精密称取槲皮素20mg、TPGS 20mg，溶于1.0mL甲醇中，10°C和超声条件下缓慢滴加至1mL水中，13000r ?min 1离心20min，弃上清，沉淀加水5mL超声复溶，10°C和2000bar高压均质5次。制备后平均粒径为335.26nm，PDI为0.28，电位为-8.26mV。
[0035]实施例6
[0036]按照实施例1制备槲皮素纳米粒，取ImL制备成功的槲皮素纳米混悬剂逐渐滴加到ImL新鲜空白大鼠血浆中，37°C孵育并在O、3、5h测其粒径，平行实验三份，考察其血浆稳定性，采用同法考察样品在5%葡萄糖溶液中稳定性。
[0037]制备的槲皮素纳米混悬剂在水中及5%葡萄糖溶液中孵育5h内粒径几乎无变化，无肉眼可见的变化，电位也无明显改变(见图2)。血浆中孵育后粒径虽有所增大，但5h后也只有不到260nm，提示所制备的纳米粒在血浆中稳定，加之其不会引起红细胞溶血，故该纳米粒适合于静脉注射给药。槲皮素纳米粒在血浆中粒径略有增大，可能与血浆蛋白在其表面吸附有关。
[0038]实施例7:槲皮素纳米粒载药量与包封率的测定
[0039]槲皮素含量测定的色谱条件:色谱柱为Waters Symmetry C18(4.6X250mm,5 μπι)，流动相为甲醇-0.4%磷酸水(65: 35)，流速0.8mL*min \检测波长372nm，进样量20 μ L，柱温 25 0C O 槲皮素的标准曲线 Y = 0.78Χ-0.3592，R2= 0.9997，0.5 ?100 μ g.mL 1
范围内线性良好。
[0040]取药载比为5: I的槲皮素纳米混悬剂5mL冻干，用甲醇溶解破坏纳米粒使药物释放出来，HPLC测定载入纳米粒内的药物含量，根据以下公式测定载药量(Drug Loading，DL)和包封率(Entrapment Efficiency, EE)。EE(% ) = (W1Zff2) X 100%, DL(% ) = (W1/W3) X 100% ;其中^为5mL纳米粒中实测槲皮素的量，评2代表制备5mL槲皮素纳米混悬剂时药物槲皮素的投料量，胃3代表制备5mL槲皮素纳米混悬剂的实测重量。结果可得药载比5: I的槲皮素纳米混悬剂实测包封率为(96.41 ±1.72)%，载药量为(80.40± 1.44) %。实验测定槲皮素的水中饱和溶解度为(6.83±0.41) μ g.mL \将槲皮素制备成纳米混悬剂之后，其在水中的浓度可轻易达到2.0mg.mL \提高约293倍，并可以静脉注射给药，极大的改善了槲皮素水中溶解性差和因此带来的难以给药问题。
[0041 ] 实施例8:槲皮素纳米粒DSC (差示扫描量热法)分析
[0042]方案:精密称取5mg样品(槲皮素原药、TPGS、槲皮素纳米粒冷冻干燥粉末、物理混合物)于标准铝盘中，密封后在氮气环境下按照10°C.min 1的速率扫描，分析后绘制DSC曲线，扫描温度范围为(TC?350°C，结果见图3。由结果可知槲皮素纳米粒中药物以晶型形式存在。
[0043]实施例9:槲皮素纳米粒体外释放实验
[0044]方案:分别精密吸取ImL槲皮素纳米混悬剂(实施例1中制备得到)、槲皮素原药混悬液与自制槲皮素溶液(50% PEG400水溶液配制)于透析袋(MffCO 8000?14000)中，置于250mL释放介质(含0.5% SDS及1%乙醇的去离子水)中，37°C、10r.min 1恒温搅拌，分别于0.5、l、2、4、8、12、24、36h取ImL释放外液，同时补充等体积的37°C恒温的新鲜释放介质继续释放，每24h更换全部释放外液为新鲜释放外液。以HPLC测定其中槲皮素含量，计算累积释放度；同一样品平行实验3份，结果见图4。
[0045]结果:由于槲皮素原药水溶性和脂溶性均较差，将槲皮素分散在水中得到混悬液，一直到36h还检测不到药物的释放，溶液中槲皮素4h释放达到80%，而槲皮素纳米粒相同条件下36h释放80%，符合Higuchi方程。与溶液相比，具有明显的缓释作用，同时又解决了槲皮素原药微米混悬液的难溶性问题。
【主权项】
1.一种槲皮素的纳米粒，其特征在于:以槲皮素为原料药，以TPGS (维生素E聚乙二醇琥珀酸酯)为载体辅料，药载比(质量比)为1: 20?10:1。2.根据权利要求1中所述的槲皮素纳米粒，其特征在于:采用纳米沉淀法或者高压均质法中的一种或两者联合法进行制备。3.根据权利要求1至2所述的槲皮素纳米粒，其特征在于，其制备方法包括以下步骤: (1)将槲皮素药物与辅料共同溶解于能与水互溶的有机试剂中； (2)在超声或搅拌条件下将溶解槲皮素药物与辅料的有机试剂注入到一定量水中；(3)通过透析法或者减压旋转蒸发法去除有机试剂，或者高速离心沉淀收集纳米粒，重新加水分散； (4)若有需要可采用高压均质法进一步减小粒径。4.根据权利要求1至3中所述的槲皮素纳米粒的制备方法，其特征在于:步骤⑴中所提及的有机试剂为甲醇、乙醇、DMF、DMSO、丙酮、乙腈中的一种或两者或多种的混合体系，所选有机试剂体系只要能与水互溶且能很好的溶解药物与辅料即可，药物在有机溶剂中的浓度为0.001%?50% (w/v)，辅料的浓度为0.001%?50% (w/v);步骤(2)中有机溶剂与水相的体积比为1: 5?1: 50(v/v);步骤(3)中高速离心条件为2000?60000rpm离心I?60min，弃去上清，沉淀加水超声复溶；步骤(4)超声与搅拌温度为O?60°C，高压均质条件为温度O?60°C，压力500-4000bar，其中理想均质条件为10°C、2000?2500bar、5?15次循环。5.根据权利要求1至4中所述的槲皮素纳米粒，其特征在于:TPGS是槲皮素纳米粒最佳稳定剂，其他含有PEG链段的类似的药用辅料如PEG-PCL、PEG-PLA等(不包括普郎尼克)也可作为稳定剂制备类似的槲皮素纳米；为进一步改善纳米粒的性质，还可将其他的一些药用辅料与TPGS联合使用制备槲皮素纳米粒，这些辅料包括但不仅限于PEG-PCL、PEG-PLA、磷脂、吐温等，但不包括普郎尼克与TPGS的组合。6.根据权利要求1至5所述槲皮素纳米粒，其特征在于:所述纳米粒载药量较高，药载比为5: I时可达到80%，粒径在10?lOOOnm，优选平均粒径10_300nm的纳米粒。7.根据权利要求1至6中所述的槲皮素纳米粒，其特征在于:所述的纳米粒包括但不限于纳米混悬剂、纳米晶、纳米粒、纳米聚集体、胶束等，但不包括具有内水相的脂质体和囊泡。8.根据权利要求1至7中所述的槲皮素纳米粒，其特征在于:槲皮素纳米粒在5%葡萄糖溶液及血浆中可稳定存在，且放置稳定性好。9.根据权利要求1至7中所述的槲皮素纳米粒，其特征在于:纳米粒中药物具有较好的缓释作用，药载比为5: I时体外缓释36h，药载比降低时缓释时间更长。10.根据权利要求1至7中所述的槲皮素纳米粒，其特征在于:提供一种槲皮素纳米粒在制备注射剂或口服制剂以及皮肤、粘膜局部应用，本发明的槲皮素纳米粒水相分散介质可用高浓度的葡萄糖水溶液调成5%葡萄糖生理等渗体系，适应临床应用。
【专利摘要】本发明涉及了一种槲皮素纳米粒及其制备方法，所述槲皮素纳米粒由纳米沉淀法与高压均质法中一种或两种联合制备。以槲皮素为原料药，以TPGS(维生素E聚乙二醇琥珀酸酯)为主要稳定剂，药物与载体稳定剂的质量比为1∶20～10∶1。制备的槲皮素纳米粒粒径小，载药量高，药载比为5∶1时平均粒径为173.21nm，载药量约80％；且稳定性好，药物在纳米粒中以晶型形式存在，体外具明显缓释效果。采用TPGS可制备高载药量、小粒径的槲皮素纳米粒，体外具有明显缓释作用且解决了槲皮素水溶性差的难题，具有较好的应用前景。
【IPC分类】A61K9/14, A61P35/00, A61P9/00, A61P9/08, A61P13/12, A61K31/352, A61K47/34, A61P39/06
【公开号】CN105106117
【申请号】CN201510359739
【发明人】王向涛, 邸静, 洪靖怡, 刘营营
【申请人】中国医学科学院药用植物研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年6月26日