]综上所述，小檗碱对耐药细胞的细胞集落能力（colony)的影响实验结果显示:小 檗碱可以有效抑制耐药BaF3-P210-T315I细胞的集落形成，有效抑制细胞的恶性程度;而伊 马替尼不能显著抑制BaF3-P210-T315I细胞的集落形成;小檗碱也可以有效抑制BaF3-P210 细胞的集落形成，有效抑制细胞的恶性程度。
[0048] 实施例3 Real time PCR检测BCR-ABL mRNA水平
[0049] (1)总RNA的提取:小檗碱处理BaF3-P210-T315I细胞、BaF3-P210细胞和K562细胞 24h后，1500rpm，离心5min收集细胞于1.5mL EP管中，加入500yLTrizol试剂，吹打混匀细 胞，冰上静置5min;加入100yL氯仿(氯仿:Trizol = l :5)，剧烈震荡15sec，冰上静置lOmin; 12000rpm，4°C离心15min，吸取上清置于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇(大约200yL)， 震荡均匀，_20°C静置1011^11，12000印111，4°(：离心101^11 ;弃上清4?管底部可见白色沉淀;每 管加入500yL体积分数为75%的乙醇（用RNase-free ddH20配制），洗涤RNA沉淀；洗涤后， 12000rpm，4°C离心5min，此步骤重复3次；弃上清，室温干燥2~3min，加入RNase-free ddH 20 30yL，轻轻吹打将沉淀完全溶解；
[0050] (2)cDNA的合成(FastQuant RT Kit(with gDNAase)，天根生物科技(北京）有限公 司）：根据RNA浓度，计算2yg RNA所需的体积。建立20yL反应体系；将RT试剂中的试剂解冻 后，迅速放在冰上;使用前将每种溶液涡旋震荡混匀，简短离心收集管壁上的残留液体;根 据试剂盒提供步骤剂量去除体系中基因组DNA(5XgDNA Buffer 2yL，2yg Total RNA;并用 RNase-Free ddH20补足到10yL，彻底混匀；短暂离心，并置于42°C，孵育3min，然后放在冰 上；配制逆转录反应体系混合液（10 XFast RT Buffer 2yL;RT Enzyme Mix lyL;FQ-RT Primer Mix 2yL;RNase-Free ddH20 5yL)将上述试剂充分混匀，加到gDNA去除步骤的反应 液中，再次充分混匀;然后进行PCR，程序设定为:42°C，孵育15min; 95°C，孵育3min;之后放 于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存；
[0051] (3)Real time PCR(SuperReal PerMix Plus(SYBR Green)购自天根生物科技（北 京）有限公司）：将Real time PCR中的试剂，模板，引物和RNa se-Free ddH20室温溶解，彻 底混勾，在冰上进行Real time RCR反应液的配制；20yL反应体系：2XSuperReal PreMix Plus 10yL；Forward primer 0.6yL；Reberse primer 0.6yL；cDNA 2yL；RNase-Free ddH2〇 补足到20yL;然后盖上反应管，轻柔混匀，可短暂离心，确保所有组分在管底;将反应体系放 入荧光定量PCR仪中，按照如下程序进行反应 ：l、95°C15min;2、95°C10sec;3、55°C30sec;4、 72°C30sec;5、Plate read Go to 2,39more times;6、Mlet-curve 65〇Cto95〇Cincrement 0.5for 5sec+plate read; 7、End.开始运行程序，程序结束关闭仪器。分析数据，革El基因的 mRNA的相对表达水平用ACT和2_^eT计算。β-actin mRNA作为内参照;其中，引物序列如下： BCR-ABL-Forward primer：AGCATTCCGCTGACCATCAA；BCR-ABL-Reverse primer： GCCTAAGACCCGGAGCTTTT，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
[0052] 终浓度为5μΜ的小檗碱处理K562、BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞24h后，提取 细胞内总RNA，逆转录，然后进行Real time PCR检测小檗碱对BCR-ABL mRNA水平的影响，结 果如图7所示:小檗碱对细胞内BCR-ABL mRNA表达水平没有显著性的影响。
[0053] 实施例4 Western blot检测细胞中BCR-ABL蛋白水平
[0054] 取对数生长期的细胞以30X 104cell/L的密度接种于六孔板中每孔中2mL，实验分 小檗碱组和空白组，檗碱浓度选择5μΜ;小檗碱作用一段时间（Oh，4h，12h，24h)后，收集细胞 于1.5mL EP管中，5000rpm离心5min收集细胞，弃上清;PBS洗细胞，吹打均勾，5000rpm离心 5min收集细胞;根据细胞沉淀量，加入适量的细胞裂解液(RIPA细胞裂解液购自碧云天公 司）将细胞完全裂解:冰上裂解30min ;4°C，13000rpm离心30min，吸取上清到另一个干净EP 管中，按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒(购自北京科为世纪生物有限公司）的说明书测定 蛋白浓度;按比例添加上样缓冲液，计算50yg蛋白所需的上样量;加入上样缓冲液后，沸水 浴中煮沸5min;配制SDS-PAGE胶，上样，80V电泳30min，120V电泳lh;电泳结束，转膜;在半干 转装置中按照从下到上依次为:滤纸、膜、凝胶、滤纸，用玻璃棒赶压气泡，盖上仪器盖，12V， 40min;转膜结束后，封闭:将PVDF膜放入质量分数5%脱脂奶粉的封闭液中，室温条件下，在 摇床上摇动lh;封闭结束后，孵一抗(C-ABL单克隆抗体购自美国SANTA CRUZ公司），按照比 例稀释抗体，将PVDF膜放入的抗体中，4°C摇床上孵育过夜;孵育结束后，TBST洗涤PVDF膜三 次，摇床上洗涤5min;室温孵育二抗（鼠源二抗IgG-HRP购自美国SANTA CRUZ公司），选取合 适比例浓度的二抗，用抗体稀释液稀释;将PVDF膜放入稀释好的二抗中；孵育结束后，TBST 洗涤PVDF膜三次，摇床上洗涤10min;化学发光:按照说明书配制发光液(A、B液1:1混匀），将 发光液均匀滴加到PVDF膜上，放入ALLIANCE4.7凝胶成像系统中进行拍照。以内参蛋白（β-actin或GATOH)比较BCR-ABL蛋白相对表达水平。
[0055]检测到小檗碱对BCR-ABL mRNA的表达水平没有影响后，同样选用终浓度为5μΜ的 小檗碱处理BaF3-P210-T315I细胞4h、12h和24h，收集细胞提取蛋白进行Western blot检测 BCR-ABL蛋白的表达水平。如图8所示，在BaF3-P210-T315I细胞中小檗碱浓度一定时，随着 小檗碱处理时间增加，相比于内参β-actin蛋白，BCR-ABL蛋白出现了降低的趋势。同样选用 终浓度为5μΜ的小檗碱处理BaF3-P210细胞4h、12h和24h，收集细胞提取蛋白进行western blot检测BCR-ABL的表达水平。如图9所示，小檗碱浓度一定时，随着小檗碱处理时间增加， 相比于内参β-actin蛋白，BCR-ABL蛋白出现了降低的趋势。
[0056] 综上所述，小檗碱作用后，细胞中BCR-ABL蛋白水平和mRNA检测结果表明：小檗碱 显著降低BaF3-P210-T315I和BaF3-P210细胞系中的BCR-ABL蛋白水平，而对BCR-ABL的mRNA 水平无显著改变，因而可以认为小檗碱降解BCR-ABL融合蛋白。
[0057] 实施例5检测BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞内泛素化水平
[0058] (1 )Western blot:为了探索小檗碱引起BCR-ABL蛋白降解的机制，采用Western blot检查细胞的泛素化水平，具体方法和操作步骤同实施例4, 一抗为Anti-Ubi quit in Mouse mAb(FK2)(购自美国美国MILLIPORE公司）。
[0059] (2)免疫沉淀:蛋白提取步骤如实施例4，每组蛋白提取液中加入5yL IgG抗体（IgG 抗体的种属与目的蛋白抗体的种属一致，IgG antibody(H-270))(购自美国SIGMA公司），同 时每管加入30yL Protein A/G。放在旋转式摇床上，4°C摇匀30min。摇匀结束后，将离心管 放入低温离心机中。温度设为4°C，2500rpm离心5min。收集上清到新的EP管中，每管再加入 30yL Protein A/G PLUS-Agarose(购自sigma公司）。放在旋转式摇床上，4°C摇勾30min。摇 匀结束后，将离心管放入低温离心机中。2500rpm离心5min。收集上清到