74]实施例10
取牛血清白蛋白150mg，加入10mlpH7.4的醋酸盐缓冲液溶解得牛血清白蛋白溶液。取鬼臼毒素10mg，加入50mg大豆磷脂SlOOj Iml 二氯甲烷，通过加热、超声将其溶解，并与上述牛血清白蛋白溶液混合，探头超声5min (功率200-600W)，将其旋蒸以除去有机溶剂，加入冻干保护剂配制成含10%葡萄糖的纳米粒水溶液,加入0.2ml油酸钠溶液(5-10mg/ml)作为电位调节剂，在无菌条件下冷冻并冻干24小时，得疏松块状冻干品。取适量加水复溶，得到纳米粒溶液，粒径为200.5nm, PDI为0.177。
[0075]实施例11
取人血清白蛋白lOOmg，加入1ml注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取替尼泊苷10mg，加入10mg蛋黄卵磷脂E80溶于约1ml甲醇，40°C搅拌I小时，得浅黄色澄清溶液。旋蒸除去甲醇即得替尼泊苷磷脂复合物，用二氯甲烷Iml将其溶解，并与上述人血清白蛋白溶液混合，探头超声Imin制成混悬液,然后将混悬液在高压乳勻机内乳勻5次,将其旋蒸以除去有机溶剂，得到纳米粒溶液，加入1.0g海藻糖作为冻干保护剂，-30°C冷冻干燥48小时，得疏松块状冻干品。取适量加水复溶，测得粒径为178.5nm，PDI为0.189。
[0076]实施例12替尼泊苷白蛋白纳米粒骨髓抑制毒性实验
药品:按“实施例1”制备的制剂与按市售替尼泊苷注射液处方(含大量Cremophor EL)配置的原药溶液。
[0077]动物:雄性Wista大鼠，体重170_180g，随机分为2组(制剂组和原药组)，每组12只。
[0078]在给药前先将所有大鼠眼眶取血约0.5ml，全血置于EDTA-2K真空采血管内，轻微晃动，用血细胞分析仪测定血常规。取血后，原药组和制剂组大鼠分别按10 mg/kg的剂量尾静脉注射替尼泊苷原药溶液和替尼泊苷白蛋白纳米粒制剂；并于注射后第三天取血，与给药前相同方法测定血常规。
[0079]以白细胞计数为标准考察骨髓抑制情况，从图3可以看出:给药后制剂组的白细胞数约下降17%，原药组白细胞数下降54%。本发明制备的白蛋白纳米粒与原药相比明显降低了鬼白毒素类药物(替尼泊苷)的毒性。
[0080]实施例13细胞摄取实验
药品:按“实施例1”制备的制剂与按市售替尼泊苷注射液处方(含大量Cremophor EL)配置的原药溶液。
[0081]实验分为2组:原药组、制剂组。用无血无抗的DMEM高糖培养基将上述2组溶液稀释至0.lmg/ml,给药前均用0.22 Mm的无菌滤头过滤除菌。每个实验组设0.5、1、2、4、6h，5个时间点，每点3个复孔。
[0082]取正常生长的B16细胞，胰酶消化，培养基稀释至适宜浓度，按每孔约IxlO6个细胞(2ml)接种于6孔板内，37°C恒温，5 % CO2饱和湿度条件下培养24 h后给药。药物与细胞共培养一定时间后吸出含药培养基，每孔加少量生理盐水，-SO0C /37°C反复冻融使细胞破裂，孔内液体一部分用于HPLC检测药物浓度，另一部分用BCA试剂盒测定蛋白含量。以每mg蛋白中所含药物量表征细胞对药物的摄取情况。
[0083]从图4可以看出，肿瘤细胞对纳米粒制剂的摄取量远高于原药，制剂的透膜能力显著增强。正是磷脂复合物与白蛋白纳米粒双重优势的体现。
[0084]实施例14替尼泊苷白蛋白纳米粒体内分布实验
药品:按“实施例1”制备的制剂与按市售替尼泊苷注射液处方(含大量Cremophor EL)配置的原药溶液。
[0085]雄性昆明小鼠30只(体重30g左右)，随机分成2组，每组15只。实验前禁食一夜(>12h)，自由饮水，分别尾静脉注射给予替尼泊苷原药溶液和纳米粒制剂，给药剂量15mg/kg。分别在给药后15min，lh，4h处死(每个时间点5只)，取心，肝，脾，肺，肾，血。脏器用生理盐水洗净，滤纸吸干水分后，置于_4°C冻存。按2ml/g比例加生理盐水匀浆，取匀浆液150 μ 1，加入15 μ I内标溶液(20.Aug/ml依托泊苷)，加入乙醚1ml，涡旋1min (萃取)，5500rpm离心5min，分离上清液(乙醚层)，吹干，残留物用150 μ L流动相复溶，HPLC测定，记录主药峰面积Α,内标峰面积Ai。
[0086]从图5可以看出，与原药相比，本发明制备的纳米粒具有明显的肝、脾、肺部靶向性。
[0087] 与此相对应，Jing Zhou等采用类似方法制备的卩比柔比星白蛋白纳米粒(NovelLipid Hybrid Albumin Nanoparticle Greatly Lowered Toxicity of Pirarubicin，Mol.Pharmaceutics 2013，10:3832 - 3841)静脉注射后的体内分布，与吡柔比星普通注射液相t匕，在肝、脾的药物浓度相差不多，在肺中明显减少。然而，本发明的鬼白毒素白蛋白纳米粒的肝、脾、肺部靶向性完全不同。
【主权项】
1.一种含鬼白毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒，其中包含鬼白毒素类药物与磷脂形成的复合物及白蛋白，基于重量份计，鬼臼毒素类药物I份、磷脂1~50份，白蛋白2~100份；优选地，鬼臼毒素类药物I份、磷脂2~10份、白蛋白5~50份。
2.根据权利要求1所述的含鬼白毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒，其特征在于所述磷脂选自天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂或它们的混合物。
3.根据权利要求1所述的含鬼白毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒，其特征在于所述白蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白、半乳糖化白蛋白及其他种类白蛋白。
4.一种根据权利要求1含鬼白毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒的冻干制剂，其特征在于包含冻干保护剂；冻干保护剂用量按纳米粒水溶液总重量计为100份总重量加入0-20份冻干保护剂；优选地2-20份冻干保护剂。
5.一种根据权利要求1含鬼白毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒的药物制剂，其特征在于包含鬼白毒素类药物及其衍生物、白蛋白、冻干保护剂，其他药学上可接受的辅料适量。
6.一种制备权利要求1的含鬼白毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒的方法，其特征包括下述步骤: (1)取鬼白毒素类药物和磷脂，溶于脂溶性溶剂中，(如是鬼白毒素类药物的盐酸盐，先用如碳酸氢钠等的碱性溶液中和盐酸再和磷脂溶于脂溶性溶剂中)，在温度约30°C?50°C，搅拌反应约0.1?2小时； (2)减压浓缩除去脂溶性溶剂；或者不除去脂溶性溶剂，直接作为步骤(3)中的水不溶性有机溶剂使用，直接跳到第(4)步； (3)用适当的水不溶性有机溶剂溶解上述药理活性物质，作为油相； (4)取适量白蛋白，溶解于适量的水性溶剂中，作为水相； (5)油相与水相混合，搅拌或超声形成乳浊液； (6)将(5)所述的乳浊液用高压乳匀机、微射流均质机、高剪切混合器、高剪切搅拌器、超声处理器或类似设备制备成纳米乳剂； (7)减压蒸发除去有机溶剂，即得。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(7)的产品中可加入冷冻干燥赋形剂和/或其他赋形剂/辅料，制成冻干粉末。
8.权利要求1的所述的含鬼白毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒在制备治疗癌症药物中的应用。
9.权利要求1的所述的含鬼白毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒在制备降低药物毒性的药物中的应用。
10.权利要求1的所述的含鬼白毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒在制备具有肝肺靶向性的药物中的应用。
【专利摘要】一种含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒，其中包含鬼臼毒素类药物与磷脂形成的复合物及白蛋白，基于重量份计，鬼臼毒素类药物1份、磷脂1~50份，白蛋白2~100份。所述磷脂复合物白蛋白纳米粒既能显著降低鬼臼毒素类药物毒性，尤其是骨髓抑制毒性，同时具有肝、肺靶向性。
【IPC分类】A61K47-24, A61K9-14, A61K31-7048, A61P35-00, A61K47-42, A61K31-365
【公开号】CN104523597
【申请号】CN201410770026
【发明人】龚涛, 张志荣, 和心依
【申请人】四川大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月15日