新的EP管中，使用 Bradford蛋白浓度测定试剂盒的说明书测定蛋白浓度。测得蛋白浓度后，根据lmg蛋白加入 2yL BCR抗体(Anti-Bcr antibody购自美国ABCAM公司），放在旋转式摇床上，4°C孵育过夜。 第二天，每管中加入40yL Protein A/G.。旋转式摇床上，4°C孵育4h。孵育结束后，放入低温 离心机中。温度设为4°C，2500rpm离心5min。去上清，每管加入lmL的PBS洗涤Protein A/G，4 °C，2500rpm离心5min。重复三次。每管加入40yLl X上样缓冲液，沸水中煮lOmiruWestern blot上样量为5yL。Western blot实验步骤如实施例4。
[0060] (3)结果分析：
[0061] 本实施例Western blot检测了小檗碱处理BaF3_P210后细胞中所有蛋白的泛素化 水平的改变，结果如图10A所示，经过小檗碱处理12h后的BaF3-P210细胞，细胞内的泛素化 水平明显增多。但是，随着时间的延长，细胞的泛素化水平又降低到一定水平。这说明，小檗 碱可以在一定时间内增加 BaF-P210细胞内总的泛素化水平，但是这种改变受到时间的限 制。
[0062] 选取小檗碱处理K562、BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞24h后，分别使用免疫沉 淀的方法检测各细胞中的BCR-ABL泛素化水平，结果如图10所示。图10B中显示经过小檗碱 处理的K562细胞中的BCR-ABL蛋白发生了泛素化；图10C显示小檗碱处理BaF3-P210细胞中 的BCR-ABL蛋白发生了泛素化；图10D显示小檗碱处理BaF3-P210-T315I细胞中的BCR-ABL蛋 白发生了泛素化:MG132可以抑制蛋白酶体的活性，进而阻断被泛素化的BCR-ABL蛋白的降 解，从图中可以看出MG132和小檗碱共同作用于BaF3-P210-T315I的条带比空白组有增加的 趋势，这表明经过小檗碱处理的BaF3-P210-T315I中的BCR-ABL也发生了泛素化。
[0063]综上所述，在小檗碱处理BaF3_P210细胞时，发现小檗碱可以增加细胞内蛋白的整 体泛素化水平。采用针对BCR-ABL免疫沉淀（IP)，使用泛素化抗体Western blot检测发现 BCR-ABL蛋白发生了泛素化。
[0064]实施例7分子模拟对接小檗碱与BCR-ABL蛋白
[0065]从蛋白质数据库中找到BCR-ABL蛋白三维空间结构的文件;在药物数据库中找 到小檗碱的三维空间结构PDB文件。从Disco very的官网上下载免费使用的Dico very Studio4.1软件。下载完软件Discovery Studio4.1后，将小檗碱和BCR-ABL蛋白的三维结构 导入进入软件中。观察小檗碱与BCR-ABL蛋白的某些空间结构结合或者小檗碱插入到BCR-ABL蛋白空间结构中去的结果。
[0066] Discovry Studio软件分析小檗碱与BCR-ABL可对接的位点对接结果如图11，小檗 碱可以与BCR-ABL中的SH2区域、蛋白激酶区域和F肌动蛋白结合区域对接上。并且在小檗碱 的活性作用区域，都发现有潜在泛素化位点Lys的存在，说明可能的泛素化位点的存在。 [0067] 本发明使用小檗碱处理对伊马替尼敏感的K562、BaF3_P210细胞和耐药细胞株 BaF3-P210-T315I细胞，发现小檗碱可以抑制K562、BaF3-P210细胞和耐药细胞株BaF3-P210-T315I和SF02的细胞活力；且小檗碱和伊马替尼联合处理细胞后，小檗碱可以增加 K562、BaF3-P210细胞和耐药的BaF3-P210-T315I对伊马替尼的敏感性。细胞克隆形成实验 则证明小檗碱可以显著降低BaF3-P210-T315I和BaF3-P210细胞的集落形成能力，有效抑制 细胞的恶性程度。进一步研究发现，小檗碱可以降解细胞BaF3-P210-T315I细胞和BaF3-P210细胞中的BCR-ABL蛋白表达量:耐药细胞株和不耐药的细胞株经过小檗碱处理后，BCR-ABL蛋白都有明显降解现象。同时，对BCR-ABL的mRNA水平检测发现，小檗碱不能引起BCR-ABL mRNA水平的变化。以上结果表明，小檗碱直接作用于耐药株和敏感细胞株中的BCR-ABL 蛋白，而不影响BCR-ABL的mRNA表达水平。
[0068]对细胞整体水平的泛素化检测结果结果显示:小檗碱可以在一定时间内增加 BaF-P210细胞内总的泛素化水平，但是这种改变受到时间的限制。经过小檗碱处理K562、BaF3-P210细胞中的BCR-ABL泛素化水平都明显增加。MG132和小檗碱共同作用于BaF3-P210-T315I的条带比空白组有增加的趋势，这表明经过小檗碱处理的BaF3-P210-T315I中的BCR-ABL也发生了泛素化。
[0069] 本发明对小檗碱分子与BCR-ABL蛋白进行分子对接模拟，发现BCR-ABL共有3部位 (SH2区域、蛋白激酶区域和F-肌动蛋白连接区域)可以与小檗碱分子对接上。进一步观察发 现，小檗碱与BCR-ABL蛋白的对接处序列中发现赖氨酸存在，提示泛素化位点的存在。
[0070] 综上所述，小檗碱可以影响到CML耐药细胞株和不耐药细胞株的细胞活力和细胞 的恶性程度。同时还发现小檗碱能够降解BCR-ABL蛋白，然而不改变BCR-ABL的mRNA水平。进 一步研究BCR-ABL蛋白降解机制，发现小檗碱可以通过泛素化的途径降解BCR-ABL蛋白。本 研究为CML耐药治疗需找了一种可能的治疗方案。为治疗和克服CML耐药，找到新的视角。同 时，也为传统的中药小檗碱找到了新的靶点。
[0071] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物 增敏剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒 细胞白血病药物增敏剂中的应用，其特征在于： 所述的小檗碱通过促进BCR-ABL融合蛋白泛素化降解进而克服慢性粒细胞白血病耐药 性或增加抗慢性粒细胞白血病药物对慢性粒细胞白血病的敏感 性。3. 根据权利要求1所述的小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒 细胞白血病药物增敏剂中的应用，其特征在于： 所述的慢性粒细胞白血病耐药性为慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼的耐药性。4. 根据权利要求1所述的小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒 细胞白血病药物增敏剂中的应用，其特征在于： 所述的克服慢性粒细胞白血病耐药性药物为慢性粒细胞白血病耐药性逆转剂。5. -种克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂，其特征 在于:包含小檗碱或其药学上可接受的盐，以及小檗碱或其药学上可接受的盐的溶剂化合 物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物。6. 根据权利要求5所述的克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药 物增敏剂，其特征在于： 所述的克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂含有一 种或者是至少两种药学上可以接受的载体。7. 根据权利要求6所述的克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药 物增敏剂，其特征在于： 所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载 体、表面活性剂或润滑剂。8. 根据权利要求5所述的克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药 物增敏剂，其特征在于： 所述的克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂进一步 制成注射剂、片剂、粒剂或胶囊。9. 一种小檗碱在制备促进BCR-ABL融合蛋白泛素化降解产品中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，具体涉及一种小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂中的应用。所述的小檗碱可以增加慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼的敏感性和克服慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼的多药耐药性。其中，小檗碱主要通过泛素化的机制降解BCR-ABL蛋白进而克服由于T315I突变引起的慢性粒细胞白血病的多药耐药性。
【IPC分类】A61K36/29, A61P35/02, A61K36/756, A61K36/718, A61K31/4375
【公开号】CN105616409
【申请号】CN201610125214
【发明人】费嘉, 丰茂晓, 阴钊, 古春明, 杨菊华
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月4日