内），加 入荧光素酶底物50μL/孔进行检测，加入终止反应液50μL/孔进行检测。结果显示，随着 16-4、16-5、17-15浓度的升高，荧光强度明显减弱。表明，16-4、16-5、17-15可以剂量依赖 性地抑制C0L1A1启动子的活性（图1)。
[0029] 《实施例2》2_苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5、17-15体外抗肝纤维化活 性试验
[0030] 2. 1TGF0 1诱导LX2细胞，在含10%胎牛血清的DMEM(Gibco)培养基，37°C，5% C〇2条件下培养LX2细胞。按照每孔1X10 5个细胞铺于6孔板，培养24小时后，弃去原培 养基，PBS漂洗一遍，加入不含10%胎牛血清的DMEM(Gibco)培养基。饥饿培养24h后，加 入TGFβ1 (2ng/ml)和不同浓度的 16-4、16-5、17-15,浓度分别为 1μmmol/L、5μmmol/L、 10μmmol/L，同时设置对照组（不加入TGFβ1诱导）和TGFβ1诱导组（仅加入TGFβ1)， 继续培养24小时后收取不同处理样品。
[0031] 2. 2Real-timePCR，按照TRizol法提取LX2 细胞总RNA，并根据Roche TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit说明书操作步骤将LX2 总RNA逆转录 为cDNA。将所得的cDNA、无菌水、RocheFastStartUniversalProbeMaster(Rox)以及 ABITaqManprobes(COLlAl，TGF0 1，MMP2)配制成 20yL反应体系，使用ABI7500Fast Real-TimePCRSystem进行检测。结果显示，16-4、16-5、17-15可以明显抑制C0L1A1、 TGFβ1、MMP2mRNA水平的表达（图2)。
[0032] 2. 3Westernblot，RAPI裂解液（含1 %PMSF)提取LX2细胞蛋白，并用BCA法测 定蛋白浓度。以20yg/20yL上样，经聚丙酰胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭、一抗孵 育、PBST漂洗、二抗孵育，使用Chemilmager5500imagingsystem显影。结果显示，16-4、 16- 5U7-15可以明显抑制COL1A1、TGF0 1、MMP2、a-SMA蛋白的表达（图3)。
[0033]《实施例3》昆明小鼠急性毒性试验
[0034] 将昆明小鼠（体重在18-22g)随机分为对照组、16-4给药组、17-15给药组，每组 4 只，给药剂量为 0mg/kg、50mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、2000mg/kg。实验第一天，16-4、 17- 15给药组灌胃给药后（对照组给生理盐水），每天记录小鼠体重，身体状况（如呼吸是 否急促、皮肤是否出现出血点等）以及是否有死亡。连续观察14天后，处死小鼠。结果显 示，给药14天各组小鼠体重无明显下降（图4)，且无中毒迹象及死亡发生，表明药物安全性 较高。
[0035]《实施例4》α-萘异硫氰酸酯（alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT)肝损伤模 型
[0036] 将昆明雌性小鼠（体重在22-25g)随机分为对照组、ANIT诱导组、16-4(400mg/kg) 给药组、16-5 (400mg/kg)给药组，每组10支。对16-4、16-5给药组灌胃给药5天后（对照 组、ANIT诱导组给生理盐水），饥饿处理12h后，ANIT诱导组，16-4给药组、16-5给药组进 行ANIT诱导（75mg/kg灌胃），同时对照组灌胃玉米油。在给药2天，即ANIT诱导48时后 收取肝组织，进行病理切片HE染色。结果显示，16-4、16-5给药组与ANIT诱导组相比，肝损 伤程度得到改善（图5)。表明，16-4、16-5具有肝损伤保护作用。
[0037]《实施例5》SD大鼠胆总管结扎肝纤维化模型的制备及16-4给药处理
[0038] 将SD雄性大鼠（体重在180-200g)随机分为假手术组、BDL模型组、16-4 (100mg/ kg)给药组，其中假手术组5只，BDL模型组9只，16-4给药组9只。动物手术前禁食12h， 用异氟烷麻醉后，在无菌操作条件下，开腹，抬高肝缘，拉开十二指肠，分离总胆管2-3cm。在 近十二指肠处和近肝门处用〇〇〇号丝线各结扎两道，从两结扎位置中间剪断胆总管，将肝 恢复原样后缝合切口。假手术组仅开腹，然后缝合。动物麻醉清醒后，正常饮食，自由饮水。 手术后第2天腹腔注射16-4 (100mg/kg)，假手术组和BDL模型组腹腔注射生理盐水，每天1 次，给药14天后，禁食12h后收取尿液，血液，胆汁，肝，肾，回肠等样品。
[0039]《实施例6》16-4对BDL大鼠血清肝功能的影响。
[0040] 取样前禁食1211，用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置111，3000印111 离心5min，取血清进行血清生化指标检测。结果显示，16-4能够降低谷草转氨酶（AST)、碱 性磷酸酶（ALP)、γ-谷氨酰转移酶（γ-GGT)的活性（表1)，表明16-4能够改善BDL大鼠 肝功能。
[0041] 表1. 2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对BDL模型大鼠血清肝功能的影响
[0042]
[0043] 其中：**ρ〈0· 01与假手术组相比；#ρ〈0· 05与BDL模型组相比。
[0044]《实施例7》16-4对BDL大鼠肝脏病理结构改变的影响
[0045] 取样前禁食12h，用10%水合氯醛麻醉大鼠，取肝脏组织，切下肝大叶组织块放 入4%中性甲醛溶液中固定。经过脱水、石蜡包埋、切片、烤片等制作石蜡切片。利用苏木 素-伊红（HE)染色液进行染色，观察大鼠肝脏组织病理结构变化情况。结果显示，假手术组 大鼠肝脏组织肝细胞规则排列，肝小叶完整，无炎性细胞浸润和胆管增生情况；BDL后大鼠 肝脏组织病理结构发生明显改变，胆管增生十分明显，组织坏死明显增多；16-4给药组大 鼠肝组织结构得到明显改善，胆管增生情况得到显著抑制，组织坏死程度明显降低（图6)。 表明，16-4能够明显改善BDL大鼠肝脏组织病理结构的改变。
[0046]《实施例8》16-4对BDL模型大鼠肝纤维化的抑制作用
[0047] 8. 1Masson染色是胶原纤维特异性染色，将石錯切片用Masson染色，观察大鼠肝 脏组织纤维化情况。结果显示，BDL大鼠肝脏组织纤维化程度明显增加，16-4给药后，纤维 化程度得到明显抑制（图7)。表明，16-4能够明显抑制肌原纤维的产生，抑制BDL大鼠肝 纤维化。
[0048] 8.2羟脯氨酸为胶原纤维中特有，羟脯氨酸含量可以反映肝纤维化的程度。取肝 脏组织（80-100mg)，按照羟脯氨酸测试盒（购自南京建成生物工程研究所）说明书进行肝 脏组织中羟脯氨酸含量测定。结果显示，与假手术组相比，BDL模型大鼠肝脏组织中羟脯氨 酸含量明显升高；16-4给药后，大鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量明显降低（图8)。表明，16-4 能够明显抑制BDL大鼠中胶原纤维的产生，抑制肝纤维化的发生。
[0049] 《实施例9》16-4对BDL大鼠肝脏组织肝纤维化相关标志物的抑制作用
[0050] 9.1Real-timePCR法检测肝脏组织中肝纤维化相关基因的表达。取肝脏组织 (80-100mg)，加入lmLTRizol于冰浴中进行组织勾衆，12000rpm，4°C离心lOmin，取上清提 取总RNA，并根据RocheTranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit说明书操作 步骤，将LX2总RNA逆转录为cDNA。将所得的cDNA、无菌水、RocheFastStartUniversal ProbeMaster(Rox)以及ABITaqManprobes配制成 20μL反应体系，使用ABI7500Fast Real-TimePCRSystem进行检测。结果显示，与假手术组相比，BDL模型组大鼠肝脏组织中 肝纤维化相关基因（Collal、TgfPl、Mmp2、a-smoothmuscleactin(Acta2)、Timpl、Timp2、 Sppl)表达水平明显增加，16-4给药后可以明显降低肝纤维化相关基因的表达（图9)。
[0051] 9.2Westernblot检测肝脏组织中肝纤维化相关蛋白的表达。取肝脏组织 (80-100mg)，加入lmLRAPI裂解液（含1%PMSF)于冰浴中进行组织匀浆，12000rpm，4°C离 心10min，取上清，并用BCA法测定蛋白浓度。以50μg/20μL上样，经聚丙酰胺凝胶电泳、 转膜、5%脱脂牛奶封闭、一抗孵育、PBST漂洗、二抗孵育，使用Chemilmager5500imaging system显影。结果显示，16-4可以明显抑制COL1A1、TGF0 1、MMP2、a-SMA蛋白的表达（图 10)。9. 1和9. 2实验表明，16-4具有良好的抗肝纤维化活性。
【主权项】
1. 2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在制备肝损伤保护和肝纤维化防治药物中的应用。2. 权利要求1所述化合物为有效成分与药学上可接受的载体组成的组合物在制备肝 损伤保护和肝纤维化防治药物中的应用。3. 权利要求1所述化合物为主要原料在制备肝损伤保护和肝纤维化预防保健品中的 应用。4. 权利要求1、2或3所述的应用，其特征是，2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物可以制 成口服剂型和非口服剂型；口服剂型包括片剂、胶囊、散剂、颗粒等，非口服剂型可以是注射 液针剂等。5. 权利要求1、2、3或4所述的应用，其特征是，2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物给药 剂量或可根据病情轻重、患者年龄、给药方式及疗程等因素调整改变。
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在肝损伤保护和肝纤维化防治中的应用，通过对I型胶原蛋白α1基因COL1A1启动子活性的抑制作用、对TGFβ1诱导人肝星状细胞LX2中纤维化相关基因和/或蛋白表达的抑制作用、对化学诱导剂所致肝损伤的保护作用、对胆总管结扎(BDL)模型组大鼠血清生化指标、肝脏病理结构、肝脏组织羟脯氨酸含量、肝纤维化相关基因和/或蛋白表达的影响等研究结果表明，2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物具有良好的肝损伤保护作用和抗肝纤维化活性，安全性较高，有望发展成为肝损伤保护、肝纤维化防治的有效药物。
【IPC分类】A61K31/18, A61P1/16
【公开号】CN105395532
【申请号】CN201510830392
【发明人】邵荣光, 王玉成, 李娜仁, 蔡仕英, 何红伟, 王菊仙, 赵双双, 葛茂旭, 任金凤
【申请人】中国医学科学院医药生物技术研究所
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月25日