)。
[0571] LCMS 方法 A: tR = 0? 36min, m/z = 335. 0 [M+H] +
[0572] 实例26 :5-溴-N-吡啶-3-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0573] 由中间体Y26
[0575] 4 NMR(DMS0-d6,400MHz) S :13.47(lH，br s), 10.60(lH，s)，8.8h8.80(lH，d，J =2. 4Hz), 8. 3 1-8. 30 (1H, dd, J = 4. 8, 1. 2Hz) , 8. 1 1 -8. 09 (1 H, d, J =8. 8Hz) , 8. 02-8. 01 (1H, d, J = 2. 0Hz) , 7. 9 1 - 7. 88 (1H, dd, J = 8. 0, 2. 0Hz), 7. 57-7. 55 (1H, d, J = 8. 0Hz), 7. 41-7. 38 (1H, dd, J = 8. 4, 4. 8Hz)。
[0576] LCMS 方法 A:tR = 0? 33min, m/z = 321. 0[M+H] +
[0577] 实例27 :5-溴-N-(3-甲基-吡啶-2-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0578] 由中间体Y27
[0580] 屮匪R(DMS0, 400MHz) S : 10. 63(1H，br s)，8. 28(1H，s)，7. 96-7. 95(1H，d，J =1. 6Hz) , 7. 88-7. 86 (1H, dd, J = 1.6,8. 0Hz) , 7. 79-7. 77 ( 1H, d, J = 6. 8Hz)，7. 57-7. 55 (1H, d, J = 8. 4Hz)，7. 29-7. 26 (1H, t, J = 5. 2Hz)，2. 30 (3H, s)。
[0581] LCMS 方法 A: tR = 0? 36min, m/z = 335. 0 [M+H] +
[0582] 实例28 :5_溴-N-(4-甲基-噻唑-2-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0583] 由中间体Y28
[0585] 4 NMR(DMS0-d6, 400MHz) S : 13. 43 (1H, br s)，12. 66 (1H, s)，7. 99-7. 98 (1H, d, J =2. 0Hz) , 7. 87-7. 84 (1H, dd, J = 8. 0, 2. OHz) , 7. 56-7. 54 (1H, d, J = 8. 4Hz), 6. 81-6. 81 (1H, d, J = 0? 8Hz), 2. 27 (3H, s)。
[0586] LCMS 方法 A:tR = 0? 52min, m/z = 341. 0[M+H] +
[0587] 实例29 :5-溴-N-喹啉-2-基-邻氨甲酰苯甲酸
[0588] 由中间体Y29
[0590] 屯匪尺(0150-(16,4001抱）8:13.40(111，1^8)，11.27(111，8)，8.39(211，111)，7.99-7. 92 (2H，m)，7. 87-7. 84 (1H，dd，J = 2. 0, 8. 4Hz)，7. 80-7. 50 (4H，m)。
[0591] LCMS 方法 A:tR = 0? 51min, m/z = 370. 9[M+H] +
[0592] 实例30 :5-溴-N-(5, 6-二氯-吡啶-2-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0593] 由中间体Y30
[0594]
[0595] 4 匪R(DMS0-d6,400MHz) S :13.40(lH，br s)，11.6(lH，s)，8. 17-8. 12(2H，m)， 7. 98-7. 97 (1H, d, J = 2. 0Hz), 7. 85-7. 83 (1H, dd, J = 1.6, 8. OHz), 7. 53-7. 50 (1H, d, J = 8. 4Hz)。
[0596] LCMS 方法 A: tR = 0? 68min, m/z = 388. 8 [M+H] +
[0597] 实例31 :5_溴-N-(6-甲基-吡啶-3-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0598] 由中间体Y31
[0600] :H NMR(DMS0-d6, 400MHz) 8 ： 10. 49 (1H, s), 8. 67-8. 66 (1H, d, J = 2. 4Hz ),8. 00-7. 95 (2H, m), 7. 89-7. 87 (1H, dd, J = 2. 0, 8. OHz) 7. 55-7. 53 (1H, d, J = 8. OHz)，7. 24-7. 22 (1H, d, J = 8. 4Hz)，2. 49 (3H, s)。
[0601] LCMS 方法 A: tR = 0? 34min, m/z = 335. OM+H] +
[0602] 实例32 :5_溴-N-(6-甲基-哒嗪-3-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0603] 由中间体Y32
[0605] 4 NMR(DMS0-d6, 400MHz) S : 13.42 (lH，br s), 11.45 (lH，s), 8. 27-8. 25 (lH，d，J =9. 2Hz) , 8. 00-7. 99 ( 1H, d, J = 2. OHz) , 7. 8 7-7. 8 5 ( 1 H, dd, J = 8. 0, 2. OHz), 7. 61-7. 59 (1H, d, J = 8. 8Hz), 7. 54-7. 52 (1H, d, J = 8. 4Hz), 2. 49 (3H, s)。
[0606] LCMS 方法 A: tR = 0? 39min, m/z = 336. 0 [M+H] +
[0607] 实例33 :5-溴-N-(4, 6-二甲基-吡啶-2-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0608] 由中间体Y33
[0609]
[0610] :H NMR (DMS0-d6, 400MHz) 8 ： 13. 29 (1H, br, s), 10. 79 (1H, s), 7. 94 (1H, s), 7. 82-7. 80 (2H, d, J = 8. 4Hz), 7. 46-7. 44 (1H, d, J = 7. 6Hz), 6. 84 (1H, s), 2. 34 (3H, s), 2. 29 (3H, s)
[0611] LCMS 方法 A: tR = 0? 40min, m/z = 348. 9 [M+H] +
[0612] 实例34 :5_溴-N_(2-甲基-嘧啶-4-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0613] 由中间体Y34
[0615] 4 NMR(DMS0-d6, 400MHz) S : 13.40 (lH，br s), 11.41 (lH，s), 8. 59-8. 58 (lH，d，J =5. 6Hz) ,7.98-7. 94 (2H，m) ,7.85-7. 83 (lH，dd，J = 1.6, 8.0Hz) ,7.51-7. 49 (lH，d，J = 8. 0Hz)，2. 51(3H，s)。
[0616] LCMS 方法 A: tR = 0? 38min，m/z = 336. 0 [M+H] +
[0617] 实例35 :5-溴-N_(6-甲基-嘧啶-4-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0618] 由中间体Y35
[0620] 屯 NMR (DMS0-d6, 400MHz) S : 13. 46 (1H，s)，11. 28 (1H，s)，8. 74 (1H，s)，8. 04 (1H，s) ，8. 00 (1H, s)，7. 87-8. 85 (1H, d, J = 7. 6Hz)，7. 51-7. 49 (1H, d, J = 8. 0Hz)，2. 46 (3H, s)。
[0621] LCMS 方法 A:tR = 0? 41min, m/z = 336. 0[M+H] +
[0622] 实例36 :N_ (2-甲氧基-吡啶-4-基）-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
[0623] 由中间体Y36
[0624]
[0625] $匪1?(0150-(16,40011^)8:13.69(111，1^8)，10.78(111，8)，8.18(111，8)，8.09-8. 05 (2H, t, J = 7. 2Hz)，7. 82-7. 80 (1H, d, J = 8. 0Hz)，7. 17 (1H, s)，7. 15-7. 14 (1H, d, J = 5. 6Hz), 3. 83(3H, s)。
[0626] LCMS 方法 A:tR = 0? 45min, m/z = 341. 1 [M+H] +
[0627] 实例37 :N_ (6-甲氧基-吡啶-2-基）-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
[0628] 由中间体Y37
[0630] 4匪1?(0150-(16,4001抱）8:13.55(111，1^8)，10.84(111，8)，8.14(111，8)，8.01-8. 03 (1H, d, J = 8. 0Hz)，7. 76-7. 72 (3H, m)，6. 56-6. 55 (1H, d, J = 6. 8Hz)，3. 81 (3H, s)。
[0631] LCMS 方法 A:tR = 0? 62min, m/z = 341. 1 [M+H] +
[0632] 实例38 :N_吡啶-2-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
[0633] 由中间体Y38
[0635] :H NMR(DMS0-d6, 400MHz) 8 ： 13. 55 (1H, br s) , 9. 11-9. 08 (1H, t, J = 6. 0Hz), 8. 51-8. 50 (1H, d, J = 4. 0Hz), 8. 07 (1H, s), 8. 02-8. 00 (1H, d, J = 8. 0Hz), 7. 79-7. 73 (2H, m), 7. 53-7. 51 (1H, d, J = 7. 6Hz), 7. 29-7. 26 (1H, q, J = 4. 0Hz), 4. 54-4. 53 (2H, d, J =6. 4Hz)。
[0636] LCMS 方法 A: tR = 0? 35min m/z = 325. 1 [M+H] +
[0637] 实例39 :N_吡啶-4-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
[0638] 由中间体Y39
[0640] :H NMR (DMS0-d6, 400MHz) S : 13. 62 (1H，s)，9. 10-9. 07 (1H，t，J = 6. 0Hz) , 8. 52-8. 51 (2H, d, J = 5. 6Hz) , 8. 08 (1H, s) , 8. 02-8. 00 (1H, d, J = 8. OHz), 7. 74-7. 72 (1H, d, J = 8. OHz), 7. 43-7. 41 (2H, d, J = 5. 6Hz), 4. 49-4. 47 (2H, d, J = 6. OHz) 〇
[0641] LCMS 方法 450: tR = 0? 34min, m/z = 325. 1 [M+H] +
[0642] 实例40 :N_吡啶-3-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
[0643] 由中间体Y40
[0645] 4 NMR(DMS0-d6, 400MHz) S :9. 12-9. 10(1H, t, J = 5. 8Hz), 8. 72(1H, s), 8. 64-8 .62 (1H, d, J = 4. 4Hz), 8. 14-8. 12 (1H, d, J = 8. OHz), 8. 08 (1H, s), 8. 02-8. 00 (1H, d, J = 7. 6Hz), 7. 73-7. 71 (1H, d, J = 8. OHz), 7. 67-7. 63 (1H, q, J = 4. 4Hz), 4. 56-4. 54 (2H, d, J = 6. OHz) 〇
[0646] LCMS 方法 A: tR = 0? 34min, m/z = 325. 1 [M+H] +
[0647] 实例41 :N_ (6-甲基-吡啶-2-基）-5-丙基-邻氨甲酰苯甲酸
[0648] 由中间体Y43
[0650] 屮 NMR(DMS0-d6, 400MHz) S : 12. 88 (1H, br s), 10. 70 (1H, s), 7. 97-7. 95 (1H, d, J =8. OHz), 7. 70-7. 66 (1H, t, J = 7. 8Hz), 7. 63 (1H, s), 7. 42 (2H, s), 6. 98-6. 97 (1H, d, J = 7. 6Hz), 2. 66-2. 62 (2H, t, J = 7. 8Hz), 2. 39 (3H, s), 1. 66-1. 57 (2H, m), 0? 92-0. 89 (3H, t, J =7. 2Hz)。
[0651] LCMS 方法 A: tR = 0? 48min, m/z = 299. 1 [M+H] +
[0652] 实例42 :N5_异丙烯基-N-(6-甲基-吡啶-2-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0653] 由中间体Y42
[0655]屯 NMR(DMS0-d6, 400MHz) S : 10. 81 (1H, s), 7. 96-7. 95 (1H, m), 7. 90 (1H, s), 7. 74-7 ?69 (2H, m)，7. 51-7. 49 (1H, d, J = 8Hz)，7. 01-6. 99 (1H, d, J = 6. 8Hz)，5. 55 (1H, s)，5. 23 (1H ,s), 2. 40 (3H, s), 2. 15 (3H, s) 〇
[0656] LCMS 方法 A: tR = 0? 45min, m/z = 297. 2 [M+H] +
[0657] 实例43 :N5_异丙基-N-(6-甲基-吡啶-2-基）_邻氨甲酰苯甲酸
[0658] 由中间体Y47
[0660] 屯 NMR (DMS0-d6, 400MHz) S : 12. 90 (1H, br s)，10. 70 (1H, s)，7. 96-7. 94 (1H, d, J = 8. 0Hz), 7. 70-7. 66 (2H, t, J = 7. 8Hz), 7. 49-7. 43 (2H, m), 6. 98-6. 96 (lh, d, J = 7. 6Hz), 3. 1 7-2. 96 (1H, m), 2. 39 (3H, s), 1. 24 (6H, d, J = 8. 8Hz) 〇
[0661] LCMS 方法 A: tR = 0? 47min, m/z = 299. 2 [M+H] +
[0662] 实例44 :2-((2-甲基嘧啶-4-基）氨基甲酰基）-5_(三氟甲基）苯甲酸
[0663] 由中间体Y44
[0665] 屯 NMR (DMS0-d6, 400MHz) S : 11. 52 (1H, s)，8. 65-8. 63 (1H, d, J = 5. 6Hz)，8. 15 ( 1H，s)，8. 06-8. 04 (1H, d, J = 8. 0Hz)，8. 01-8. 00 (1H, d, J = 5. 2Hz)，7. 79-7. 77 (1H, d, J = 7. 6Hz), 2. 53(3H, s)。
[0666] LCMS 方法 A:tR = 0? 43min, m/z = 326. 1 [M+H] +
[0667] 实例45 :2-((4,5_二甲基嘧啶-2-基）氨基甲酰基）-5_(三氟甲基）苯甲酸
[0668] 由中间体Y45
[0670] 屮匪R(DMS0-d6, 400MHz) S : 13. 44(1H，br s)，10. 97(1H，s)，8. 21 (1H，s)，8 .12(1H, s), 7. 97-7. 96(1H, d, J = 7. 2Hz), 7. 62-7. 60 (1H, d, J = 8. 0Hz), 2. 17 (3H, br s), 2. 10(3H, s) 〇
[0671] LCMS 方法 A:tR = 0? 51min, m/z = 340. 1 [M+H] +
[0672] 实例46 :2-((5,6,7,8_四氢喹啉-2-基）氨基甲酰基）-5_(三氟甲基）苯甲酸
[0673] 由中间体Y46
[0675] 屯 NMR(DMS0-d6, 400MHz) S : 13. 49-13. 46 (1H，d，J = 10Hz)，10. 92 (1H，s)，8. 10 ( 1H，s)，8. 00-7. 98 (1H, d, J = 7. 6Hz)，7. 92-7. 90 (1H, d, J = 7. 6Hz)，7. 74-7. 72 (1H, d, J = 7. 6Hz)，7. 50-7. 48 (1H，d，J = 8. 0Hz)，2. 72-2. 60 (4H，m)，1. 81-1. 73 (4H，m)。
[0676] LCMS 方法 A:tR = 0? 51min, m/z = 365. 1 [M+H] +
[0677] 实例47:2-((6-甲基吡啶-2-基）氨基甲酰基）-4, 5-双（三氟甲基）苯甲酸
[0678] 由中间体X19
[0680] 使用THF/H20 (1:1)中的一水合氢氧化锂合成
[0681] 屯 NMR (DMS0-d6, 400MHz) S : 14. 0 (1H，s，br)，11. 29 (1H，s)，8. 33 (1H，s)，8. 23 (1H， s), 7. 98 (1H, s) 7. 75-7. 71 (1H, t, J = 8. 0Hz), 7. 039-7. 021 (1H, d, J = 7. 2Hz), 2. 41 (3H, s) 〇
[0682] LCMS 方法 A: tR = 0? 6 lmin, m/z = 392. 9 [M+H] +
[0683] 实例48 :2-((5, 6, 7, 8-四氢喹啉-2-基）氨基甲酰基）_4, 5-双（三氟甲基）苯 甲酸
[0684] 由中间体X20
[0686] 使用THF/H20 (1:1)中的一水合氢氧化锂合成
[0687] 屯 NMR (DMS0-d6, 400MHz) S : 13. 90 (1H，br)，11. 05 (1H，s)，8. 33 (1H，s)，8. 20 (1H，s )，7. 92-7. 90 (1H，d，J = 8. 4Hz)，7. 52-7. 50 (1H，d，J = 8. 0Hz)，2. 72-2. 71 (4H，m)，1. 76-1. 7 4 (4H，m) 〇
[0688] LCMS 方法 A:tR = 0? 66min, m/z = 433. 1 [M+H] +
[0689] 实例49 :2_((5, 6-二甲基吡啶-2-基）氨基甲酰基）_4, 5-双（三氟甲基）苯甲 酸
[0690] 由中间体S52
[0692] 将 Li0H.H20(12mg，0.285mmol)添力卩至 THF/H20(1:1) (3.0mL)中的中间体 S52(60mg，0. 142mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌lh。然后，在真空中除去THF 并用IN HC1酸化粗材料。将所得固体过滤，用戊烷洗涤并在减压下干燥，以提供呈白色固 体的标题化合物（45mg，78% )。
[0693] NMR (DMS0-d6, 400MHz) S : 11. 41 (1H，s)，8. 30 (1H，s)，8. 23 (1H，s)，7. 92-7. 90 (1 H, d, J = 7. 2Hz), 7. 57-7. 55 (1H, d, J = 8. 4Hz), 2. 36 (3H, s), 2. 22 (3H, s) 〇
[0694] LCMS 方法 A: tR = 0? 6 lmin, m/z = 407. 0 [M+H] +
[0695] 实例50 :2-((2-甲基嘧啶-4-基）氨基甲酰基）-4,5_双（三氟甲基）苯甲酸
[0696] 由中间体T1
[0698] 在 0 °C 下，向在 DCM(3. OmL)中的中间体 T1 (100mg，0. 331mmol)和 2-甲基嘧 啶-4-胺（36mg，0. 331mmol)的溶液中添加 HATU(188mg，0. 496mmol)和 DIPEA(0. 18mL， 0. 993mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18h。反应完成后（通过TLC监测），将反应混合 物用水（50mL)稀释，用Et0Ac(50mL)萃取并用无水Na 2S04干燥。将粗产物通过柱色谱法纯 化，以提供呈白色固体的标题化合物（l〇〇mg，77% )。
[0699] 屯 NMR(DMS0-d6, 400MHz) S : 14.07 (lH，br), 11.61 (lH，s), 8. 63-8. 62 (lH，d，J = 6. 0Hz)，8. 36 (1H，s)，8. 30 (1H，s)，7. 95 (1H，s)，2. 49 (3H，s)。
[0700] LCMS 方法 A: tR = 0? 55min, m/z = 393. 9 [M+H] +
[0701] 实例51 :2-((2,6-二甲基吡啶-4-基）氨基甲酰基）-5-(三氟甲基）苯甲酸
[0702] 由中间体Y48
[0703]
[0704] 屯 NMR (DMS0-d6, 400MHz) S : 14. 0 (1H，br)，11. 56 (1H，s)，8. 23 (1H，s)，8. 16-8. 14 ( 1H, d, J = 8. 0Hz), 7. 87-7. 85 (1H, d, J = 8. OHz), 7. 73 (2H, s), 2. 61 (6H, s) 〇
[0705] LCMS 方法 A: tR = 0? 42min, m/z = 339. 0 [M+H] +
[0706] 蛋白质的表达与纯化
[0707] 使用游离型表达载体pCEP-PU在HEK 293细胞中表达包括Q99425的前肽（34-77) 和C-末端6xHis标签的人类分拣蛋白细胞外结构域（78-755)。根据制造商的说明书，在 Ni 2+NTA-琼脂糖（凯杰公司（Qiagen))柱上从培养基中纯化表达的分拣蛋白-细胞外结 构域。
[0708] 使用pcDNA 3. 1 (-)表达载体在HEK 293F细胞中表达人类颗粒蛋白前体（P28799 ; 18-593)。通过在capto_Q(GE医疗集团（GE-healthcare))上进行捕获而从培养基中纯化。 用2M硫酸铵沉淀从柱上洗脱的级分并离心。将沉淀溶解于PBS中并在S200大小排阻色谱 柱上分离。通过SDS-PAGE鉴定具有颗粒蛋白前体的级分并相应地合并。
[0709] 使用pGEX表达质粒在大肠杆菌BL21细胞中表达作为至GST的C-末端融合的人 类0-神经生长因子的原始部分（propart) (P01138 ;19-121)。通过添加ImM IPTG而启动 诱导并继续4小时。通过离心收获细胞并使用来自诺瓦基公司（Novagen)的"重镑蛋白质 提取（block buster protein extraction)"试剂盒溶解。根据来自制造商的说明书，使用 GSTtrap柱（GE医疗集团）纯化澄清裂解液。
[0710] 小鼠his-分拣蛋白购自R&D系统公司（R&D Systems)。
[0711] hSortilin亲和性测定
[0712] 使用基于SPA的测定形式，通过测量3H-神经降压素结合至hSortilin的置换而 确定化合物亲和性。
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