取采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球5?10mg ;
[0062]2)将上述微球与lmL HBsAg抗原溶液混匀得到混合溶液，其中HBsAg抗原溶液浓度是 40 μ g/mL ;
[0063]3)将混合溶液在小鼠背部皮下注射，每次注射量为100 μ L混悬液；
[0064]本
【发明内容】
还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球作为HBsAg抗原免疫佐剂的应用方法。包括:
[0065]1)称取采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球5mg ;
[0066]2)将上述微球与lmL HBsAg抗原溶液混匀得到混合溶液，其中HBsAg抗原溶液浓度是 40 μ g/mL ;
[0067]3)将混合溶液在小鼠背部皮下注射，每次注射量为100 μ L混悬液；
[0068]本
【发明内容】
还包括一种采用上述方法制备得到的CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球的应用方法，其特征在于:通过改变缓冲液的pH值从而改变所述纳微球对于抗原的吸附。
[0069]本
【发明内容】
还包括一种采用上述方法制备得到的CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球的应用方法，其特征在于:通过改变缓冲液的pH值从而改变所述纳微球对于抗原的吸附，将缓冲液pH值从5.7升高至7.2,从而降低所述纳微球对抗原的吸附。
[0070]本
【发明内容】
还包括一种采用上述方法制备得到的CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球的应用方法，其特征在于:所述纳微球吸附抗原后，具有抗原pH敏感释放行为，通过改变缓冲液的pH值改变抗原释放速率。
[0071]本
【发明内容】
还包括一种采用上述方法制备得到的CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球的应用方法，其特征在于:所述纳微球吸附抗原后，具有抗原pH敏感释放行为，通过改变缓冲液的pH值改变抗原释放速率，在低pH缓冲液中(pH5.7)，抗原快速释放；在高pH缓冲液中(PH7.2)，抗原几乎不释放或释放很慢。
[0072]本发明的有益效果:通过一步法制备CaP-PLA/PLGA纳微球，该纳微球相对于现有技术中的PLA/PLGA微球，微球粒径均一，且微球表面形成大量的褶皱结构，有利于抗原的吸附；同时，所述纳微球由于表面的磷酸盐钙镀层，可通过配基交换模式增强抗原吸附，是一种较好的免疫佐剂。进一步的试验证明，制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球具有pH值的敏感性，在不同pH值条件下，携载抗原的纳微颗粒的抗原释放速率不同，有利于后续免疫应答的提升。
【附图说明】
[0073]图1制备的CaP-PLA纳微球的扫描电镜照片。
[0074]图2图1显示的电镜照片的局部放大的照片。
[0075]图3制备的CaP-PLA纳微球对HBsAg抗原的吸附结果。
[0076]图4制备的CaP-PLA纳微球作为HBsAg抗原佐剂，免疫小鼠后30天的抗体水平检测。
[0077]图5制备的CaP-PLA纳微球作为HBsAg抗原佐剂，免疫小鼠后60天的抗体水平检测。
[0078]图6制备的CaP-PLA纳微球作为HBsAg抗原佐剂，免疫小鼠后IFN- γ的分泌水平检测。
[0079]图7制备的CaP-PLA纳微球吸附HBsAg抗原对pH值的敏感性。
[0080]图8CaP-PLA载抗原纳微球在pH7.2缓冲液中抗原释放30min的扫描电镜照片。
[0081]图9CaP-PLA载抗原纳微球在pH5.7缓冲液中抗原释放30min后的扫描电镜照片
【具体实施方式】
[0082]实施例1
[0083]CaP-PLA微球的制备
[0084]1)将PLA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相0,二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为5: 1，PLA浓度是30%质量体积浓度；
[0085]2)含0.1M的钙离子的水溶液作为内水相％，其中钙离子来源于氯化钙；
[0086]3)溶解了 PVA的水溶液作为外水相W2，其中PVA浓度为5 %质量体积浓度；
[〇〇87]4)将1加入到0中，采用超声方法制备初乳液V0,其中1和0的体积比为
1: 30,乳化时间是2min ;将此初乳液I/O加入到W2中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W/0/%，其中I/O和W2的体积比是1: 50,乳化时间是5min ;
[0088]5)随后将此预复乳液[/0/%转移到快速膜乳化的储料罐中，在0.75Mpa的氮气压力下过膜3次，得到粒径均一的复乳液ΙΑ)/%，其中所述膜为SPG膜，孔径大小为2.8微米。
[0089]6)向复乳液W/0/%体系中添加含0.1M磷酸氢二钠的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，微球经过去离子水洗涤3次，冷冻干燥即得到CaP-PLA纳微球。
[0090]制备得到的微球的电镜照片如说明书附图图1所示。
[0091]实施例2
[0092]CaP-PLGA微球的制备
[0093]1)将PLGA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相0,二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为8: 1，PLGA浓度是45%质量体积浓度；
[0094]2)含0.1M的钙离子的水溶液作为内水相％，其中钙离子来源于氯化钙；
[0095]3)溶解了 PVA的水溶液作为外水相W2，其中PVA浓度为7 %质量体积浓度；
[0096]4)将1加入到0中，采用匀质法制备初乳液W/0,其中％和0的体积比为1: 50，乳化时间是6min ;将此初乳液I/O加入到W2中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W/0/%，其中1/0和W2的体积比是1: 120,乳化时间是lOmin ;
[0097]5)随后将此预复乳液W/0/%转移到快速膜乳化的储料罐中，在0.6Mpa的氮气压力下过膜6次，得到粒径均一的复乳液ΙΑ)/%，其中所述膜为SPG膜，膜孔径大小为2.8微米。
[0098]6)向复乳液W/0/%体系中添加含0.1M磷酸氢二钠的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，再用去离子水洗涤3次，冷冻干燥即得到CaP-PLGA纳微球。
[0099]实施例3
[0100]CaP-PLA微球对抗原的吸附
[0101]CaP-PLA微球对HBsAg的吸附将HBsAg原液用pH6.8的磷酸缓冲液稀释到一定浓度，取lmL稀释后的HBsAg溶液，加入少量NaCl，保证抗原溶液有一定盐浓度，再向lmL抗原溶液中加入5mg的CaP-PLA纳微球，使纳微球充分悬浮在HBsAg溶液中，在一定温度下振荡吸附12h，振荡频率20r/min。同时对照试验中加入PLA纳微球和铝盐佐剂。
[0102]HBsAg吸附率的测定取振荡吸附后的抗原微球混合溶液，5000r/min离心6min，吸出上清，采用BCA试剂盒和Micro-BCA试剂盒测定其中HBsAg含量。微球对抗原的吸附率(Adsorpt1n Efficiency，AE)按下式计算:
[0103]AE =(吸附前抗原质量-吸附后上清中抗原质量)/吸附前抗原质量X100%。
[0104]抗原吸附测定结果参看图3。
[0105]实施例4
[0106]CaP-PLA微球作为HBsAg抗原免疫佐剂的应用
[0107]1)将PLA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相0,二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为10: 1，PLA浓度是30%质量体积浓度；
[0108]2)含0.1M的钙离子的水溶液作为内水相％，其中钙离子来源于氯化钙；
[0109]3)溶解了 PVA的水溶液作为外水相W2，其中PVA浓度为8 %质量体积浓度；
[0110]4)将1加入到0中，采用匀质法制备初乳液W/0,其中1和0的体积比为1: 30，乳化时间是3min ;将此初乳液I/O加入到W2中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W/0/%，其中…/。和^的体积比是1: 100,乳化时间是8min;
[0111]5)随后将此预复乳液Wi/O/%转移