T波的变化。
[0030] 4. 2心肌梗塞范围腹主动脉取血后，迅速取出心脏，用PBS缓冲液冲洗干净心脏内 余血，用滤纸吸去水分，于-20°C冰箱内冷冻8min后取出心脏，迅速将左心室结扎线下部分 心肌平行切成厚度约为2_的片状，片状心肌恢复室温后置现配的1 % TTC缓冲液中避光染 色，并37°C恒温水浴15min，期间振荡4次以便充分染色。然染色后将心肌组织置于10%福 尔马林中浸泡24h，正常心肌被染为红色，梗塞区心肌不着色。将心肌组织按顺序排好拍照， 使用Image Pro Plus6. 0医学图像分析系统对拍照的心肌梗死区面积进行分析，使用count and measureabjects工具计算梗死区面积及整个心肌面积，梗死范围=梗死区面积/心脏 总面积X 100%。
[0031] 4. 3 CK、LDH活力的检测心肌梗塞3h后腹主动脉取血6ml，静置2h后4000r/min 离心20min取上清液。试剂盒检测CK、LDH的活力。
[0032] 5统计处理方法：
[0033] 结果均用i±s表示，心电图以不同时点测定值与结扎前基础值之差值表示。利用 SPSS13. 0统计软件单因素方差分析方法进行组间比较。
[0034] 6试验结果：
[0035] 6. 1延龄草85%乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠 II导联心电图ST段及T波变化的影 响
[0036] 结果见表1、表2。假手术组相比，模型组大鼠在冠脉结扎后5、10、15、30min心电 图ST段、T波均显著升高。与模型组相比较，阳性药组、延龄草85%乙醇洗脱物高剂量组 和延龄草85%乙醇洗脱物中剂量组均可显著对抗结扎冠脉导致大鼠 ST段、T波的升高（p < 0· 05 或 p < 0· 01) 〇
[0037]
[0038] 6. 2延龄草85%乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠心肌梗塞范围的影响
[0039] 结果见表3。与假手术组相比较，模型组大鼠心肌梗塞范围显著升高；与模型组相 比较，阳性药组、延龄草85%乙醇洗脱物高剂量组、延龄草85%乙醇洗脱物中剂量组均能 显著降低心肌梗塞范围（P < 0. 01)，说明阳性药组、延龄草85%乙醇洗脱物高剂量组、延龄 草85%乙醇洗脱物中剂量组均能增加缺血区血液供应，降低心肌缺血性损害。
[0040] 表3延龄草85 %乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠心肌梗塞范围的影响（i:±s，η = 11)
[0042] 注：与假手术组比较，##Ρ < 0. 01 ;与模型组比较，#Ρ < 0. 01。
[0043] 6. 3延龄草85 %乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH的影响
[0044] 结果见表4。与假手术组相比较，模型组大鼠在结扎冠脉后血清中CK、LDH活力显 著升高；与模型组相比较，阳性药组、延龄草85%乙醇洗脱物高剂量组、延龄草85%乙醇洗 脱物中剂量组的血清中CK、LDH活性显著降低（p < 0. 01)，提示阳性药组、延龄草85%乙醇 洗脱物高剂量组、延龄草85%乙醇洗脱物中剂量组对心肌的缺血损伤有保护作用。
[0045] 表4延龄草85 %乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH活力的影响（$ ±:$， η = 11)
[0047] 注：与假手术组比较，##Ρ < 0. 01，与模型组比较，#Ρ < 0. 01。
[0048] 7实验小结：
[0049] 心肌缺血是由于心脏血和氧的供需失去平衡所致，是冠心病等缺血性心脏病发生 的主要病理生理机制。在心肌缺血有关实验研究中，实验动物的心电图改变是重要的观察 指标之一，ST段及Τ波高度的变化是心肌缺血最早期出现的、最敏感和确切的指标一，常用 于判断心肌缺血模型的复制是否成功及评价药物的抗心肌缺血药效。心肌缺血时心电图所 表现出的ST段抬高是由于心外膜缺血区内部分发生去极化的心肌细胞与非缺血区心肌细 胞之间形成的一过性损伤电流所引起的，Τ波升高是由于心内膜下心肌缺血。因此，通常将 ST段及Τ波的变化值作为评价大鼠心肌缺血损伤的主要指标。
[0050] CK是一个与细胞内能量转运、肌肉收缩、ΑΤΡ再生有直接关系的重要激酶，它可逆 的催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。主要分布在骨骼肌、心肌和脑细胞中。其主要功 能为：在三磷酸腺苷（ATP)作用下，催化肌酸磷酸化，形成磷酸肌酸和二磷酸腺苷（ADP)，以 及催化磷酸肌酸的高能磷酸键转移给二磷酸腺苷（ADP)生成三磷酸腺苷（ATP)，并形成肌 酸。心肌缺血后细胞膜受到不同程度的损伤，肌酸激酶会从受损细胞中释放入血，使血清中 肌酸激酶水平迅速提高，肌酸激酶是心肌梗死的重要血生化指标。
[0051] LDH是一种寡聚酶，可催化乳酸及丙酮酸的可逆转化。该酶广泛分布在心肌、红细 胞、骨骼肌和肝脏中，它在细胞液中的含量非常丰富，因而所催化的反应非常迅速，是细胞 呼吸链上的重要生物酶。组织缺氧时，细胞糖酵解作用旺盛，丙酮酸在LDH作用下转变成乳 酸的过程加强，LDH活性的升高意味着无氧酵解过程加强，有氧氧化过程受抑制，能量供应 障碍。所以血清中LDH的活性可反映心肌缺血损伤的范围和严重程度，其活性越高，反映心 肌损伤越重。
[0052] 本实验研究发现，大鼠左冠脉前降支结扎后，心电图ST段、T波均显著升高，心肌 梗塞范围显著增加，血清中CK、LDH活力明显升高，提示心肌缺血造模成功。延龄草85 %乙 醇洗脱物高剂量组、延龄草85%乙醇洗脱物中剂量组均能显著降低模型大鼠 ST段和T波 的异常抬高，减少心肌缺血大鼠的心肌梗塞范围，抑制血清中CK、LDH的活力，提示延龄草 85%乙醇洗脱物对冠脉结扎所致心肌缺血有一定的防治作用。
[0053] 实施例5
[0054] 延龄草成分分析与质量标准研究，课题组在对延龄草成分的研究中，发现其中 的延龄草偏诺皂苷B3 (偏诺皂苷元-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基（1 - 2)-i3D_葡萄糖苷）、 Bi (偏诺皂苷元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - [ a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 2) ] - β D-葡 萄糖苷）、Β2(偏诺皂苷元-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基（1 - 4)-a-L_吡喃鼠李糖基 (1 - 4) _[a-L-吡喃鼠李糖基（1 - 2)]-0D-葡萄糖苷）含量较大，是延龄草中的专属性 成分与特征性成分，且在203nm处有紫外吸收，可以直接用紫外检测器进行含量测定，方法 简便。本文采用HPLC法测定延龄草中延龄草皂苷B2、Bi、B3的含量，为研究和制定延龄草药 材的质量标准提供依据。
[0055] B3:偏诺阜苷元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 2) - β D-葡萄糖苷&61111〇8611；[11- 3-0-a -L-rhamnopyranosyl-(l - 2)-β -D-glucopyranoside)，其分子结构式见图 10
[0056] B1:偏诺皂苷元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - [ a -L-吡喃鼠李糖基 (l - 2)]-0D_葡萄糖苷（pennogenin-3-〇-a -L_rhamnopyranosyl-(l - 4)-[a -L-rhamno pyranosyl_(l - 2)]-β-D-glucopyranoside)，其分子结构式见图 2〇
[0057] B2:偏诺皂苷元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - a -L-吡喃鼠李糖基 (1 - 4) - [ a -L-Ρ比喃鼠李糖基（1 - 2) ] - β D-葡萄糖苷（pennogenin-3-〇-a -L-rhamnopy ranosyl- (1 一 4) _ a -L-rhamnopyranosyl_ (1 一 4) _ [ a _L-rhamnopyranosyl_ (1 一 2) ] _ β _D_gl ucopyranoside)，其分子结构式见图3。
[0058] 对照品延龄草皂苷B2 (偏诺皂苷元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - a -L-吡 喃鼠李糖基（1 - 4)-[a-L-吡喃鼠李糖基（1 - 2)]-i3-D-葡萄糖苷）、(偏诺皂苷 元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) _[ a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 2) ]- β D-葡萄糖苷）、 Β3(偏诺皂苷元-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基（1 - 2)-i3D_葡萄糖苷）由本实验室自制，经 过高效液相峰面积归一化法测定质量分数99 %。延龄草药材采自湖北省神农架地区，经 江西中医药大学左月明副教授鉴定为百合科延龄草属植物延龄草Trillium tschonoskii Maxim.。乙腈为色谱纯（天津四友生物医学技术有限公司），水为二次蒸馏水（自制）。
[0059] 样品测定称取延龄草药材粉末（过4号筛，低温烘干至恒重）约1. 0g，按照供试品 溶液的制备方法制备，精密吸取样品溶液20 μ 1，注入高效液相色谱仪测定，根据外标两点 法计算样品中的延龄草皂苷的含量分别为0. 13%、0. 19%和0. 28% (η = 3)。
[0060] HPLC法测定延龄草血中移行成分的初步研究
[0061] 本课题组还开展了延龄草的含药血清色谱指纹图谱研究，但仅初步建立了含药 血清的制备方法和检测方法，初步确定延龄草入血成分为队（偏诺阜昔兀-3_〇-a -L- Ρ比 喃鼠李糖基（1 - 4)-[α-L-吡喃鼠李糖基（1 - 2)]_0D-葡萄糖苷）和&(偏诺皂苷 元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 2) - β D-葡萄糖苷），从而使延龄草的质量评价方法更加 完善，为明确其药效物质基础和作用机理提供更广泛的科学依据。
[0062] 实施例6
[0063] 发明人采用冠脉结扎致大鼠心肌缺血实验模型，从心电图、心肌梗死范围、血清 肌酸激酶（CK)及血清乳酸脱氢酶（LDH)的活力等方面研究证实延龄草85%乙醇洗脱物 有效部位中的偏诺皂苷元-3-0-a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 2)-β -D-葡萄糖苷、偏诺皂苷 元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - [ a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 2) ] - β D-葡萄糖苷和偏 诺皂苷元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - [ a -L-吡喃鼠 李糖基（1 - 2)]_0D-葡萄糖苷对心肌缺血具有显著的防治作用和较强的生物活性。
[0064] 1药品与试剂：延龄草皂苷1 (偏诺皂苷元-3-0- a -L-吡喃鼠李糖