的有效量根据施用方式、受试者的年龄、体重和总体健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。这样的量被称为“有效”量。

“肽激动剂”意指胰高血糖素样肽(glp)受体激动剂。

“胰高血糖素样肽(glp)受体激动剂”意指促进胰岛素分泌的肽，如艾塞那肽(hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappps),利拉鲁肽(haegtftsdvssylegqaakefiawlvrgrg),利西拉来(hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappskkkkkk)。

“纳米颗粒”是指尺寸在10-1000、10-500、10-200或10-100nm范围内的颗粒。

术语“mab”指单克隆抗体。本发明的抗体包括但不限于完全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab、fab”、单链v区片段(scfv)、融合多肽和非常规抗体。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。术语适用于其中一个或更多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。多肽可以被修饰，例如通过添加糖残基以形成糖蛋白。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”包括糖蛋白以及非-糖蛋白。

术语“参照”指的是一项标准或控制条件，例如一个样本(人类细胞)，不含或实质上不包含药剂或本发明涉及的纳米颗粒包含的药剂的受试者。

如本文所用，术语“受试者”意指进行本文所述方法的任何个体或患者。通常，受试者是人，但是如本领域技术人员所理解的，受试者可以是动物。因此，其它动物，包括啮齿类动物(包括老鼠，大鼠，仓鼠和豚鼠)，猫，狗，兔子，包括牛，马，山羊，绵羊，猪等在内的农场动物，以及灵长类动物(包括猴子，黑猩猩，猩猩和大猩猩)，均包括在主题的定义内。

本文提供的范围被理解为该范围内的所有值的简写方式。例如，1至50的范围被理解为包括来自包括以下的组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如本文中使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等指减少或改善紊乱和/或与其相关的症状。将理解，尽管不排除，治疗紊乱或状况不要求紊乱、状况或与其相关的症状被完全消除。

除非特别声明或从上下文明显地，如本文中使用的，术语“或”被理解为包含性的。除非特别声明或从上下文明显地，如本文中使用的，术语“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”被理解为单数或复数。

除非特别声明或从上下文明显地，如本文中使用的，术语“约”被理解为本领域的正态公差(normaltolerance)的范围内，例如在平均值的2个标准差以内。约可以被理解为所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。除非另外从上下文清楚，本文中提供的所有数值都被术语约修饰。

本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其它组合物和方法的一种或更多种组合。

如本文所用的，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防性治疗(prophylactictreatment)”等是指减少受试者发展紊乱或状况的可能性，所述受试者不具有紊乱或状况，但处于发展紊乱或状况的风险或易于发展紊乱或状况。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其它的附图。

图1.fnc制备ta/exendin-4/fe³⁺纳米颗粒和交联结构的示意图，以及由于交联的解离导致ph依赖性有效负载释放的示意图。

图2a-2c.ta/exendin-4/fe³⁺复合物的纳米颗粒组装。(a)fnc的流体流速对np-4制剂的纳米颗粒尺寸分布的影响。曲线(实心圆圈)和条形代表来自三种不同制剂的测量值的平均值±s.d.(n＝3)；(b)以0.5或20ml/min的流速制备的负载exendin-4的np-4的tem图像(1)圆圈中纳米颗粒的放大视图；(2)聚集体的放大视图；(c)ta，exendin-4，fecl3，ta/fe³⁺复合物，ta/exendin-4复合物和ta/exendin-4/fe³⁺纳米颗粒的ftir光谱。

图3a-3d.exendin-4负载纳米颗粒的表征。(a)fnc制备中ta浓度对exendin-4的纳米颗粒尺寸和包封效率的影响；(b)fnc中不同ta浓度制备的负载exendin-4的纳米颗粒的平均尺寸反映的胶体稳定性；(c)在di水(ph5.0)和10mmpbs(ph7.4)中通过不同ta浓度制备的纳米颗粒的exendin-4的体外释放曲线；(d)来自不同浓度(10，20和30mm)的pbs(ph7.4)中np-4的exendin-4的体外释放曲线。所有数据均显示为平均值±s.d.(n＝4)。

图4a-4c.balb/c小鼠腹腔注射后纳米颗粒中的exendin-4的持续释放。(a)在不同时间点腹腔注射cy7.5标记的游离exendin-4(剂量＝500μg/kg)和负载exendin-4的纳米颗粒(剂量＝500μg/kg)的单剂量后，小鼠体内的荧光成像；(b)由ivis图像给出的cy7.5标记的游离exendin-4和exendin-4负载的纳米颗粒在腹腔中的荧光强度半定量结果(平均值±s.d.)(n＝3)；(c)从不同时间点给予cy7.5-标记的游离exendin-4或纳米颗粒的小鼠中收集的血液样品的荧光成像。

图5a-5g.负载exendin-4的纳米颗粒在db/db小鼠(t2d模型)中的体内药效。(a)单次腹腔注射游离exendin-4(3mg/kg)和exendin-4负载的np-4(3或6mg/kgexendin-4)后db/db小鼠的血糖水平变化。对照组是pbs处理的db/dbt2d模型小鼠和db/m健康小鼠；(b)血糖水平在0至204小时的时间中的曲线下面积定量结果(auc)。当与游离exendin-4组比较时，***p<0.001。与np-4(3mg/kg)组比较时，^###p<0.001；(c)治疗后的8天监测中不同组的小鼠的体重变化；(d)单次腹腔注射游离exendin-4和np-4后db/db小鼠的口服葡萄糖耐量试验(ogtt)。葡萄糖是在治疗1小时后通过口服强饲法给予；(e)响应ogtt的血糖水平随时间的auc。与pbs对照比较时^△△△p<0.001；(f)用游离exendin-4或np-4治疗后在血液中检测到的exendin-4浓度随时间的变化；(g)两个治疗组的血液exendin-4浓度随时间的auc。当与游离exendin-4组比较时，^***p<0.001。数据显示为平均值±s.d.(n＝5)。

图6a-6c.t2d小鼠通过负载exendin-4的纳米颗粒治疗后的病理改善。(a)通过h&e染色对治疗后第9天收集的组织样品所评估的游离exendin-4或np-4(3mg/kg)剂量时主要器官的组织形态；比例尺＝100μm。(b)治疗后第9天收集的血清样品中碱性磷酸酶(alp)，天冬氨酸转氨酶(ast)，丙氨酸氨基转移酶(alt)，γ-谷氨酰转肽酶(γ-gt)的酶活性；(c)治疗后第9天收集的血清样品中的血尿素氮(bun)和肌酸酐(cr)的水平。数据显示为平均值±s.d.(n＝5)。

图7a-7c.空白单宁酸/extendin-4复合物的表征。(a)制备后立即对单宁酸/extendin-4复合物进行动态光散射(dls)的分析；(b)制备后15分钟的单宁酸/extendin-4复合物的dls分析；(c)制备后30分钟单宁酸/extendin-4复合物沉淀的图像(1)和离心后单宁酸/extendin-4复合物沉淀的图像(2)。

图8a-8b.(a)ta/al³⁺配合物和ta/zn²⁺配合物tyndall散射的图像；(b)ta/exendin-4/zn²⁺复合物的dls分析。

图9.在25ml/min的流速下np-4的纳米颗粒尺寸分布。

图10.cy7.5标记的exendin-4纳米颗粒的粒度分布，ta浓度为3mg/ml(ph5.0)，exendin-4浓度为1mg/ml(ph7.4)，fe3+浓度为0.05mg/ml(ph2.0)，fnc流速为20ml/min。

图11.具有不同exendin-4剂量的np-4的细胞活力结果(mtt测定)。数据显示为平均值±s.d.(n＝6)。

图12.腹腔注射游离exendin-4、np-4或np-5的单剂量后db/db小鼠的血糖水平(bgl)，所有的剂量均以3mg/kgexendin-4剂量水平给予。用于比较的对照组包括pbs处理的db/dbt2d模型小鼠、np-4(3mg/kg)治疗和db/m健康小鼠。数据显示为平均值±s.d.(n＝5)。

具体实施方式

药物应用

本发明涉及用于将药剂递送至受试者以治疗或预防疾病的方法和/或组合物。在某些情况下，患有心血管疾病、癌症或糖尿病的个体可以包括一种或多种药剂的本发明的纳米颗粒治疗。可以通过本发明的纳米颗粒递送的合适的药剂包括蛋白质，肽，核酸，包含抗体的化合物，rna，dna和小化学实体。公知的可以通过本发明的纳米颗粒递送的药剂包括exendin-4、利拉鲁肽、胰岛素、利西拉来、阿巴帕肽或其组合。

在一些实施例中，增加或减少一种或多种蛋白质的表达或活性的药剂可以通过本发明的纳米颗粒递送。提供的这些纳米颗粒的量和持续时间足以改善特定疾病的至少一种症状。至少在某些情况下，与标准的表达水平相比，表达水平可以增加(或降低，取决于施用于受试者的药剂)至少2，3，4，5，10，25，50，100，1000或更多倍的表达。

药物制剂

本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种本发明的纳米颗粒，本发明包括溶解或分散在药学上可接受的载体中的药剂。所述短语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物适当地施用于动物(例如人)时不产生不利、过敏或其它不良反应。包含至少一种另外的活性成分或药剂的本发明的纳米颗粒的药物组合物的制备对于本领域技术人员而言是公知的，如(remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，lippincottwilliams和wilkins编辑，2005)，在此引入作为参考。此外，对于动物(例如人)给药，应理解为药物上的制备应满足fda生物标准办公室要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。如本文所用，如本领域普通技术人员所知(参见，例如，remington'spharmaceuticalsciences，第18版，mackprintingcompany，第1289-1329页，1990，在此引入作为参考)，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等类似物质及其组合。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑它们在药物组合物中的应用。

包括药剂的本发明的纳米颗粒可以包含不同类型的载体，这取决于它是以固体、液体还是气溶胶形式给药，以及对于注射这样的给药它的注射途径是否需要是无菌的。本组合物可以静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、粘膜、口服、局部、通过吸入(例如气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部灌注靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏中，在脂质组合物(例如脂质体)中，或通过其它方法或前述的任何组合来进行给药，上述技术在本领域技术人员属于公知(remington'spharmaceuticalsciences，第18版，mackprintingcompany编，1990年，其通过引用并入本文)。

作为本发明的纳米颗粒的一部分的药剂可以配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的，或与无机酸如盐酸、磷酸形成的，或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁；或者衍生自有机碱如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因。在配制时，溶液将以与剂量配方相容的方式并以治疗有效量施用。制剂易于以多种剂型给药，例如，配制用于肠胃外的给药如可注射溶液、或用于递送至肺部的气溶胶，或配制用于营养给药如药物释放胶囊等。

进一步地，根据本发明，无论有无惰性稀释剂，包含药剂的本发明的纳米颗粒均可适用于在药学上可接受的载体中给药。载体应是可同化的，包括液体、半固体(例如糊剂)或固体载体。除非任何常规介质，试剂，稀释剂或载体对接受者或其中所含组合物的治疗有效性不利，否则其在可施用组合物中用于实施本发明方法是合适的。载体或稀释剂的实例包括脂肪，油，水，盐溶液，脂质，脂质体，树脂，粘合剂，填充剂等或其组合。组合物还可包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，可以通过防腐剂如各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，所述防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯)，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞或其组合。

根据本发明，包含药剂的本发明的纳米颗粒可以以任何方便实用的方式与载体结合，即通过溶液，悬浮，乳化，混合，包封，吸收等，这些程序对于本领域技术人员来说是常规的。在本发明的一个具体实施方案中，将组合物与半固体或固体载体充分混合或结合。混合可以任何方便的方式进行，例如研磨。还可以在混合过程中加入稳定剂以保护组合物免于治疗活性的丧失，也就是胃中的变性。用于组合物的稳定剂的实例包括缓冲剂，氨基酸如甘氨酸和赖氨酸，碳水化合物如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，果糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖，山梨糖醇，甘露醇等。

包括药剂的本发明的纳米颗粒施用于动物患者的实际剂量可以通过物理和生理因素确定，例如体重、病症的严重程度、所治疗的疾病的类型、先前或同时的治疗干预、患者的原发症和给药途径。根据剂量和给药途径，剂量和/或有效量的给药次数优选可根据受试者的反应而变化。在任何情况下，负责施用的从业者将确定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。

在一些实施例中，包含药剂的本发明的纳米颗粒可包含，例如，至少0.1％的活性化合物。在一些具体实施例中，活性化合物可占单位重量的约2％至约75％，或约25％至约60％，和其中可衍生的任何范围。当然，可以制备每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量，使得在任何给定单位剂量的化合物中获得合适的剂量。制备这种药物制剂的领域的技术人员将考虑诸如溶解度，生物利用度，生物半衰期，给药途径，产品保质期以及其它药理学考虑因素等因素，因此，各种剂量和治疗方案是可预期的。在其它非限制性实例中，剂量还可包含约1微克/千克体重，约5微克/千克体重，约10微克/千克体重，约50微克/千克体重，约100微克/千克体重，约200微克/千克体重，约350微克/千克体重，约500微克/千克体重，约1毫克/千克体重，约5毫克/千克体重，约10毫克/千克体重，约50毫克/千克体重，约100毫克/千克体重，约200毫克/千克体重，约350毫克/千克体重，约500毫克/千克体重，每次给药至约1000微克/千克体重或更多，以及其中可衍生的任何范围。在本文所列数字的可导出范围的非限制性实例中，可以基于上述数量在5毫克/千克体重至100毫克/千克体重、5微克/千克体重至约500毫克/千克体重的范围内给予给药。

消化组合物和配方

在一些实施例中，将包含药剂的本发明的纳米颗粒配制成通过消化途径施用。消化途径包括组合物与消化道直接接触的所有可能的给药途径。具体地，本文公开的药物组合物可以口服，口腔，直肠或舌下给药。因此，包含药剂的本发明的这些纳米颗粒可以用惰性稀释剂或可同化的可食用载体配制，或者它们可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它们可以压制成片剂，或者它们可以直接与饮食中的食物混合。在某些实施例中，活性化合物可与赋形剂混合并以可摄取的片剂，口腔表，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆，糯米纸囊剂等形式使用(mathiowitz等，1997年；hwang等，1998年；美国专利号5,641,515、5,580,579和5,792,451，各自通过引用整体并入本文)。片剂，锭剂，丸剂，胶囊等也可含有下列物质：粘合剂，例如黄蓍胶，阿拉伯树胶，玉米淀粉，明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙，甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉，马铃薯淀粉，海藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖，乳糖，糖精或其组合；调味剂，例如薄荷，冬青油，樱桃调味剂，橙子调味剂等。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以含有液体载体。各种其它材料可以作为包衣存在或以其它方式改变剂量单位的物理形式存在。例如，片剂，丸剂或胶囊可以用虫胶，糖或两者包衣。当剂型是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以含有载体如液体载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以肠溶包衣。肠溶包衣防止ph为酸性的胃或上肠中的组合物变性(参见，例如，美国专利no.5,629,001)。在到达小肠时，其中的碱性ph溶解包衣并允许组合物被特殊细胞释放和吸收，例如上皮细胞和peyer's贴片m细胞。酏剂糖浆可含有作为甜味剂的活性化合物蔗糖，作为防腐剂的甲基和对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味剂，例如樱桃或橙子调味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应该是药学上纯的并且在使用的量下基本上无毒。此外，活性化合物可以掺入缓释制剂和配方中。

对于口服给药，本发明的组合物可以替代地与一种或多种赋形剂混合，所述赋形剂为漱口剂，洁齿剂，口含片剂，口腔喷雾剂或舌下口服给药制剂。例如，可以制备漱口水，将所需量的活性成分掺入适当的溶剂中，例如硼酸钠溶液(dobell溶液)。或者，可将活性成分掺入口服溶液中，例如含有硼酸钠，甘油和碳酸氢钾的溶液，或分散在洁齿剂中，或以治疗有效量加入到可能包含水、粘合剂、研磨剂、调味剂、发泡剂和保湿剂的组合物中。或者，可以将组合物制成片剂或溶液形式，其可以置于舌下或以其它方式溶解在口中。适用于其它消化给药方式的其它制剂包括栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂型，通常是药物，用于插入直肠。插入后，栓剂软化，融化或溶解在腔体液中。通常，栓剂的传统载体可包括例如聚亚烷基二醇，甘油三酯或其组合。在某些实施例中，栓剂可以由含有0.5％至10％，优选1％至2％的活性成分的混合物形成。

肠胃外组合物和配方

进一步地，在一些实施例中，包含药剂的本发明的纳米颗粒可以通过肠胃外途径施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括绕过消化道的途径。具体地，本文公开的药物组合物可以例如但不限于静脉内，皮内，肌肉内，动脉内，鞘内，皮下或腹膜内给药。美国专利号6,7537,514,6,613,308,5,466,468,5,543,158；5,641,515；和5,399,363(各自通过引用整体并入本文)。作为游离碱或药理学上可接受的盐，本发明的纳米颗粒中的活性化合物溶液可以在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备。分散体也可以在甘油，液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利5,466,468，其全部内容通过引用明确地并入本文)。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是流动的，以便易于注射。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止被微生物如细菌和真菌污染。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(即甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)及其混合物，和/或植物油。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层、通过在分散的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，组合物优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

对于在水溶液中的肠胃外给药，如果需要，溶液应该适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内，肌肉内，皮下和腹膜内给药。就此而言，根据本发明内容，可以使用的无菌水介质对于本领域技术人员而言是已知的。例如，可以将一个剂量溶解在等渗nacl溶液中并且添加皮下注射液或者在建议的输注部位注射(参见，“remington'spharmaceuticalsciences”，第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。根据所治疗的受试者的状况，必然会发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责管理的人员将确定个体受试者的适当剂量。此外，对于人类给药，制剂应满足fda生物制品标准办公室要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。

通过将所需量的活性化合物与适当的溶剂和上面列举的各种其它成分(如果需要)混合，然后过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和上面列举的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其它所需成分的粉末。粉末状组合物与液体载体如水或盐溶液混合，可加入或不加入稳定剂。

其它药物组合物和配方

在一些实施例中，包括药剂的本发明的纳米颗粒可以配制用于通过各种途径给药，例如局部(即透皮)给药，粘膜给药(鼻内，阴道等)和/或吸入。用于局部给药的药物组合物可包括用于药物应用的活性化合物，例如软膏、糊剂、乳膏或粉末。软膏包含用于局部施用的所有油脂性、吸附性基、乳液基和水溶性组合物，而乳膏和洗剂是仅包含乳液基的组合物。局部施用的药物可含有通过皮肤吸附以促进活性成分的渗透增强剂。合适的渗透增强剂包括甘油，醇，烷基甲基亚砜，吡咯烷酮和月桂氮卓酮。可能用于局部施用的组合物的基质包括聚乙二醇，羊毛脂，冷霜和凡士林以及任何其它合适的吸附性基质，乳液或水溶性软膏基质。局部制剂还可包括乳化剂，胶凝剂和抗微生物防腐剂，以保存活性成分并提供均匀混合物。本发明的透皮给药还可包括使用“贴片”。例如，贴片可以在固定的时间段内以预定的速率和连续的方式供应一种或多种活性物质。

在一些实施例中，药物组合物可通过滴眼剂，鼻内喷雾剂，吸入剂和/或其它气溶胶递送载体递送。通过鼻气溶胶将组合物直接递送至肺部的方法已在例如美国专利5,756,353和5,804,212(各自通过引用整体并入本文)。同样地，使用鼻内微粒树脂(takenaga等人，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利号5,725,871，通过引用整体并入本文)进行药物递送也是药物领域中众所周知的。同样地，以聚四氟乙烯支撑基质形式的透粘膜药物递送描述于美国专利号5,780,045(通过引用整体并入本文)。术语“气溶胶”是指分散在液化或加压气体推进剂中的细碎固体液体颗粒的胶体系统。本发明用于吸入的典型气溶胶由在液体推进剂或液体推进剂混合物中的活性成分悬浮液和合适溶剂组成。合适的推进剂包括烃和烃醚。合适的容器将根据推进剂的压力要求而变化。气溶胶的给药将根据受试者的年龄，体重以及症状的严重程度和反应而变化。

公开的试剂盒

本文描述的任何组合物可包含在试剂盒中。在非限制性实例中，包含药剂的本发明的纳米颗粒包含在试剂盒中。试剂盒可包含包括药剂的本发明的纳米颗粒，并且在一些情况下，纳米颗粒包含一种或多种另外的试剂。试剂盒的组分可以以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶，试管，烧瓶，瓶子，注射器或其它容器装置，其中可以放置组分，并且优选适当地等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还包含第二，第三或其它另外的容器，其中可以单独放置另外的组分。然而，组分的各种组合可包含在小瓶中。本发明的试剂盒用于商业销售通常还包括用于容纳包括药剂的本发明的纳米颗粒的装置和任何其它试剂容器。这种容器可包括注射或吹塑塑料容器，所需的小瓶保留在其中。当试剂盒的组分提供一种和/或多种液体溶液时，液体溶液是水溶液，特别优选无菌水溶液。可以将包含药剂的本发明的纳米颗粒配制成可注射的组合物。在这种情况下，容器装置本身可以是注射器、移液管和/或其它类似装置，制剂可以从该装置施用于身体的感染区域、注射到动物体内、和/或甚至施用和/或试剂盒的其它组分混合。然而，试剂盒的组分可以以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重悬粉末。设想溶剂也可以在另一容器装置中提供。

以下实施例是向本领域技术人员提供用于实践本发明公开的主题的代表性实施方案的指导。根据本发明公开内容和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员可以理解，以下实施例意图仅是示例性的，且可采用许多变化、修改和改变而不偏离本发明公开的主题的范围。下文的实施例通过说明的方式而不是通过限制的方式被提供。

实施例1

设计了一种单宁酸/exendin-4/fe³⁺三元纳米颗粒体系，其中exendin-4通过氢键和疏水相互作用力与单宁酸结合，通过经典的酚铁络合反应和ta与fe³⁺的配位反应形成稳定的纳米复合物。我们假设，强而多价的ta-蛋白相互作用使其具有高度的络合亲和力和稳定性，并使exendin-4能够由于强的复杂关联而长期缓慢释放。为了有效的统一组装三个组件，我们采用快速纳米络合(fnc)技术混合，我们将exendin-4和fecl3在一个小的冲击射流(cij)微室内进行湍流混合，在几十毫秒内形成纳米粒子。在本研究中，我们证明了ta/exendin-4/fe³⁺三元纳米颗粒的可控组装，并考察了fnc制备参数对纳米颗粒特性和exendin-4释放情况的影响。然后我们使用优化的纳米颗粒配方，评估了这种纳米颗粒在t2d小鼠模型中调节血糖浓度的有效性。

1.1、实验材料

单宁酸和三氯化铁(fecl3)均购自sigmaaldrich。exendin-4(hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappps)购自中国肽业生物制药有限公司。cyanine7.5(cy7.5)nhs酯购自美国lumi-probe。碱性磷酸酶(alp)、天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)、γ-glutamyl转肽酶(γ-gt)、血尿素氮(bun)测定和肌酐(cr)试剂盒购自建成生物技术有限公司(中国)。超滤管购自spectrumlabs(美国)。透析设备购自thermofisherscientific(美国)。nanoorange蛋白定量试剂盒购自美国thermofisherscientific。exendin-4elisa试剂盒购自美国phoenixbiotech。

1.2、fnc平台的建立与exendin-4负载纳米颗粒优化

制备三组工作溶液：(1)ta溶于50mmhepes(ph5.0)中，分别得到浓度为1、1.5、2、3、4mg/ml的5种溶液；(2)exendin-4以1mg/ml的浓度溶解于去离子化(di)水中，10mmnaoh溶液调节ph至7.4；(3)将fecl3以0.5mg/ml的浓度溶于浓盐酸溶液并稀释至0.05mg/ml，避免水解，最后将溶液ph调整至2.0。将ta、exendin-4、fecl3溶液分别导入cij混合器的各入口(图1)，各流量保持不变，由数字注射泵控制(newera,ne-4000,usa)。在每次生产中，考虑到建立均匀混合条件所需的时间，第一毫升混合溶液被丢弃。最终纳米颗粒悬浮液的ph值为4.7。在制备ta和exendin-4复合物的对照颗粒时，用10mmhcl溶液代替fecl3。为了优化exendin-4的包封效率，在保持其它参数不变的情况下，通过调节ta浓度来控制ta/exendin-4/fe³⁺质量比(exendin-4:1mg/ml,ph7.4；fecl3:0.05mg/ml,ph2.0)，分别将ta溶液1、1.5、2、3、4mg/ml制备的纳米颗粒命名为np-1、np-2、np-3、np-4、np-5。

1.3、纳米颗粒的表征

在室温下利用malvernzetasizernanozs对纳米颗粒进行了动态光散射(dls)(尺寸和多分散性指数测量)和相位分析光散射(pals)(zeta电位测量)。采用feitecnai12透射电镜(tem)对纳米颗粒进行了形貌表征。通过测定上清液中未包封的exendin-4，评价其包封效率(ee)。简单的说,使用超滤管(300kdamwco)在室温条件下以300g离心力超滤纳米颗粒悬浮液20分钟，使用nanoorange蛋白质定量工具测定exendin-4滤液的浓度和开始组装exendin-4纳米粒溶液的浓度，然后使用标准曲线生成一系列exendin-4与已知浓度的关系，ee计算公式(1):

1.4、负载exendin-4纳米颗粒的ft-ir分析

所有样品均未进行预处理，每个样本30μl放置在衰减全反射红外光谱(atr)配件中。在500-4000cm^-1的样品中，平均每个样品进行20次扫描。每次测量前进行背景校正，避免大气干扰，降低仪器噪声。

1.5、负载exendin-4纳米颗粒的冻干

exendin-4纳米颗粒悬浮液被均分于玻璃瓶中并在液氮中快速冷冻浸泡10分钟，然后使用freezonetriadbenchtopfreezedryers(美国labconco)在25℃和10pa条件下冻干36小时。冷冻干燥粉储存在-80℃，并且在每个时间点对冻干纳米颗粒的尺寸和多分散性指标进行了监测。

1.6、纳米颗粒体外释放exendin-4的研究

用移液器将np-2、np-3、np-4和np-5悬浮液(1毫升)吸取到透析管(mwco300kda)，并在含有9毫升pbs(10mm，ph值7.4，0.05％w/v叠氮化钠)的37℃孵化瓶(100rpm)内进行孵化。在预定的时间点(1，2，3，4，5，6，7，8，10，12，16和18天)，收集200μl样本，使用nanoorange蛋白质定量工具分析确定exendin-4浓度。取样后，添加200μl新鲜pbs以保持孵化液的恒定体积。为了测试不同离子强度环境下的释放情况，我们在np-4上使用一系列浓度pbs孵育培养液(10、20和30mm)，在相同的实验设置下，检测第1、2、3、4、5和6天释放的exendin-4的浓度。

1.7、纳米颗粒剂量对细胞活力的影响：mtt法

在培养瓶中培养caco-2细胞，使用补充了高葡萄糖、10％胎牛血清(fbs)，1％非必需氨基酸、1％的谷酰胺、1％的青霉素-链霉素(100iu/ml)的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(dmem)，培养箱条件控制在5％的co2、37℃。细胞毒性实验，将caco-2细胞播种到96孔板，密度1.0×10⁴细胞/孔，生长24小时，然后将纳米粒悬浮液添加到细胞板再孵化24小时，每孔加入20μlmtt试剂(5mg/ml)后孵化4小时，然后倒掉每孔溶液，每孔各加入150μldmso10分钟，然后检测570nm波长下的吸光度。

1.8、动物研究方案

所有的动物实验都是按照动物保护与使用委员会批准的方案在江苏省中医科学院进行的。所使用的t2ddb/dbc57bl/ksj(db/db)小鼠、正常c57bl/ksj(db/m)小鼠以及balb/c小鼠购自南京大学模型动物研究中心。

1.9、小鼠体内纳米颗粒中exendin-4的释放分布

为了监测腹腔注射(i.p.)的纳米颗粒的体内药物释放分布，我们采用cy7.5来标记exendin-4。exendin-4纳米颗粒使用1mg/mlcy7.5标记的exendin-4(cy7.5-exendin-4)、3mg/mlta和0.05mg/mlfe³⁺混合制备，制备方法如上文所述。注射200μl游离的exendin-4或exendin-4纳米颗粒后(n＝3balb/c小鼠，每组剂量＝500μg/kg)，在给药1、3、6、24、48、72、96、120、144、168、192和216小时各时间点，使用ivis近红外成像系统(美国)显示cy7.5标记的exendin-4体内分布，激发波长和发射波长分别是780nm和810nm。同时在各时间点采集眼眶静脉丛血样，监测血液荧光强度。

1.10、血糖浓度测定及exendin-4纳米颗粒的药动学分析

采用8周雄性db/db小鼠进行体内血糖试验，该小鼠为遗传性肥胖瘦素受体缺失小鼠，通常作为自发性t2d小鼠模型。将小鼠随机分为4组(每组5只模型小鼠)，分别注射等量的pbs、游离exendin-4溶液(3mg/kg)、低剂量np-4溶液(3mg/kg)、高剂量np-4溶液(6mg/kg)，同时以健康小鼠(db/m)为对照。使用可重复使用型血糖仪(美国)从尾静脉收集血液样本，并进行血糖水平监测。计算血糖水平随时间变化的曲线下面积(auc)，评价治疗效果。

采用口服葡萄糖耐受试验(ogtt)检测exendin-4纳米颗粒(np-4)的血糖稳定能力。将db/db小鼠随机分为三组，禁食过夜约16h后，对照组用pbs处理，其它两组分别腹腔注射单剂np-4(1.5mg/kg)或游离exendin-4(1.5mg/kg)。1h后灌胃给药pbs溶解的2g/kg葡萄糖溶液。用血糖仪分别于给药0、1、2、3、4、5小时时间点监测血糖水平。计算血糖水平随时间的auc值。

为研究其药代动力学，将db/db小鼠随机分为两组，单次腹腔注射游离exendin-4和np-4(1.5mg/kg)。取预定时间点(0、1、3、6、12、24、48、72、96、120、144、168、192h)眼眶静脉丛血样，4000rpm离心20min后取上清液，用elisa试剂盒测定血清exendin-4浓度。计算血清exendin-4浓度随时间的auc值。

1.11、负载exendin-4的纳米颗粒对小鼠主要器官功能和病理学影响

取眼眶静脉丛血样，4000rpm离心后分离血清。检测血清中alt、ast、akp、γ-gt、bun和cr的浓度。解剖小鼠后取肝、肾、脾、肺、小肠，用4％多聚甲醛固定。采用石蜡切片法将器官切片并干燥，切片经标准h&e染色后观察。

1.12、数据分析

所有值表示为均值±s.d.，组间对照使用graph-padprism5.0版本(graphpadsoftware，us)评估单向方差分析和t检验，p<0.05认为具有统计学意义。

2.1、fnc法制备纳米颗粒

我们首先通过fnc制备了不含fe³⁺的ta/exendin-4二元配合物并监测其稳定性，发现配合物在数小时内迅速聚集(图7a-7c)。这与之前的报道一致，ta主要用于沉淀蛋白质。这种复合物的稳定需要防止ta/exendin-4复合物过度生长成为更大的团聚体。此外，我们发现三价离子如al³⁺与单宁酸之间也存在强烈的配位作用，可以稳定ta/exendin-4二元复合物(图8a-8b)。然而，用ta/exendin-4与二价离子如zn²⁺配制的制剂不能产生可检测的颗粒(图8a-8b)。这种复合物的稳定化需要ta/exendin-4络合物的有效淬火以固定纳米颗粒结构，并防止它们过度生长成更大的聚集体。在这里，我们优选fe³⁺和ta之间的配位络合来“饱和”多余的苯酚基团，并在纳米颗粒结构中形成额外的交联作为稳定机制(图1)。这种方法还会产生一个负电荷表面(zeta电位～23mv)，产生电荷斥力，防止纳米粒子形成后聚集。在该体系中，ta通过氢键和疏水作用与exendin-4结合，通过苯酚-fe³⁺配位与fe³⁺结合，实现了额外的交联和稳定。由于这些络合“反应”发生的速率相对较高，3个组分的混合动力学需要与反应速率相匹配，才能形成均匀的三元络合物纳米颗粒，而不是ta-fe³⁺络合物或ta-exendin-4络合物或异质络合物纳米颗粒。因此，设计一种能让3种成分在毫秒内均匀混合的工艺，是生成粒径均匀的纳米颗粒的先决条件。

快速均匀混合是通过三通道cij设备来实现的(图1)，这种设备已广泛应用于快速纳米络合(fnc)和fnp方法中。我们曾验证，更高的混合效率由更高的体积流率有关。在0.5ml/min的低流速下，通过dls分析(图2a)和tem(图2b)证明了小颗粒(图2b-1)与大团聚体共存(图2b-2)，二者的峰径分别为206nm和957nm。我们将团聚体的形成归因于混合效率不高，导致颗粒和多种颗粒的过度生长。随着流速从0.5ml/min增加到20ml/min，纳米粒子的平均粒径从206nm减小到115nm(图2b)；较大颗粒消失(图2a)。当流速超过20ml/min时，纳米颗粒尺寸没有进一步减小，而pdi略有增加(图9)。由此结果表明，20ml/min是制备三元纳米颗粒的最佳流速。

纳米颗粒对exendin-4的成功负载以及不同组分之间的相互作用通过ftir评估(图2c)。在ta分别与exendin-4、fe³⁺或两者混合后，在3360cm^-1处ta(酚羟基)的游离羟基的伸缩振动峰分别移动到3422cm^-1,3440cm^-1和3424cm^-1。结果表明，ta和exendin-4之间形成氢键，以及ta和fe³⁺之间配位络位。

fnc工艺可规模化制备纳米粒，且在不同的输出量收集的样品展示相同的纳米颗粒尺寸、分散指数和表面电荷(表1)。

表1.用于制备np-4的不同批次等级的fnc的一致性

所有值表示为均值±s.d.(n＝6)

纳米颗粒可进一步冻干长期储存。通常，在冷冻干燥过程中，需要加入足够的冷冻保护剂(如葡萄糖、海藻糖等)来维持纳米颗粒在冻干过程中的稳定性。然而，fnc制备的ta/exendin-4/fe³⁺纳米颗粒不需要冷冻保护剂。在没有任何冷冻保护剂的情况下，纳米颗粒悬浮液冻干后，其尺寸、pdi和表面电荷分布保持不变。这些纳米颗粒在-80℃存储3个月还可以保持原有的物理特性(表2)。这可能是由于ta分子在纳米颗粒表面的亲水特性；更重要的是，ta分子中丰富的表面酚基可以与水分子形成氢键，从而在冻干和重组过程中有效发挥“自冷冻保护剂”的作用。

表2.新鲜制备的与冻干重悬的np-4纳米颗粒的特征对比

所有值表示为均值±s.d.(n＝6)

2.2、fnc制备中ta浓度对纳米颗粒特性及体外exendin-4释放的影响

随着fnc制备中ta浓度从1mg/ml增加到4mg/ml,三元纳米颗粒的平均粒径从140nm(np-1)减小到115nm(np-5)。exendin-4的包封效率从60％提高到接近100％(图3a)。由于exendin-4通过与ta的相互作用被包裹在纳米颗粒中，混合后的ta浓度越高，纳米颗粒的负载能力越强。此外，ta浓度越高，多肽exendin-4络合时交联密度越高，纳米颗粒紧密度越高。这也可能导致纳米颗粒表面的ta密度增加，从而使产生的纳米颗粒表面具有更高水平的负电荷，导致电荷斥力产生早期动力学阻滞进而使得纳米颗粒尺寸变小。这些含有不同ta浓度的纳米颗粒配方在没有明显团聚体的情况下保持了至少12天的高胶体稳定性(图3b)。

为了了解exendin-4在纳米颗粒中的释放机制，我们考察了释放介质ph、离子强度和纳米颗粒组成对exendin-4释放的影响。在ph约为5的去离子水中，6天内几乎没有释放(～2％)(图3c)。因为单宁酸的pka大约是6，在弱酸性条件下(ph<6)，酚基团保持电中性状态，这恰恰是exendin-4与ta以及ta与fe+之间氢键形成的关键(图1)，因此保留住了纳米颗粒中的exendin-4。当ph增加到7.4时，苯酚基团的电离会破坏氢键和配位络合交联，导致exendin-4从纳米颗粒复合物中解离(图1)。

考虑在np-1条件下exendin-4的较低封装效率(<60％)，体外释放性能只在pbs(10mm，ph值7.4)，37℃条件下比较np-2、np-3,np-4和np-5。如图3c所示，np-2和np-3在前2天均有显著的exendin-4的爆释，分别为60％和40％，并在约6天内迅速达到峰值。当配方中ta浓度增加时(np-4和np-5)，爆释减少，整体释放曲线可延长至12天。这是由于纳米颗粒中ta浓度越高，交联密度越高，使得exendin-4与纳米颗粒的解离率越低。

离子强度可以影响exendin-4的释放动力学(图3d)。当离子强度从10mm增加到30mm时(pbs,ph7.4)，exendin-4的爆释更加明显，第一天的释放量从15％增加到55％。

2.3、注射负载exendin-4纳米颗粒后的体内释放

cy7.5标记的纳米颗粒与未标记的纳米颗粒相比，纳米颗粒尺寸无显著差异(图10)。mtt试验评估了细胞毒性，在浓度从0到75μg/ml的纳米粒溶液中孵化caco-2细胞，24小时细胞生存能力没有显著的下降(图11)。给予不同纳米配方的小鼠荧光成像结果如图4a所示。值得注意的是，在相同的剂量下，游离的exendin-4组在腹腔的信号强度明显强于负载exendin-4的纳米颗粒组。这是由于纳米粒子内部的荧光猝灭以及ta/fe³⁺复合物的屏蔽效应，因为它们的吸收范围(400～1000nm)覆盖了cy7.5(ex:780nm,em:810nm)的激发和发射波长。给药48h后由于多肽的快速扩散和降解，游离的exendin-4组信号逐渐消失，荧光信号几乎无法检测到。而负载exendin-4的纳米颗粒组随着exendin-4从纳米颗粒中释放并逃脱荧光猝灭和屏蔽作用，信号强度逐渐增大并在腹腔内扩散。信号强度在72h左右达到峰值，一直持续到144h，这个结果与该制剂(np-4)的体外线性释放相契合，144h后信号逐渐减弱，释放速率逐渐减小(图4a，图4b)。

对采集的血样进行荧光成像，检测血中exendin-4的浓度(图4c)。游离组的exendin-4血药浓度在给药后立即达到峰值，在6h内迅速下降，24h时达到本底水平，印证了exendin-4在体内快速的被清除以及血液中exendin-4半衰期短。给予exendin-4纳米颗粒后，在3h内检测到的中等的血药浓度，至少以中-低水平维持了192h，与腹腔的体内成像结果一致。这些发现表明了，负载exendin-4的纳米颗粒能够在体内实现exendin-4缓释。

2.4、负载exendin-4的纳米颗粒治疗t2d模型小鼠

各试验组控制血糖水平的效果如图5a所示。健康对照组(db/m小鼠)和模型对照组(db/dbt2d小鼠)在整个实验过程中血糖分别处于正常和超高水平，波动幅度较小。t2d小鼠给予游离exendin-4后，6h内血糖水平迅速下降至正常小鼠血糖水平，24h后迅速升高至警戒水平(20mmol/l)以上，48h后恢复到初始水平；低剂量np-4(3mg/kg)给药后12h内血糖水平迅速降至正常水平，维持约48h，且未出现明显低血糖症状；高剂量np-4(6mg/kg)给药后，降低血糖的效果类似于低剂量组，但正常的血糖水平维持72h。值得注意的是，132h后血糖水平仍低于初始水平的50％，204h后才逐步返回到初始水平的75％，显示出纳米颗粒的长期且持续性释放exendin-4的效果，且这种效应也存在剂量依赖。计算auc(0～204h)后，量化治疗效果，显示高剂量np-4组血糖控制效果较游离exendin-4组明显改善(图5b)。低剂量np-4(3mg/kg)和高剂量np-4(6mg/kg)组较游离exendin-4组和t2d模型对照组出现体重下降趋势(图5c)，进一步证明t2d症状得到有效缓解。为了使血液中的exendin-4浓度长期高于有效下限，从而得到成功的治疗效果，必须优化exendin-4的释放率。np-5释放速度最慢，在相同剂量(3mg/kg)下，与np-4(48h)相比，其维持正常血糖的时间(36h)相对略短，且更易复发高血糖状态(图12)。

采用口服葡萄糖耐量试验(ogtt)模拟餐前给药情况。如图5d、5e所示，t2d模型对照组在给糖40min后血糖水平急剧升高，达到峰值(～24mmol/l)。在葡萄糖注射前1h预先给予exendin-4纳米颗粒，观察到其对血糖升高有明显的抑制作用，峰值血糖为17.0mmol/l。相比之下，游离exendin-4注射液的作用略高，最高血糖为13.5mmol/l，表明其吸收进入血液循环的速度相对纳米粒更快。

为了进一步研究在体内的长期释放效果，我们比较了游离的exendin-4和包裹在纳米颗粒中的exendin-4分别的药代动力学。游离exendin-4组血药浓度在1h内迅速升高至263ng/ml，注射24h后降至接近于零(图5f)。相比之下，注射192h后，exendin-4纳米颗粒组血清中仍可检测到exendin-4的浓度。纳米颗粒给药后exendin-4浓度曲线auc为游离exendin-4注射液的7.2倍。因此我们证实，np-4纳米颗粒制备具有较低的给药频率和较长的疗效的优势，是一种使用exendin-4治疗t2d的长效体系。

2.5、exendin-4纳米颗粒对t2d小鼠主要器官的病理改善

t2d的健康风险除了表现为高血糖外，还表现为主要器官的组织损伤。我们进一步研究了负载exendin-4纳米颗粒的治疗是否有助于减轻主要器官的相关病理损伤。如图6a所示，模型对照组肝细胞明显肿大，出现肝溶解性坏死区域；肾小球增生，肾包膜萎缩，表明有明显的肾脏病变。单次给药3mg/kg的纳米颗粒9天后，肝脏和肾脏的病理损害减轻，且改善较游离exendin-4更明显。此外，经评估，所有器官在给予np-4治疗后均无明显炎症或其它病理改变。

值得注意的是，akp、alt、ast、γ-gt、bun和cr浓度在t2d模型小鼠中都高于健康小鼠(图6b)，在游离exendin-4或负载exendin-4的纳米颗粒治疗后，病理指标均得到改善；且纳米颗粒组的整体改善更为显著，这与组织病理学评估结果一致。这些观察结果表明，负载exendin-4的纳米颗粒具有良好的生物相容性和治疗效果，可在维持血糖水平的基础上缓解t2d的相关症状。

3、总结：申请人研制了一种ta/exendin-4/fe³⁺三元纳米颗粒系统，该系统能够在腹腔给药后持续释放exendin-4。fnc技术促进了三种成分的快速混合，使ta和exendin-4络合，以及ta/fe³⁺的配位能够同时进行，从而生成粒径均匀、胶体稳定性好的纳米颗粒。如果没有fnc系统提供的均匀混合，这种可控的络合是不可能实现的。由于fnc的高效混合，纳米颗粒具有良好的粒径均匀性和封装效率。这些纳米颗粒实现了exendin-4的可调释放，具有良好的生物相容性，并可以以冻干的形式储存，在不需要任何冷冻保护剂前提下即可进行重悬。在t2d小鼠体内研究表明，优化后的三元纳米颗粒在单次给药后数天内有效快速降低血糖水平，维持血糖控制，在肝、肾损伤和体重控制方面改善治疗效果。值得注意的是，fnc是一种再现性高和可规模化生产的工艺，可用于生产络合机制介导的纳米颗粒组装，用于大分子药物的封装和递送。本研究中使用的载体分子ta是fdagras(公认安全)名单上的一种天然食品添加剂；在适当的浓度范围使用具有生物相容性。因此，该纳米颗粒系统作为一种长效的t2d治疗纳米药物具有很高的临床转化潜力。

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