用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于粘液渗透的还原响应性祀向高分子胶束及其制备方法，属于 药物载体材料制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 粘液提供了肺呼吸道、肠胃、眼、鼻咽、阴道等部位暴露的表面的第一道防线，其高 的粘附性和粘弹性使外来病原体、毒素、微粒等被粘附在粘液中，并迅速清除掉，即为正常 的粘液清除机制。而通过研究者大量的实验证明，粘液还会强烈的固定清除传统的纳米粒 子，运也成为了粘膜表面局部给药和基因传递的一大障碍。研究者利用粘液的粘附性能，设 计了两类粘附型纳米粒子。一种是能与粘液中带负电的黏蛋白静电吸附的带正电荷的纳米 粒子，一种是能与粘液中琉基反应形成二硫键的带琉基的纳米粒子，两者都能与粘液形成 较强的相互作用从而延长纳米载体在粘液中的停留时间，进而释放负载的药物达到治疗效 果。但另一方面，粘附型纳米粒子在粘液层中停留的同时，依旧会被快速清除掉。因此，提 高纳米载体的生物利用度就必须使纳米载体可W迅速渗透过粘液而避免粘附与清除。
[0003] HanesJ课题组首次提出一种"粘液渗透粒子"的概念，即通过在粒子表面修饰低 分子量的聚乙二醇（PEG)获得可W在粘液中快速渗透的纳米粒子。PEG的修饰同时赋予了 纳米粒子更高的稳定性，尤其是纳米粒子必须渗透通过厚厚的粘液层W达到底层细胞，稳 定的负载药物到达病灶细胞并缓控释药物，减小病人痛苦且提高了治疗效果。然而聚乙二 醇的修饰虽然使纳米粒子获得W上性能，但由于阻碍了纳米粒子与病灶细胞的相互作用， 降低了纳米粒子的内吞效果，由此降低了胞内药物的缓控释，影响了应有的治疗效果。
【发明内容】
[0004] 鉴于目前粘液渗透纳米粒子存在的缺陷，为了使粘液渗透纳米粒子更好的应用于 粘液方面的药物载体，本发明提供一种包含还原响应性二硫键（-S-S-)，叶酸祀向，细胞毒 性小，粒径更均匀的高分子胶束及其制备方法。 阳0化]聚乳酸-径基乙酸共聚物（PLGA)是由两种单体--径基乙酸和乳酸随机聚合形成 的，可降解的疏水性功能高分子，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能， 在美国已经通过抑A认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典，被广泛应用于药物载体 和医用工程材料等领域。改性后的PLGA纳米载体具有可控的粒径且分散度很小，可W实现 药物长时间的缓控释，降低了患者用药频率，减少了患者的痛苦。
[0006] 聚乙二醇（polyethyleneglycol,阳G)是一种由环氧乙烧聚合而成的亲水性高分 子，与疏水性高分子结合后的产物即双亲性高分子可组装用作药物或基因载体。同样在美 国已经通过抑A认证，无毒且具有良好的生物相容性和生物可降解性。聚乙二醇可W用于 修饰纳米粒子，W保护纳米粒子延长体内循环和代谢半衰期，更好的溶解性，较小的毒性和 免疫原性，且增强了纳米粒子对肿瘤的被动祀向作用。
[0007] 叶酸（FA)是人体不能合成又必需的维生素，需要外源性摄取，其摄取途径是叶酸 通过与细胞表面的叶酸受体特异性结合，介导内吞进入细胞。在细胞增殖较多、分裂很快的 组织，如卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、睾丸癌、脑瘤、肺腺癌、乳腺癌、脑瘤、睾丸癌等大部分恶 性肿瘤，因为需要大量的叶酸，叶酸受体高度表达，有时比正常组织高出几百倍。利用叶酸 受体对叶酸及其类似物的运转机制和叶酸受体在肿瘤等部位的高度表达，可设计标记叶酸 的纳米药物载体祀向目标部位进行治疗，较少对正常组织的损害，增强治疗效果。
[0008] 通过还原响应性二硫键将PLGA与PEG相结合形成一种双亲性高分子结合体，后 组装形成还原响应性胶束，运种胶束制备方法简单，适应性强，成本低，而且粒径分布更为 均匀，体系稳定，由于PEG的包覆使得胶束表面显中性，细胞毒性低，且在粘液层中可渗透 到底部细胞层，到达底层细胞后注射谷脫甘肤（GSH)溶液，还原响应性的二硫键断裂，脱去 PEG的保护，裸露出包覆的祀向叶酸，与病灶细胞的细胞膜表面过表达的叶酸受体特异性结 合，并由叶酸受体介导内吞作用，提高纳米载体的进胞效率，使得更多载体进入细胞进行缓 控释药物，达到更加的治疗效果。
[0009] 本发明制备了一种用于粘液渗透的还原响应性祀向高分子胶束，选用聚乳酸-径 基乙酸共聚物（poly(lactic-c〇-glycolicacid),PLGA)和聚乙二醇（polyeth}dene glycol,PEG)，将PLGA和PEG用3, 3' -二硫代二丙酸键合连接，形成含还原响应性的二硫 键（-S-S-)的双亲性高分子结合体，该结合体与连接了叶酸的PLGA共同自组装形成还原响 应性祀向高分子胶束作为纳米载体。
[0010] 本发明的技术方案如下：
[0011] 一种用于粘液渗透的还原响应性双亲性高分子结合体，其特征是结构式如下：
[0012]
[0013] PLGA分子量为10~50kDa，阳G分子量为1~5kDa。本发明的还原响应性双亲性 高分子结合体与叶酸修饰的PLGA共自组装形成还原响应性祀向球形纳米载体。
[0014] 本发明的还原响应性双亲性高分子结合体的制备方法，步骤如下：
[0015] 将聚乳酸-径基乙酸共聚物（PLGA)、1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐、4-二甲氨基化晚、3, 3' -二硫代二丙酸按摩尔比1: (1. 2~5) : (0. 6~2) : (3~10)溶 于N，N-二甲基甲酯胺中，室溫揽拌反应24~4化后在上述溶液中按摩尔比聚乳酸-径基 乙酸共聚物（PLGA):聚乙二醇（PEG) = 1:4溶入聚乙二醇（PEG),室溫揽拌反应24~48h， 后处理得到还原响应性双亲性高分子结合体。
[0016] 所述的PLGA溶于N，N-二甲基甲酯胺浓度优选为0. 05~0. 25g/ml。
[0017] 所述的后处理具体步骤为，将反应液在N，N-二甲基甲酯胺中透析12~24小时 后，在纯水中透析24~48h，冻干的得到还原响应性双亲性高分子结合体。
[001引本发明的还原响应性祀向高分子胶束的组装方法，步骤如下：
[0019] 取还原响应性双亲性高分子结合体分散在离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声 波发生器作用下，滴入溶有叶酸修饰的PLGA的二氯甲烧或=氯甲烧；将得到的乳液在25~ 30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10~15分钟，除去有机相，得到还原响应性双亲性高分子 结合体与祀向基团的共组装体溶液。
[0020] 所述的双亲性高分子结合体溶于去离子水浓度优选为为1~5g/L。
[0021] 所述的叶酸修饰的PLGA溶于二氯甲烧或S氯甲烧浓度优选为为0. 2~Ig/L。
[0022] 所述的二氯甲烧或S氯甲烧：离子水体积比优选为为1:1~20。
[0023] 组成的还原响应性双亲性高分子结合体与祀向基团的共组装纳米载体，制剂粒径 在70到110纳米之间，在谷脫甘肤（GSH)lOmM/L环境下，二硫键断裂，脱去PEG的保护，裸 露出包覆的祀向叶酸。粒径均匀，分散性好。
[0024] 有益效果
[00巧]本发明设及的用于粘液渗透的还原响应性祀向高分子胶束有益效果包括：制备的 聚乳酸-径基乙酸共聚物（PLGA)和聚乙二醇（阳G)结合体生物相容性好，毒性低。聚乳 酸-径基乙酸共聚物（PLGA)具有很好的疏水性，聚乙二醇（阳G)具有很好的亲水性，使得 结合体具有双亲性。连接PLGA和PEG的3, 3' -二硫代二丙酸使双亲性高分子具有还原响 应性，且可进行自组装和负载药物。本发明中制备双亲性胶束可实现良好的粘液渗透性能、 还原响应断键性能和祀向细胞介导内吞的性能，且有效粒径在70~llOnm，粒径更均匀；在 谷脫甘肤（GSH)10mM/L环境下，还原响应性的二硫键断裂，脱去PEG的保护，裸露出包覆的 祀向叶酸，与病灶细胞的细胞膜表面过表达的叶酸受体特异性结合，并由叶酸受体介导内 吞作用，提高纳米载体的进胞效率，具有良好的还原祀向响应性；稳定性好，可在水溶液中 保存至少两个月；制备产率高，适合大批量生产。
[00%] 本发明的目的是设计并制备一种用于粘液渗透的还原响应性祀向高分子胶束。与 现有技术相比，本制备方法可W实现良好的粘液渗透性能，所制得的自组装药物载体保持 了均匀较小粒径同时，生物相容性更好，且具有还原祀向响应性，可在谷脫甘肤（GSH)lOmM/ L环境下，还原响应性的二硫键断裂，脱去PEG的保护，裸露出包覆的祀向叶酸，与病灶细胞 的细胞膜表面过表达的叶酸受体特异性结合，并由叶酸受体介导内吞作用，提高纳米载体 的进胞效率，使得更多载体进入细胞进行缓控释药物，达到更加的治疗效果，更高效发挥载 体作用。
【附图说明】
[0027] 图1 :还原响应性双亲性高分子结合体即结合体核磁共振氨谱图。
[0028] 图2 :还原响应性祀向高分子胶束即胶束粒度分析图。
[0029] 图3 :还原响应性祀向高分子胶束即胶束在谷脫甘肤（lOmM/L)环境下的粒度变化 图。
[0030] 图4 :还原响应性祀向高分子胶束即胶束透射照片。
[0031] 图5 :还原响应性祀向高分子胶束即胶束在粘液中渗透后祀向和停留效果照片。
【具体实施方式】
[0032] W下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0033] 还原响应性双亲性高分子结合体的制备方法，步骤如下：
[0034]将聚乳酸-径基乙酸共聚物（PLGA)、1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐、4-二甲氨基化晚、3, 3' -二硫代二丙酸按摩尔比1: (1. 2~5) : (0. 6~2) : (3~10)溶 于N，N-二甲基甲酯胺中，室溫揽拌反应24~4化后在上述溶液中按摩尔比聚乳酸-径基 乙酸共聚物（PLGA):聚乙二醇（PEG) = 1:4溶入聚乙二醇（PEG),室溫揽拌反应24~48h， 后处理得到还原响应性双亲性高分子结合体。
[0035] 所述的PLGA溶于N，N-二甲基甲酯胺浓度优选为0. 05~0. 25g/ml。
[0036] 所述的后处理具体步骤为，将反应液在N，N-二甲基甲酯胺中透析12~24小时 后，在纯水中透析24~48h，冻干的得到还原响应性双亲性高分子结合体。
[0037] 还原响应性祀向高分子胶束的组装方法，步骤如下：
[0038] 还原响应性祀向高分子胶束通过乳化-溶剂蒸发法组装制备。
[0039] 取还原响应性双亲性高分子结合体分散在离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声 波发生器作用下，滴入溶有叶酸修饰的PLGA的二氯甲烧或=氯甲烧，超声结束，将得到的 乳液在25~30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10~15分钟，除去有机相，得到还原响应性 双亲性高分子结合体与祀向基团的共组装体溶液。
[0040] 所述的双亲性高分子结合体溶于去离子水浓度优选为1~5g/L。
[0041] 所