BCR-ABL蛋白泛素化水平。
[0031]图11是BCR-ABL蛋白可以与小檗碱模拟对接的空间结构示意图；其中，A: BCR-ABL 蛋白羧基末端（1519aa~1644aa)的F肌动蛋白连接区域（1ZZP)与小檗碱模拟对接;B: BCR-ABL蛋白中间部位（743aa~1028aa)的Protein Kinase区域（2ZQ0H)与小檗碱模拟对接;C: BCR-ABL蛋白中间部位（743aa~1028aa)突变后的Protein Kinase区域(3IK3)与小檗碱模 拟对接;D: BCR-ABL蛋白SH2区域(635aa~746aa，3K2M)与小檗碱模拟对接。
【具体实施方式】
[0032]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0033] MTT和DMS0及甲基纤维素购自Sigma公司；胎牛血清及RPMI-1640培养基购自Gibco 公司；Lipofectamine? 2〇00购自 Invitrogen公司；Anti-Ubiquitin Mouse mAb(FK2)购自 美国美国MILLIP0RE公司；Protein A/G PLUS-Agarose购自美国SIGMA公司；IgG antibody (H-270)购自美国SIGMA公司；Ant i-Bcr ant ibody购自美国ABCAM公司。
[0034] 人慢性粒细胞白血病K562细胞株购于中国科学院上海细胞库；BaF3-P210、BaF3-P210-T315I细胞株由重庆医科大学医学检验系临床血液学教研室提供(陈熙.干扰Apg-2基 因在BaF3-p210及BaF3-p210-T3151中的作用研究[D].重庆医科大学，2012.)，BaF3-P210细 胞中含有P210BCR-ABL蛋白，是一种慢性粒细胞白血病细胞系的模型，BaF3-P210-T315I细 胞是一种BCR-ABL突变引起耐伊马替尼的细胞模型;KCL-22(BCL6-mediated repression of p53is critical for 1 eukemia stem cell survival in chronic myeloid leukemia. J Exp Med.20110ct 24;208(11) :2163-74.)和SF02细胞（BCL6enables Ph+ acute lymphoblastic 1 eukaemia cells to survive BCR - ABL1kinase inhibition.Nature. 2011May 19;473(7347) :384-8)由美国洛杉矶儿童医院提供；
[0035] K562、KCL-22、BaF3-P210三个细胞是正常表达BCR-ABL蛋白的慢性粒细胞白血病 细胞，对伊马替尼（imatinib)的治疗敏感;BaF3-P210-T315I是表达BCR-ABL蛋白发生突变 的慢性粒细胞白血病细胞，其中T315I对伊马替尼（imatinib)的治疗不敏感敏感，也就是耐 药细胞，这种突变是慢性粒细胞白血病耐药的主要方式;SF02是正常表达BCR-ABL蛋白的慢 性粒细胞白血病细胞，但对伊马替尼（imat inib)的治疗不敏感，也就是耐药。
[0036]实施例1小檗碱处理细胞株检测细胞活力
[0037] 1(562、3?02细胞、8&?3-?210和83?3-?210-了3151细胞接种于含体积分数10%的胎 牛血清、有抗生素的RPMI-1640培养基中，放置在37°C、5 %的⑶2培养箱中，饱和湿度下培 养，每隔一天换液传代;取对数生长期的K562、SF02细胞、BaF3-P210和BaF3-P210-T315I，各 组细胞以lX10 8cell/L的密度接种于96孔板中，每孔中100μΜ每种细胞分为小檗碱组、伊 马替尼组、小檗碱+伊马替尼组和空白组，每组设3个重复孔，每孔加入含有相应浓度药物的 培养基l〇〇yL，对照组加入空白培养基，总体积为200yL;加完药物之后，放入培养箱中培养 48h或72h;细胞加药处理48h或72h后每孔加入MTT液20yL，于培养箱中培养4h，然后10000r/ min离心20min;弃上清，然后每孔加入150yL DMS0,放在摇床上震荡10min，溶解结晶；在多 功能酶标仪上测定吸光度A570，实验重复3次，计算增殖抑制率:增殖抑制率（％ ) = (1-A实 验组/A对照组）X 100%。
[0038]图1是小檗碱和/或伊马替尼处理BaF3_P210细胞后细胞相对活力影响的结果分 析。其中，BaF3-P210细胞的细胞活力随着小檗碱浓度增加有降低的趋势，小檗碱处理BaF3-P210细胞48h和72h后，细胞活力变化相同（图1A和图1B)。小檗碱(终浓度5μΜ)和伊马替尼 (终浓度0.5、1、1.5、2μΜ)联合处理BaF3-P21048h，小檗碱可以增加细胞对伊马替尼的敏感 性(图1C)。
[0039]图2是小檗碱和/或伊马替尼处理BaF3-P210-T315I细胞后细胞相对活力影响的结 果分析。其中，BaF3-P210-T315I细胞的细胞活力随着小檗碱浓度增加有降低的趋势;而伊 马替尼浓度的增加对BaF3-P210-T315I细胞的细胞活力没有明显的影响。小檗碱或伊马替 尼处理BaF3-P210-T315I细胞48h或72h后，细胞活力变化相同（图2A和图2B)。小檗碱(终浓 度0~8μΜ)和伊马替尼(终浓度0~8μΜ)联合处理耐药细胞株BaF3-P210-T315I细胞后，小檗 碱可以增加耐药细胞对伊马替尼的敏感性（图2C)。根据图2中的数据，可计算出小檗碱对 BaF3-P210-T315I细胞的半数抑制率为5μΜ。
[0040]图3是小檗碱和伊马替尼分别处理SF02细胞48h后对SF02细胞相对活力影响的结 果分析。其中，小檗碱浓度的增加，使得SF02细胞的细胞活力降低。伊马替尼浓度增加，SF02 细胞的细胞活力有降低的趋势。但是在一定浓度范围内，伊马替尼对SF02的细胞活力没有 明显的影响。
[0041 ]图4是小檗碱和/或伊马替尼处理K562细胞后细胞相对活力影响的结果分析。其 中，随着小檗碱浓度的增加，K562细胞的相对活力有降低的趋势；小檗碱或伊马替尼处理 K562细胞48h和72h后细胞活力变化有相同的趋势（图4A和图4B)。小檗碱(终浓度5μΜ)和伊 马替尼（终浓度0.5、1、1.5、2μΜ)联合处理K562细胞，小檗碱可以增加 K562细胞对伊马替尼 的敏感性（图4C)。
[0042] 综上所述，用不同浓度的小檗碱处理对伊马替尼敏感的人类CML细胞(K562、BaF3- P210)和耐药性细胞株(BaF3-P210-T315I和SF02)，并与伊马替尼对照。实验结果显示，小檗 碱在5μΜ浓度处理24h时，不仅可以抑制敏感K562和BaF3-P210细胞活力，也显著抑制耐药的 BaF3-P210-T315I和SF02细胞细胞活力。伊马替尼和小檗碱联合作用于敏感K562、BaF3-P210和耐药的BaF3-P210-T315I，实验显示，小檗碱可以增加 K562、BaF3-P210对伊马替尼敏 感性和克服BaF3-P210-T315I细胞对伊马替尼的耐药性。小檗碱最佳作用K562和BaF3-P210-T315I 浓度为 5μΜ。
[0043] 实施例2小檗碱对BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞集落形成的影响
[0044]本实施例采用由甲基纤维素为载体的集落形成法(colony forming method)检测 细胞的自我更新和增殖能力。实验分组小檗碱组、伊马替尼组和空白组，小檗碱浓度选为5μ Μ，伊马替尼浓度5μΜ。取对数期生长的BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞，按1 X 103cell/L (含相应浓度处理药物)接种于2mmol/L的L-谷氨酰胺，含体积分数20%胎牛血清，5ymol/L β-巯基乙醇和质量分数0.9%甲基纤维素的固体培养基中，放置在37°C、5%的培养箱中。培 养箱中放置一个星期。一周后倒置显微镜下计数群落数，一个集落至少包含40个细胞。 [0045] 图5是小檗碱和伊马替尼分别处理BaF3-P210-T315I细胞后colony结果分析。其 中，小檗碱处理的BaF3-P210-T315I细胞的集落数明显比空白组的数量少且差异显著（P〈 0.05)。伊马替尼处理耐药的BaF3-P210-T3151细胞后的集落数与空白组的集落数相比没有 显著差异。
[0046]图6是小檗碱和伊马替尼分别处BaF3_P210细胞后colony结果分析。其中，小檗碱 处理的BaF3-P210细胞的集落数明显比空白组的数量少且差异显著(P〈0.05)。伊马替尼处 理BaF3-P210细胞后的集落数与空白组的集落数相比也出现了显著差异(P〈0.05)。
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