作进一步的阐述和说明。
[0043]实施例1:
[0044]一种传染性胃肠炎病毒灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤:
[0045]将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37°C的条件下环化Ih后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2?7.6，得到所述的BEI溶液，过滤，4°C保存备用。
[0046]首先，将传染性胃肠炎病毒按体积分数3%的接种量接种在ST宿主细胞中，当宿主细胞生长到90%时，将普通培养液更换为维持液，维持观察48后，收集病毒，得到抗原液；
[0047]然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7%的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.02%，充分混匀后，将混合液放置在温度为27°C的条件下，振荡灭活12h ;
[0048]最后，灭活结束后，加入lmol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活lh，得到所述的灭活疫苗。
[0049]将本发明12h的灭活疫苗、未处理的传染性胃肠炎病毒(作为阳性对照)、和病毒稀释液(作为阴性对照)接种到健康的ST细胞中，盲传到第三代观察细胞病变。
[0050]使用显微镜观察细胞状态。结果如图1和图2所示，图1中细胞量少，阳性全部病变；图2中细胞量多，符合一般细胞生长状态，阴性未病变；而本发明12h的灭活疫苗显示灭活彻底，具体如图3所示，细胞数量多，同阴性对照一致。
[0051]实施例2
[0052]—种猪圆环病毒灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤:
[0053]将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37°C的条件下环化Ih后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2?7.6，得到所述的BEI溶液，过滤，4°C保存备用。
[0054]首先，将猪圆环病毒按体积分数3%的接种量接种在PK-15宿主细胞中，当宿主细胞生长到90%时，将普通培养液更换为维持液，维持观察72后，收集病毒，得到抗原液；
[0055]然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7%的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.02%，充分混匀后，将混合液放置在温度为27°C的条件下，振荡灭活12h ;
[0056]最后，灭活结束后，加入lmol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活lh，得到所述的灭活疫苗。
[0057]将本发明12h的灭活疫苗、未处理的猪圆环病毒(作为阳性对照)、和病毒稀释液(作为阴性对照)接种到健康的PK-15细胞中，盲传到第三代观察细胞病变。
[0058]利用间接免疫荧光技术，染色后，利用荧光显微镜观察荧光情况。阳性全部有翠绿色荧光，阴性和灭活样品无荧光；本发明12h的灭活疫苗显示灭活彻底。
[0059]实施例3
[0060]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤:
[0061 ] 将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37°C的条件下环化Ih后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2?7.6，得到所述的BEI溶液，过滤，4°C保存备用。
[0062]首先，将猪繁殖与呼吸综合征病毒按体积分数3%的接种量接种在Marcl45宿主细胞中，当宿主细胞生长到90%时，将普通培养液更换为维持液，维持观察72后，收集病毒，得到抗原液；
[0063]然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7%的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.025%，充分混匀后，将混合液放置在温度为25°C的条件下，振荡灭活12h ;
[0064]最后，灭活结束后，加入lmol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活lh，得到所述的灭活疫苗。
[0065]将本发明12h的灭活疫苗、未处理的猪繁殖与呼吸综合征病毒(作为阳性对照)、和病毒稀释液(作为阴性对照)接种到健康的Marcl45细胞中，盲传到第三代观察细胞病变。
[0066]利用显微镜观察细胞情况。阳性全部病变，阴性和灭活样品未病变；本发明12h的灭活疫苗显示灭活彻底。
[0067]尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。
【主权项】
1.一种灭活疫苗的制备方法，其特征在于它包括以下步骤: 首先，制备抗原液； 然后，向抗原液中加入浓度为0.2mol/L的BEI和质量分数为3.7%的甲醛。以使BEI的终浓度为5mmol/L、甲醛的最终质量分数为0.02%?0.025 %，充分混匀后，将混合液放置在温度为25?27°C的条件下，振荡灭活12?36h ; 最后，灭活结束后，加入lmol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为5mmol/L，中和并终止灭活lh，得到所述的灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述抗原液选自圆环病毒液、猪细小病毒液、传染性胃肠炎病毒液、流行性腹泻二联病毒液或猪繁殖与呼吸综合征病毒液。3.根据权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述抗原液的培养方法是将病毒按体积分数1%?3%的接种量接种在宿主细胞中，当宿主细胞生长到40%?90%时，将普通培养液更换为维持液，维持观察48?72h后，收集病毒，得到所述抗原液。4.根据权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述BEI是现配现用，其配制方法如下: 将BEA粉末加入浓度为0.4mol/L的NaOH溶液，配制浓度为0.2mol/L的BEA的溶液，然后将其放置在温度为37°C的条件下环化Ih后，观察pH值降至8.5时结束环化，接着调整pH值为7.2?7.6，得到所述的BEI。5.根据权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述灭活疫苗放置在-80°C下保存。
【专利摘要】本发明公开了一种灭活疫苗的制备方法。本发明利用BEA和甲醛联用的方法，对抗原液在温度为25～27℃的条件下，灭活12～36h。本发明解决了常温灭活问题，避免传统灭活剂甲醛对实验动物带来的应激；同时使用本发明灭活疫苗的制备方法更有利于病毒保持完整性，增强免疫效果，增加产品质量。
【IPC分类】C12N7/00, C12N7/06, A61K39/12, A61K39/23, A61K39/215, A61K39/225, A61P31/20, A61P31/14
【公开号】CN105056225
【申请号】CN201510458657
【发明人】高鹏, 刘立新, 李晏齐, 舒经香, 林艳
【申请人】成都天邦生物制品有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月30日