专利名称:用于诱导在体内和体外产生细胞分裂素的化合物制备工艺的制作方法
众所周知，正常淋巴细胞的生长，不仅取决于与抗原物质或促细胞分裂剂的接触，而且也取决于某些称为淋巴细胞活素的生长因子的存在。这些生长因子当中，有一种称为T-细胞生长因子(TCGF)，通常称其为微胞间白细胞(杀菌)素-2(IL-2)。这种生长因子的发现(Gillis)等人，《自然》(Nature)，268;154(1977)和Ruscetti等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，119;131(1977)，导致作为IL-2来源的T-淋巴细胞的大规模培养和克隆化。
动物体内的淋巴细胞或白血细胞有两种类型B-细胞和T-细胞。B-细胞以免疫球蛋白的形式产生抗体，与侵入体内的微生物结合在一起，而T-细胞则产生决定B-细胞能否发挥作用的淋巴细胞活素。参阅，例如《细胞免疫学》(Cell Immunol.)，3615(1978);《细胞生理学杂志》(J.Cell Physiol)9653(1978);《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)8681(1978);《免疫学评论》(Immunol.Rev.)54188(1981);《免疫学评论》54158(1981);《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)1541500(1981);《国立癌症研究所月刊》(National Cancer Institute Mon.)60211(1982);《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)28157(1981);《T-细胞亚种群在癌症治疗中的潜在作用》，编著A.Fefer和A.Goldstein，Raven Press，纽约，173页及其后文，(1982);《免疫学杂志》128258(1982)。
已知的淋巴细胞活素除IL-2外，还包括B-细胞因子，巨噬细胞活化因子(MAF)，微胞间白细胞(杀菌)素-3(IL-3)，菌落刺激因子(CSF)，肿瘤坏死因子，和由诸如微胞间白细胞(杀菌)素-1(IL-1)和r干扰素这样的单核细胞产生的其它因子。所有这些因子都由白血细胞分泌，总称胞质分裂素。对于各种重组体DNA技术和能产生这些物质的正常T-细胞系和B-细胞系的其它克隆化方法的应用受到高度注意。参阅，例如《自然》209130(1976);《免疫学》32319(1977);《实验血液学》(Exp.Hemat.)8494(1980);《自然》283581(1980);《美国国家科学院院报》(Pnoc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)781858(1981);《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)491(1982);《自然》29424/31697-699(1981)，所有这些都列入参考文献。
本发明基于发现一类合成的碲或硒的有机衍生物能刺激可产生胞质分裂素的细胞在体内和体外产生大量胞质分裂素。这一发现使得有可能采用一种新的治疗方法治疗癌症，免疫缺陷，自身免疫疾病和传染病。
因此，本发明的目的是提供可用作治疗药剂的以碲和硒为基础的新化合物。
本发明的目的还有提供在体外产生胞质分裂素，例如淋巴细胞活素的新方法，并诱导受体产生这些胞质分裂素。
本发明的目的还有在体内产生像淋巴细胞活素这样的胞质分裂素，并诱导受体产生胞质分裂素，用来治疗疾病，如癌症，免疫缺陷，自身免疫疾病和传染病。
本发明的目的还有提供以能在体内外产生胞质分裂素的碲化合物为基础的新药组合物。
图1是实例1化合物在KBr中的红外分析。
图2是实例2化合物在KBr中的红外分析。
可用于本发明的碲或硒的衍生物，包括能刺激细胞产生淋巴细胞活素的具有如下通式的那些化合物
(C)TeO2或(D)phTeCl3或(E)(C6H5)+P(TeCl3(O2C2H4))-其中Q是Te或Se;t是1或0;u是1或0;v是1或0;R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9，相同或不同，并且可独立选自下列基团氢，1-5碳的羟烷基，羟基，1-5碳原子的烷基，卤素，1-5碳原子的卤代烷基，羧基，2-10碳的烷基羰基烷基，1-5碳原子的链烷酰氧基，1-5碳原子的羧烷基，酰基，酰胺基，氰基，1-5碳的酰胺基烷基，2-10碳的N-单烷基酰胺基烷基，4-10碳的N，N-二烷基酰胺基烷基，1-5碳的氰基烷基1-5碳原子的烷氧基，2-10碳原子的烷氧基烷基和-COR10，其中R10是1-5碳的烷基;X是卤素;在说明这种铵盐的同时，还应理解其它在药物学上可接受的盐，都属于本发明的范围。具有五元环的化合物是最理想的。
如同在这里和在追加权项中使用的一样，1-5碳原子的烷基这一术语包括直链和支链烷基，例如甲基;乙基;正丙基;正丁基等等;1-5碳原子的卤代烷基这一术语包括氯甲基;2-碘乙基;4-溴正丁基;碘乙基;4-溴正戊基等等;1-5碳原子的链烷酰氧基这一术语包括乙酰基，丙酰基，丁酰基等等;羧烷基这一术语包括羧甲基，羧乙基，亚乙基羧基等等;烷基羰基烷基这一术语包括甲酰基甲基，乙酰基乙基等等;酰胺基烷基这一术语包括-CH2CONH2;-CH2CH2CONH2;-CH2CH2CH2CONH2等等;氰基烷基这一术语包括-CH2CN;-CH2CH2CN;-CH2CH2CH2CN等等;1-5碳原子的烷氧基包括甲氧基，乙氧基，正丙氧基，正戊氧基等等;卤代和卤素这些术语用来表示氯，溴，碘和氟;酰基这一术语包括R16CO，其中R16是H，或1-5碳的烷基，例如甲酰基，乙酰基等;芳基这一术语包括苯基，烷基苯基和萘基;N-单烷基酰胺基烷基这一术语包括-CH2CH2CONHCH3，-CH2CONHCH2CH3;N，N-二烷基酰胺基烷基这一术语包括-CH2CON(CH3)2;-CH2CH2CON(CH2CH3)2。
以碲为基础的化合物是本发明目前优先选择的化合物。优先选择的以碲为基础的化合物包括具有如下化学式的化合物
其中X是卤素，优先选择的卤素化学物是氯。这些化合物能诱导IL-2生成，以及使能产生IL-2的细胞分裂增殖，和使IL-2受体部位活化。
以碲为基础并可用于本发明实施的其它化合物包括PhTeCl3，TeO2和(C6H5)4P+(TeCl3(O2C2H4))-〔《自然研究杂志》(Z.Naturforsh)，368，307-312(1981)〕。在后面实例2中描述的化合物有如下结构
可用于实施本发明的其他化合物包括
其中R11，R12，R13和R14都可独立选自下列基团氢，1-5碳原子的羟烷基，羟基，和1-5碳原子的烷基。
可用于制备结构A或B的化合物的有用二羟基化合物，包括化学式Ⅰ的那些化合物，其中R，R1，R4和R5如表所示
(Ⅰ)
表R R1R4R5H H H HH Cl H HH OCH3H HH COOCH3H HH H CN HH CHO H HH H COOH HH CH2COOH H HH H CHCOOCH3HH I H HH H Br HH H CONH2HH H CH2OH HH COOH H H可用于制备化合物A和B的其它二羟基化合物，包括化学式Ⅱ的那些化合物，其中R，R1，R2，R3，R4和R5如表中所示
(Ⅱ)
R R1R2R3R4R5H H H H H HH H Cl H H HH CH2OH H H H HH H OH H H HH H H CH3H HH H H CH2Cl H HH H H COOH H HH H H CH2COOH H HH H H CHO H HH H H H H CH2CHOH H CONH2H H2CH3H H H CN H HH H H H CH2CONH2HH H H COOCH3H3HH H3OCH3H H H用于制备化学式A和B的化合物的其它二羟基化合物，包括化学式Ⅲ的那些化合物，其中R，R1，R2，R3，R4，R5，R8和R9如表所示
(Ⅲ)
R R1R2R3R4R5R8R9H H H H H H H HH H Cl H H H H HH H H H Br H H HH H OCH3H H H H HH H2CONH2H H H H HH Br H H Br H H HH H H H CH2COOH H H HH H Cl H H H H HH CH2COOH H H H H H HH H CH3H H H H HH CH3H H H H H HH CH2Cl H H H H H HH H H H H H H HH CH2CN H H H H H HH H H H CH2CH2OH H H H还有一些二羟基化合物，包括结构式(Ⅳ)的化合物，其中R，R1，R2，R3，R4和R5如下表所示
(Ⅳ)
R R1R2R3R4R5R6R7R8R9H H H H H H H H H HH H Cl H H H Cl H H HH H Cl Cl H H H H H HH H CONCH3H H H Br H H HH H Br H H H CON(CH3)2H H HH H H OCH3H H H H H HH H H H OCH3H H H H HH H H H CH2COOH H H H H HH H COOH H H H H H H HH CH3H H H H H H H HCH3H H H H CH3H H H HH CH2CH3H H H H H Cl H HH CH2CN H H CH2OH H H H H HH H H I H H H H CN HH CH2CH2COOH H H H H H H H HH H CHO H H H H H H HH H H F H H H H H H化学式为
的化合物，其中R11，R12和R15如同上文定义的一样;可由适当的二，三或四卤代硒化物或碲化物与可能具有如下化学式的适当羟基化合物反应制备HO-R16
R16是1至5个碳原子的烷基，1至5个碳原子的卤代烷基，芳基，烷基芳基，1至5个碳原子的烷基酰胺基，1至5个碳原子的烷基羰基，1至5个碳原子的氰基烷基，和2至10个碳原子的烷氧基烷基。R16的具体实例包括甲基，乙基，正丙基，苯基，甲苯基，酰胺基乙基，氰基甲基，甲氧基甲基和CH2CH2COOH。
这些化合物可通过在适当的反应器中，在室温或高达回流温度的高温下，使基本上等摩尔量的反应物化合制备。最好利用一种能溶解反应物的溶剂，如乙腈，苯，甲苯，二甲苯，二甲基亚砜及它们的混合物，等等。结构(A)的化合物只能用乙腈制备。最好的方法，要求把反应混合物加热至溶剂的回流温度，同时用一个适用的磁力搅拌器或机械搅拌器搅拌反应混合物。反应可进行足够长的时间，以确保反应物完全反应。这个时间因反应条件，所制取的特定化合物和溶剂的性质而异。反应可在常压下进行，但如果需要也可以利用惰性气氛如氮气，氩气，氦气或它们的混合物。可用的反应时间为1分钟到168小时，虽然较佳的反应时间为6至16小时。
反应器应是玻璃结构的，或内衬对于反应物呈惰性的玻璃或其它陶瓷材料。
用这种工艺产生的化合物，通常会随着反应混合物冷却至室温而沉淀。添加适当的沉淀剂，例如像己烷这样的液态烷烃，或者通过借助于真空或无真空的蒸发除去溶剂而使反应混合物浓缩，也可以产生沉淀。产物可用烧结玻璃过滤器收集，用冷溶剂洗涤，然后利用常用技术干燥。产物贮存在避光的适当容器中，最好是贮存在低温下，以避免分解。
本发明化合物配药的溶剂系统，包括二甲基亚砜或低级链烷醇，如乙醇和丙醇，邻二醇，如乙二醇，甘油，丙二醇，等等。最好的溶剂系统是磷酸盐缓冲盐水溶液，其水中含有一定量的酸式磷酸钠，得到的PH值为7.1～7.2(PBS)。
技术熟练人员会知道，对于会干扰特定化合物合成的活泼基团的存在，需要使用一种可用已知方法除去的保护基团。
本发明的化合物，可使用在各种条件下有效的量对哺乳动物给药，以治疗癌症，免疫缺陷，自身免疫病和传染病。该治疗通过引起哺乳动物体内产生更大量的淋巴细胞活素，减轻这些疾病的症状。本发明也包括在体外产生更大量的细胞分裂素，如淋巴细胞活素，和/或它们的受体，并使用这些物质和/或作为治疗剂，对哺乳动物给药，以减轻癌症，免疫缺陷和传染病。可以预期，本发明的配方可与其它抗癌化学治疗剂，如环磷酰胺联合使用。
癌症这一术语，通常包括由于接触致癌物质，由于放射及由于肿瘤病毒而自发产生的白血病和硬肿瘤。这些病症为本领域熟练的技术人员所熟知，而且包括这样的病症，如肾上腺肿瘤，骨肿瘤，胃肠肿瘤，脑肿瘤，乳房肿瘤，皮肤肿瘤，肺肿瘤，卵巢肿瘤，泌尿生殖器肿瘤等。《默克手册》(Merck Manual)第13版(Merck & Co.(1977))描述许多种这样的肿瘤。这个出版物第647-650;828-831;917-920;960;970-974;1273;1277;1371-1376;1438-1441;1563;1612;1615页，均列入本文参考文献。
免疫缺陷这一术语，通常描述一类各不相同的病症，例如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，其主要特征是对各种感染的敏感性增加，随后产生严重的急性，复发性和慢性疾病，这是由于在专一性的或非专一性的免疫系统中有一种或几种缺陷而产生的。《默克手册》(Merck Manual)第13版第205-220页描述了很多这样的疾病，它们都列入本文参考文献。
自身免疫病这一术语包括如下病症，其中免疫系统对内生抗原产生自身抗体，导致对组织的伤害。《默克手册》(Merck Manual)第13版第241-243页描述许多这样的疾病，它们均列入本文参考文献。
传染疾病这一术语包括那些病理性疾病，是由于细菌、病毒或真菌微生物侵入并破坏哺乳类动物体内的正常功能而产生的。《默克手册》(Merck Manual)第13版第3-149页描述这样的疾病，它们均列入本文参考文献。
这些化合物的给药方式可以是口服的，肠胃外的，经皮的、局部的，或通过粘膜接触。这些化合物可以以胶囊或片剂口服给药，胶囊或片剂可以用一般的赋形剂，粘合剂，分散剂等制备。肠胃外途径是目前较好的方法，且组合物可以这样配制把化合物溶解在适当的溶剂中，例如水缓冲剂和二甲基亚砜或甘油。肠胃外的途径可以是肌肉内的，静脉内的，利用持续释放载体的皮内的，或皮下的途径。化合物在与药用载体共用时的浓度是无关紧要的，这只是选择问题。《雷明顿药房实践》(Remingtons Practice of Pharmacy)第九，十，十一版中描述了各种各样的药用载体，并列入本文参考文献。
已经发现，可用于实施本发明的许多碲化合物，在水存在下会水解。这些水解的组合物在活体内外都是有特效的，虽然这些水解的组合物最终要分解，丧失它们诱导淋巴细胞活素分泌的能力。因此，这些组合物应当新鲜配制。如果这些化合物以干的形式经口给药，那么它们在诱导淋巴细胞活素的产生方面仍有特效。最理想的是，应将这些化合物存放在无水条件下，直至临使用前再配制。
也已发现，像TeO2这样的某些化合物，能单独诱导产生T细胞的淋巴细胞在活体内外产生淋巴细胞活素，但它不会引起产生IL-2的细胞分裂繁殖，也不会使应答T-细胞的淋巴细胞中的接受部位活化。因此，本发明也预期TeO2和碲化合物单独使用，能有效地诱导产生淋巴细胞活素。
局部使用的组合物，可通过将化合物分散在亲水的或疏水的化粧品中制备。可以用凡士林或工业制剂，如Olay(商品名)油。其浓度按重量计，可从0.0001%到5%。
用于刺激淋巴细胞活素产生或治疗本文描述的特殊疾病的本发明化合物的剂量，可能因特定的疾病和疾病阶段而异。通常该化合物可以给药的量，范围从0.05×10-3至1×10-3克/公斤体重，最好从0.1×10-3至0.5×10-3克/公斤体重。例如，对于75公斤体重的哺乳动物，预计每天1-3毫克的剂量，就足以诱导产生淋巴细胞活素，但这个剂量仍可根据进行治疗的个体响应和特定病症加以调整。
除治疗上文描述的哺乳动物病症外，这些化合物也可以用于兽医用途，以治疗马，有蹄动物和家禽所患的病毒性疾病和免疫疾病。治疗这些病症可以使用的量，就是可以治疗上文描述的哺乳动物病症的化合物的那些量。
对于体外使用，可以刺激细胞产生淋巴细胞活素的用量是1×10-8至1×10-4克，最好是1×10-7至1×10-5克化合物/106细胞/毫升。
对小鼠的初步毒性研究已确定，对于6周龄的小鼠，采用实例1的化合物，其半致死剂量LD50为300微克/25克体重。这些化合物可用作植物或动物的抗菌剂或抗病毒剂。病毒感染，例如小鼠中的西尼日病毒感染，对于实例1化合物可感受的剂量为10微克/天/只小鼠。植物细菌感染，例如由肿胀野杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的根瘤，施用本发明化合物的0.1%溶液，即可治疗或预防。
本发明也考虑了一种将本发明化合物溶解于水载体中的方法。这种方法包括利用长时间超声波搅拌或机械搅拌使化合物溶解。通常由变频器把50/60赫的交流市电转换为高频电能，再偶合到振子上产生超声波。采用压电陶瓷制品使电频率转变为机械振动。典型的40千赫芝0.0003振幅的设备和20千赫芝0.00007至0.001振幅的装置是有用的。超声振子配备一个增压器与集音器连接，后者有一个部件用以把超声波传导到盛有液体的容器，用以溶解本发明的化合物。有用的装置包括小型超声波清洗机，例如Bronson仪器。已经发现，含大约5毫克/100毫升的本发明的溶液，可在足以提供含本发明化合物水溶液的时间内应用超声波制备。对此，所需的时间通常是3小时到24小时。为此目的可使用高速机械振动器，如Tutenhauer振动机，或韦林氏搀合器。用电动搅拌器，通常在搅拌3至4小时后将使化合物形成溶液或悬浊液。
已经发现，可以用甘油配制含这种化合物的含水液体。然后，用可注射的水稀释剂，如水，盐水溶液等，来稀释这些制剂。优先选择的稀释剂是PBS。
下列实例是本发明的具体说明，当然，它们不限制本发明的范围。
实例1将0.01摩尔乙二醇和0.01摩尔四氯化碲溶解在35毫升干燥的乙腈中，并放入装有回流冷凝器和电磁搅拌器的烧瓶中。将反应混合物回流6小时，溶液趁热用烧结玻璃过滤器过滤，收集滤液并使温度降到室温，使其形成白色沉淀。在烧结玻璃过滤器中过滤并收集沉淀，用冷的乙腈洗涤，在0.05毫米Hg的真空下干燥10小时。熔点(d)为200℃。元素分析计算值是，%C＝7.70;H＝2.57;N＝4.49;Cl＝34.06;O＝10.26;Te＝40.92。实测值C＝7.87;H＝2.5;N＝4.5;Cl＝33.38;O＝10.13;Te＝41.12。质子核磁共振谱(氘化的二甲基甲酰胺)σ(PPm)4.43(4H，s)，7.7(4H，t)。质谱是m/e130，160，165，180，190，200，222，224，247，251，258，260;13C核磁共振谱证实存在CH2基团;125Te核磁共振谱证实该分子中存在一个Te原子。
Cl分析中出现的差异，可能是由于样品中存在少量化学式Ⅱ的化合物。
实例2在装有回流冷凝器和电磁搅拌器的烧瓶中，放入含0.01摩尔四氯化碲的50毫升干燥苯，添加0.01摩尔乙二醇。反应混合物回流16小时，趁热通过烧结玻璃过滤器过滤，以下步骤同实例1，只是用苯做洗涤液。得到分子式Ⅱ的化合物。熔点(d)约250℃。
实例3按下列步骤配制实例1化合物的溶液取5毫克实例1化合物置于容量瓶中，加入100毫升含40%二甲基亚砜(DMSO)和60%磷酸盐缓冲剂盐水(PBS)的溶液，得到的溶液浓度为10微克/0.2毫升。如果溶液是混浊的，可以2000转/分的速度离心分离10分钟，取上层清液备用。
实验动物是6～8周龄的Balb-C小鼠。用25号5/8″皮下注射针头，全部向腹膜腔内注射0.2毫升实例1化合物的溶液。
动物接受下列注射(a)对照组(无注射)(b)对照组(0.2毫升DMSO)(c)1微克实例1化合物(0.2毫升DMSO/PBS溶液)(d)10微克实例1化合物(0.2毫升DMSO/PBS溶液)a，b，c和d组各由21只动物组成，从注射后24小时起至7天，每天处死这些动物。
每天将各对照组三只动物的脾细胞集中在一起处理，让这些脾细胞通过一个60目不锈钢网，置于一个含PBS的5毫米培养皿中，以便分离这些细胞。收集这些细胞，并以1000转/分的转速离心分离10分钟。弃去上层清液，用5毫升低渗缓冲溶液(0.15MNH4Cl，0.01MKHCO3，溶于重蒸馏水中，PH7.2)将细胞处理2分钟，以杀灭红细胞。然后向细胞中加入PBS，以1000转/分的转速将这些细胞离心分离10分钟。用PBS对这些细胞洗涤两次，在血球计中用锥虫蓝计数，以检验其活力。用富RPMI把这些细胞配成107细胞/毫升的浓度，这种富RPMI含10%胎牛血清(英格兰苏塞克斯血清实验室)，5×10-5M2-巯基乙醇和3%d-谷氨酰胺(以色列生物实验室)(2mM×1000非必需氨基酸的储备液)(以色列生物实验室)(储备液×1000)和丙酮酸钠(以色列生物实验室)(储备液1mM×100)。
再从每个实验组中各处死三只动物，分别用同样的步骤处理各个脾脏。
将细胞混合物分成两组。
(a)在浓度为107细胞/毫升富RPMI的细胞中，加入刀豆球蛋白-A(CON-A)(DiFCO，批号352)2微克/毫升。在37℃，7.5%CO2条件下，将这些细胞在5毫米培养皿(NUNC)中培养24小时，收集上层清液，以1600转/分的转速离心分离10分钟，在4℃贮存备用。对这些上层清液进行IL-2和CSF活性检定。
(b)浓度为107细胞/毫升富RPMI的细胞，不加CONA在37℃，7.5%CO2条件下培养96小时。取上清液，离心分离，贮存在4℃直至使用。对这些上层清液检定CSF活性。
在细胞培养前，从培养皿取出样品，用细胞离心法制作培养物涂片。用May-Grunwald-Giemsa(1∶10)溶液将载片染色，根据形态进行评价。利用放射性胸苷检定法测定IL-2活性。
IL-2活性检定法1、利用依赖IL-2的细胞系CTLD的增殖，测试上清液的IL-2活性。IL-2检定是基于这些培养的T-细胞系生长对IL-2的依赖性。从依赖于IL-2的培养物中收集T-细胞，洗涤，然后再放回没有IL-2的培养物中，T-细胞在24小时内不断死亡。使用氚化的胸苷结合物(3H-TdR)作为培养的T-细胞重复的指标。IL-2的微量检定，给出在上述制备的上清液中IL-2活性数量的高度再现指示和定量指示。
2、为了检定IL-2活性的条件介质，把含有5×104CTLD细胞，10%胎牛血清和50%待查的上清液的样品，全部悬浮于最终体积为1毫升的RPMI中。在96微孔组织培养盘(NUNC)的四个重复孔中，放入等份量的每种样品，每份0.2毫升。条件介质是从用CONA刺激的查里斯河大鼠脾细胞培养物中得到的，CONA中含有已知量的IL-2，作为所有检定的参比标准。
3、这些微孔在37℃培养24小时，然后加入1微居里/孔的3H-甲基胸苷。随后将细胞进一步培养过夜，用细胞收集器收集，在β闪烁仪中计数。
以每分钟计数(CPM)表示的结果如下，结果指出，在上层清液中存在相当数量的IL-2。
a)对照组(无注射)b)对照组(0.2毫升DMSO)c)1微克实例1化合物(0.2毫升DMSO/PBS溶液)d)10微克实例1化合物(0.2毫升DMSO/PBS溶液)
第1天 第2天 第3天 第4天 第6天 第7天(a)＊37，695 32，055 24，758 45，029 25，065 36，775(b)＊16，323 30，824 24，861 30，555 48，921 38，626(c) 25，919 21，398 10，130 31，999 41，261 66，854(c) 34，326 22，050 13，235 14，226 80，314 58，094(c) 16，718 9，338 2，176 17，228 42，485 51，268(d) 24，335 31，901 20，316 26，644 22，040 85，216(d) 21，193 36，390 18，288 18，051 74，043 6，299(d) 25，381 22，066 12，126 65，963 43，838 -＊对照组动物的脾从动物身上摘除后集中处理。
实例4本实例描述用实例1化合物对人体单核细胞产生IL-2的刺激作用。
静脉全血(加肝素，Evans10国际单位/毫升血)用RPMI以1∶1的比例稀释。稀释的血缓缓放入淋巴制剂中(挪威，奥斯陆，Nylgard & Co.，密度1.077克/毫升)，一份淋巴制剂加两份稀释血。每支试管中加3毫升淋巴制剂和6～7毫升稀释血。将这些试管在室温下以1600转/分的转速离心分离30分钟，离心分离后，从界面部分收集单核细胞，用RPMI洗涤三次，把细胞重新悬浮于RPMI中，在血球计上用锥虫蓝计数，以测试活力，并用富RPMI配制成1×106细胞/毫升的浓度。以细胞混合物10%的体积，添加范围从50微克/毫升到5皮克/毫升的各种浓度的实例1化合物。从每个样品中取出每份0.2毫升置于微培养皿孔中(NUNC)(每个样品三份)。将微培养皿在37℃培养72小时。然后，向培养物中加入3H-甲基胸苷1微居/孔(以色列核研究中心)，将细胞进一步培养过夜，用细胞收集器收集。在每毫升细胞1～10纳克实例1化合物的范围内，人体单核细胞的增殖量增加5～6倍，从而表明实例1化合物既能在单核细胞子集中诱导IL-2的产生，引起所观察到的增殖，和/或能在一给定的群体中诱导形成受体，这也会导致增殖。
实例5这个实例说明了实例1化合物对以实验方法在体内诱发肿瘤的影响。
0.2%甲基胆蒽(MCA，Sigma，美国)溶液的制备，是将2毫克该致癌物溶解在1.0毫升橄榄油中(参阅Petra等人，《癌症》(Cancer)19302，1961)，在37℃连续摇动30分钟。对6～8周龄的C3Heb小鼠的右臀部做皮下注射，剂量为0.6毫克MCA/0.3毫升溶剂/只小鼠。
21～30天后，将诱发的肿瘤切除，使其通过60目不锈钢网，得到分离的细胞。然后再把这些细胞经皮下注射到5～8周龄的C3Heb小鼠右臀部，浓度为106细胞/0.3毫升PBS/只小鼠/25号5/8″注射针头，以进一步诱发肿瘤的形成。
注射癌细胞5天后，诱发了可触诊的肿瘤。随后对这些动物做如下处理a)对照组(0.2毫升40%DMSO60%PBS，在诱发的肿瘤可触诊后1天做腹膜腔内注射)。
b)对5只小鼠向腹膜腔内注射10微克实例1化合物(0.2毫升40%DMSO60%PBS，在诱发的肿瘤可触诊后三天注射第二次注射10微克化合物，溶剂量相同，在第一次注射后五天对五只小鼠中的三只进行。)13天后切除肿瘤，测量它的体积，并报告于下表中。所有动物都在最初接种后35到38天死亡。
表组 小鼠 实例1化合物给药 肿瘤体积(13天)a＊ 1 - 4.01a＊ 2 - 3.7a＊ 3 - 3.9b 7 第3天 0.77b 8 第3天 1.66b 4 第3天和第5天 0.7b 5 第3天和第5天 0.52b 6 第3天和第5天 0.31＊对照组实例6按照实例5的步骤，对7周龄的Balb-C小鼠体内注射甲基胆蒽，诱发纤维肉瘤细胞的形成。试验动物分成两组。
a)对照组(0.2毫升40%DMSO60%PBS)b)10微克实例1化合物(0.2毫升40%DMSO60%PBS，以表2中表示的时间间隔注射。)
表2接种肿瘤细 注射实例1化胞后的天数 合物后的天数 %存活率a)＊24 - 100%25 - 63%34 - 55%46 - 45%60 - 35%67 - 18%69 - 0%b) 4 4 100%9 9 100%23 23 100%30 30 100%37 37 100%39139 100%41 41 100%43 43 100%46 46 80%48 48 80%50 50 80%53 53 60%60 60 40%67 - 20%68 - 0%＊对照组1、第39天标志着开始增加剂量摄生，以确定实例1化合物的毒性。(b)组的死亡率结果，直到增加剂量摄生后不久还是0%。
实例7本实例描述在体外用实例1化合物作为外在刺激剂，从小鼠脾细胞制备IL-2和CSF。
从15只6～8周龄的雄性Balb-C小鼠摘除脾脏。为了分离细胞，迫使脾细胞通过60目(美国标准)不锈钢网，置于含PBS的5毫米培养皿中，然后将细胞收集到离心试管中，以1000转/分的转速旋转10分钟。弃去上清液，对细胞用5毫升低渗缓冲剂(0.15MNH4Cl;0.01MKHCO3溶于重蒸馏水中，PH7.2)准确处理2分钟。然后，将PBS加到细胞中，将试管以1000转/分的转速离心分离10分钟。将细胞漂洗两次，在血球计上用锥虫蓝计数，以测试活力。把这些细胞配制成浓度为107活细胞/毫升的浓度。让这些细胞接触在1毫升40%DMSO60%PBS中不同数量的实例1化合物。表3列出IL-2活性的诱导作用，和用不同数量实例1化合物得到的菌落刺激因素。
表3实例1化合物IL-2(Cpm) CSF(菌落数/盘)50μg 5，000 25μg 5，000 5500ng 5，000 2550ng 6，000 755ng 15，000 120500pg 30，000 17550pg 38，000 2605pg 12，000 140
μg＝微克(10-6克)ng＝纳克(10-9克)pg＝皮克(10-12克)发现注射DMSO溶剂的对照组动物有4，000～5000CPM的IL-2本底值和70～80/菌落数/盘的CSF。
实例8人体单核细胞以如上文所述的方法得到，并以106细胞/毫升富RPMI的浓度，在不同浓度的实例1化合物存在下培养72小时。收集培养物上层清液，离心分离，用50%体积的上层清液测试IL-2活性，检定它们支持依赖IL-2的细胞系CTLD增殖的能力。表4报告了这种检定的结果。
表4实例1化合物 每分钟计数1微克 250100微克 28010纳克 1，5001纳克 11，000对照组CTLD细胞 3，500实例9本实例描述用实例2化合物刺激人体单核细胞产生IL-2。
静脉全血(加肝素，Evans10国际单位/毫升血)用RPMI以1∶1的比例稀释。稀释血缓缓置于淋巴制剂Nylgard & CO.，挪威奥斯陆，密度1.077克/毫升)中，一份淋巴制剂加两份稀释血，每支试管中加3毫升淋巴制剂和6～7毫升稀释血。这些试管在室温下以1600转/分的转速离心分离30分钟。离心分离后，从界面部分收集单核细胞，用RPMI洗涤三次，把这些细胞重新悬浮在RPMI中，在血球计上用锥虫蓝计数，以测试活力，并加入到富RPMI中。以细胞混合物10%的体积添加范围从50微克/毫升到1纳克/毫升的不同浓度的实例2化合物。从每个样品取出每份0.2毫升(每个样品三份)置于微培养皿孔中(NUNC)。将微培养皿在37℃培养72小时。然后将3H-甲基胸苷1微居/孔(以色列核研究中心)加入培养物中。细胞进一步培养过夜。用细胞收集器收集。在1～10纳克实例2化合物/毫升细胞的范围内，人体单核细胞的增殖量增加了10倍。这表明实例2化合物也能在单核细胞集中诱导IL-2的产生，引起观察到的增殖，和/或在给定的群体中诱导受体形成，这也会导致增殖。
实例10在无菌条件下，向100毫升PBS＊溶液中加入5.0克实例1化合物。将混合物放在高频声波杀菌器(sonicator)中，用高频声波处理(sonicated)4小时。4小时后化合物溶解，得到浓度为10毫克/0.2毫升。
＊NaCl 8.0克KCl 200毫克Na2HPO41150毫克KH2PO4200毫克
CaCl2(无水) 100毫克MgCl2·6H2O 100毫克H2O 足够配成1升实例11用实例10中的PBS100毫升溶解5.0克实例1的化合物，在电动振荡器上振荡4小时。在无菌条件下得到浓度为10毫克/0.2毫升的溶液。
实例12在无菌条件下，利用搅拌，将5.0克实例1化合物溶解在20毫升甘油中。然后加入80毫升PBS，形成含10毫克/0.2毫升的溶液。
已确定，实例1化合物将溶解如下在40%甘油/60%PBS中 6.0克/升在20%甘油/80%PBS中 1.3克/升在10%甘油/90%PBS中 1.0克 升实例13本实例证实口服实例1和2的化合物对诱导淋巴细胞活素的影响。
用这些化合物对6-8周龄的雄性Balb-C小鼠给药，其给药方式是将实例1和2的化合物置于饮用水中，对于实例1的化合物，浓度为10微克/毫升水和1微克/毫升水，而对于实例2的化合物，浓度为25微克，10微克和1微克/毫升水。配制水溶液时，将这些化合物溶于PBS中，使浓度为50微克/毫升PBS，并将得到的溶液稀释到所希望的浓度。将这些化合物在4天周期内给药。每天记录准确的液体摄取量。4天后，将小鼠处死，摘除脾脏，按实例3所述那样加工。这些细胞用含2微克/毫升的Con-A的富集RPMI配成浓度为107细胞/毫升，在37℃培养24小时。收集上清液并测试IL-2含量。
每分钟计数化合物 微克/毫升水 摄取量/只动物 (cpm)实例1 10微克/毫升 248微克实例1 1微克/毫升 23微克 49179〔+50%〕＊实例2 25微克/毫升 406微克 44500〔+35%〕＊实例2 10微克/毫升 123微克 36815实例2 1微克/毫升 17微克 42500〔+30%〕＊对照组 32843＊与对照相比增加的百分率。
将实例1的化合物与粉末状蔗糖充分混合，把混在25毫克粉末状蔗糖中的10微克实例1化合物，放入每只小鼠口中。
24小时后处死这些小鼠，并按如上所述那样处理脾脏。IL-2含量如下试验1 cpmA 250，175〔+117%〕＊B 116，475〔+50%〕＊对照组 110，853
试验2 cpmA 55，382〔+69%〕＊B 41，938〔+28%〕＊C 29，172〔0〕对照组 32，980＊与对照组比较时计算的增加百分率。
这个实验表明，实例1的化合物，当以干的形式给出时或当用水稀释剂水解时，对于诱导淋巴细胞活素产生是有特效的。
实例14二氧化碲(0.5摩尔)悬浮于250毫升1，2-乙二醇(过量)中，在低真空下，于90℃对这种混合物回流加热16小时。得到一种白色结晶产物。将这种物质过滤分离，干燥，然后在150℃(0.25毫米Hg)升华纯化，熔点(mp)为206-210℃。参阅美国化学会志(JACS)，103，2340-2347(1981)。对C4H8O4Te的分析计算C，19.2;H，3.3;O，25.07;Te，51.2。实测值C，19.91;H，3.12;O，24.98;Te，49.99。质谱(MS)m/e250。这个化合物有如下结构
实例15向在-40℃搅拌的TeCl4(0.015摩尔)和1，2-丙二醇(0.03摩尔)的四氢呋喃(70毫升)溶液中，滴加溶于30毫升四氢呋喃的三乙胺(0.06摩尔)。将三乙胺盐酸盐的白色沉淀过滤除去。在室温下浓缩滤液，得到白色油状结晶，在120℃(0.25毫米Hg)升华纯化，质谱(M.S.)m/e＝204，278。
这种化合物有如下结构
实例16利用实例1的步骤，用四氯化碲和相应的二醇制备如下化合物
1，2-丙二醇质谱(M.S.)165;200;239
实例17下列化合物在体外以范围从10微克/毫升细胞到1×10-6微克/毫升细胞混合物的各种浓度进行试验。细胞得自6～8周龄雄性Balb/C小鼠的脾脏。将脾挤压通过一个60目不锈钢粗滤器，使细胞分离。用低渗缓冲剂(0.15M NH4Cl，0.001M KHCO3溶于重蒸馏水中，PH7.21)处理2分钟，使细胞溶解。剩余的细胞漂洗两次，配制成107细胞/毫升富集RPMI。然后，把这些细胞与试验化合物混合，并在7.5%CO2存在下于37℃培养24小时。然后收集上层清液，利用依赖IL-2的细胞系CTLD的增殖，测试IL-2活性。这些实验表明，在1微克/毫升细胞混合物的浓度，这些化合物大多数能对IL-2分泌产生最大影响。
化合物 脾细胞(cpm)实例1 14，600(+472%)实例14 10，300(+304%)实例2 18，000(+605%)Ph2Te(OCOCH3)2＊ 3，500Ph2TeCl2＊ 2，300Ph2Te(OCOPh)2＊ 4，300Ph2TeCl＊ 2，100PhTeCl318，000(+605%)(P-CH3OPh)2TeCl22，148实例16(a) 13，540(+435%)＊在所试验的水平无显著活性实例16(b) 10，650(+318%)实例16(c) 15，720(+516%)实例16(d) 18，075(+608%)TeO217，055(+508%)对照组 2，550实例18这个实例表明实例1，实例16(a)和TeO2这些化合物对诱导人体单核细胞的IL-2受体的刺激效应。
人体单核细胞(MNC)配成106细胞/毫升(RPMI+10%FCS)的溶度。将每份0.2毫升置于微培养盘的复式孔中，将盘在37℃培养24小时。然后，用RPMI对这些孔漂洗两次，把细胞与20国际单位(I.U.)/毫升重组体IL-2重新悬浮于RPMI和10%FCS中。把这些盘进一步培养48小时，且用3H胸苷标记24小时，然后采集细胞。
用3HT摄取量衡量增殖作用，如Cillis等人(《免疫学杂志》(J.Immunol.)120，2027(1978))所述。结果用每分钟计数表达。
试验A(微 实例1 实例1 实例16(a) 实例16(b)TeO2克/毫升) 化合物 化合物 化合物 化合物1 28625 27593 21910 1563 10185×10-1120755 105943 145208 4667 11957×10-1164538 115195 130845 2475 21015×10-220022 5702 8752 2515 16021×10-21952 3963 9543 3108 58831×10-33652 5055 6685 2867 10931×10-43558 4047 6447 5540 11381×10-52474 4063 8177 3442 2146(a)对照组-2338(无化学品)(b)细胞加重组体IL-2(人体)促生物原1.5×10-6单位-3260(c)植物凝血素M(Difco)-195，432
试验B 实例1 实例2 实例14TeO2(微克/毫升) 化合物 化合物 化合物1 23488 9315 3275 26205×10-166910 8688 5405 24027×10-117620 5250 4302 20005×10-25390 5538 4280 32901×10-26057 6418 3077 39281×10-35865 5167 3800 30071×10-44960 5372 2925 23271×10-57155 6397 3645 2242(a)对照组 5573(无化学品)(b)细胞加重组体IL-2(人体)生物原1.5×10-6单位-6858(c)植物凝血素M(Difco)-125，272实例19本实例表明本发明的化合物对人体单核细胞增殖的刺激效应。
人体单核细胞是通过用Ficoll/Hypaque组分使肝磷脂化的血液分层得到的。把单核细胞重新悬浮于富集的RPMI中，漂洗三次，配制成5×105细胞/毫升富集的RPMI的浓度。向细胞中添加范围从0.005微克到5微克/细胞混合物的不同浓度的实例1化合物和实例2化合物。把每份0.2毫升的每种样品放入微培养盘孔中(每个样品同样三份)。微培养盘在37℃培养72小时，然后用H3甲基-胸苷1微居/孔对它们标记，需另加24小时。然后用细胞收集器收集细胞。
实例1 实例1(微克/毫升) 化合物 化合物1 873 47005×10-118515＊33700＊1×10-12735 7085×10-23865 9101×10-23235 13621×10-32553 21801×10-43838 23871×10-53218 2442对照组 2700 2943实例1 实例1 实例16(a)(微克/毫升) 化合物化合物化合物 TeO25微克/毫升 5008 5182 4118 30281微克/毫升 6000 5600 4557 28425×10-120488＊13600＊18415＊47731×10-17037 10382＊12435＊48255×10-25520 5765 5953 58021×10-26898 5712 6000 47301×10-35800 6000 6300 61681×10-45513 6212 4587 5331对照组 3600 6117 6113 4912＊诱导增殖的浓度范围从5×10-1到1×10-1微克。对于TeO2，在试验的任何浓度下都发现无显著效应。
实例2 实例2微克/毫升 化合物 化合物4557 9435×10-118415 23957＊1×10-112435 31424＊5×10-25953 55321×10-26000 29871×10-36300 15101×10-44321 23321×10-55118 2481对照组 4587 2018＊诱导增殖的浓度范围从5×10-1到1×10-1微克。对于TeO2，在试验的任何浓度均发现无显著效应。
实例20用实例4的方法，对人体单核细胞测试其在用PHA诱导后或在来自正常献血者和来自全身性红斑狼疮的患者的未受刺激细胞中产生IL-2的能力。IL-2含量按照实例3的方法，用依赖IL-2的细胞系CTLD测试。结果列于表5。
表5试验对象 由实例1化合物产生IL-2PHA 5微克0.2毫升PBS 150PBS＊1100PBS＊1200PBS＊正常献血者1 - 2.3＊＊43.6 38.4 30.1+ 36.4 48.2 46.2 38.6
2 - 2.1 52.2 50.3 47.1+ 30.4 38.9 54.2 49.83 - 2.1 50.8 46.1 31.3+ 38.9 53.5 44.8 38.3全身性红斑狼疮患者1 - 2.0 37.3 32.1 26.1+ 6.3 24.2 19.7 15.42 - 2.4 43.6 35.1 30.3+ 8.2 28.1 24.0 18.63 - 2.4 19.2 18.1 14.4+ 4.1 23.8 20.2 16.8＊1份0.2毫升含5微克实例1化合物的PBS，用50，100或200份PBS稀释。＊＊在像实例3中那样的上层清液(1∶2稀释)存在下，5×104CTLD细胞的3H胸苷的CPM×10-3。
实例21这个实例提供一种检定法，以检测IL-2受体部位的存在。人体单核细胞在实例1化合物和TeO2存在下培养24小时。这些细胞用PBS洗涤两次，然后按照Uchiyama等人描述的方法〔《免疫学杂志》(J.Immunol.)126，1398(1981)〕，用抗IL-2受体的特种荧光素的抗体培养。结果是在对照组中，2%细胞是阳性的;在PHA存在下，80%细胞是阳性的，而用1微克/毫升实例1的化合物，发现20%细胞是阳性的。已发现，TeO2在1微克/毫升的水平产生5%阳性细胞。
实例22已确定了实例1化合物对西尼日病毒(WNV)感染的影响。西尼日病毒是黄病毒群中的一种toga病毒，是一种正单股链的RNA病毒，当对小鼠做腹膜腔内注射时，由于对中枢神经系统的广泛损坏，经常在5～8天内将其杀死。对于本研究，给ICR小鼠(3周龄)以103或104LD50单位/只小鼠的浓度向腹膜腔内注射这种病毒。在-1天(病毒注射前一天)和病毒注射后6天进行10微克/0.2毫升PBS/只小鼠的实例1化合物注射。表A列出一次这样的实验的初步结果。可以看出，在8天后，只注射病毒的动物全部死亡，而接受用实例1化合物处理的五只动物中，有三只还活着。
表A处理 103LD50103LD50104LD50104LD50O注射实例 否 是 否 是 是1化合物存活数/动物总数 0/6 3/5 0/6 3/5 6/6在第二次实验中，对小鼠用103LD50病毒向腹膜腔内注射，并在-1，1，2和4天注射实例1化合物(1微克/0.2毫升PBS/只小鼠)。一次这样的实验在注射后第8天的初步结果列于表B。可以看到，在第8天，只注射病毒的动物全部死亡，而接受实例1化合物的五只动物中有三只还活着。在剩下的三只中有两只又存活了8天，而第三只则仍然活着，未表现出任何临床症状。
表B处理 腹膜腔内注射 腹膜腔内注射 实例1化合物103LD50103LD50+实例1化合物存活数/总数 0/8 3/5 5/5实例23本实例表明，西尼日病毒同ICR小鼠巨噬细胞的培养物相互作用造成产生性(productive)感染。不同数量的实例1化合物(5微克，1微克，0.1微克)用小鼠巨噬细胞单层培养24小时。24小时后，用5微克实例1化合物培养的巨噬细胞死亡，而其它的则仍未受影响。然后将所有培养物用104PFU/盘(Plate)感染。培养72小时后，收集上层清液，对病毒做Vera细胞滴定。表A列出一次这样的实验的初步结果。可以看到，巨噬细胞培养物用1微克实例1化合物培养，导致病毒产率降低40倍，而用0.1微克实例1化合物/盘(plate)培养，导致病毒产率降低十倍。
表A处理 病毒产率(PFU/毫升)对照组(只有病毒) 2×104/毫升实例1化合物，1微克/盘 5×102/毫升实例1化合物，0.1微克/盘 2×103/毫升
权利要求
1.具有如下化学式的化合物的制备工艺，其特征在于
其中Q是Te或Se；t是1或0，u是1或0，v是1或0；R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9是相同的或不同的，而且可独立选自下列基团氢，1至5个碳原子的羟烷基，羟基，1至5个碳原子的烷基，卤素，1至5个碳原子的卤代烷基，羧基，2至10个碳原子的烷基羰基烷基，1至5个碳原子的烷酰氧基，1至5个碳原子的羧烷基，酰基，酰胺基，氰基，1至5个碳原子的酰胺基烷基，2至10个碳原子的N-单烷基酰胺基烷基，4至10个碳原子的N，N-二烷基酰胺基烷基，1至5个碳原子的氰基烷基，1至5个碳原子的烷氧基，2至10个碳原子的烷氧基烷基和-COR10，其中R10是1至5个碳原子的烷基；X是卤素，所说的工艺包括(a)制备四卤化碲或四卤化硒与具有如下化学式的至少有两个羟基的化合物的混合物
其中R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9，与上文所述相同；(b)使四卤化碲或四卤化硒在乙腈存在下与至少有两个羟基的化合物反应；(c)然后回收产物。
2.权利要求
1所定义的工艺，其中，所得到的至少有两个羟基的化合物是乙二醇。
3.权利要求
1所定义的工艺，其中，所得到的至少有两个羟基的化合物是1，2-丙二醇。
4.权利要求
1所定义的工艺，其中，所得到的至少有两个羟基的化合物是2，3-丁二醇。
5.权利要求
1所定义的工艺，其中，所得到的至少有两个羟基的化合物是1，3-丙二醇。
6.权利要求
1所定义的工艺，其中，所得到的至少有两个羟基的化合物是1，4-丁二醇。
7.产生权利要求
1化合物水溶液的工艺，其中，把该化合物放入水载体中，进行足够长时间的超声或机械搅拌，以使化合物溶解。
专利摘要
已发现，某些碲化合物具有刺激在体内和体外产生细胞分裂素及其受体的能力。这些化合物可以用于治疗某些肿瘤，自身免疫疾病，免疫病和传染病。
文档编号A61K31/66GK86101696SQ86101696
公开日1986年12月24日 申请日期1986年3月15日
发明者迈克尔·阿尔贝克, 本杰明·斯雷德尼 申请人:科学诊断公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan