中 间值为3次。距离癌发病的期间设为从保存开始直至癌发病的月数。
[0176] (给药组和非给药组的分布）
[0177] 两组全部例子的分布即年龄（图3)及保存期间（图4)在统计学上无显著性差异。给 药组和非给药组的总体并无差异，由此可知：可以在两组的比较中统计性地表示通过给药 NK细胞而对癌发病进行抑制的情况。
[0178](给药组的癌发病抑制效果的确认）
[0179]在保存期间被诊断为癌症者，在"给药组"中有1例，在"非给药组"中有7例(表2、图 5及图6)。由以该保存期间为横轴的发病率曲线进行时序检验(Logrank test)(图7)。结果 确认到两组的癌发病率有显著性差异，其相对危险性(Relative Risk)为0.24,通过给药， 使癌症被抑制76 %。
[0180] [表 2]
[0181] 癌发病部位和直至发病的保存期间
[0183](通过给药NK细胞对癌发病进行抑制与其他癌症预防法的比较）
[0184] 示出作为已知的癌症预防法的硒（BJU Int .2003; 91:608)、咖啡（Nutr .Cancer 2010 ;62:21)、绿茶(Am. J.Epidemiol .2008; 167:71)、三苯氧胺（Lancet 2003; 361:296)、雷 洛昔芬（JAMA. 1999;281:2189)、阿斯匹林（J.Natl .Cancer Inst.2009; 101:256)和本发明 的癌发病抑制效果(表3、图8)。本发明的癌发病抑制效果显示出比其他方法更优异的效果。
[0185] [表 3]
[0186] 各种癌症预防的相对危险率
[0188] 实施例三
[0189] (通过给药活化NK细胞使抗体效价升高的确认）
[0190]将源自5名健康人(A~E)的活化NK细胞以及HB疫苗分别给药给其自身1~3次，确 认到抗体效价的升高。
[0191] 作为对照，将源自健康人(F~H)的"未大量增殖NK细胞的活化T淋巴细胞"以及HB 疫苗分别给药给其自身，确认到抗体效价的升高。
[0192] 另外，未大量增殖NK细胞的活化T淋巴细胞的培养和增殖方法如下。
[0193] (活化T淋巴细胞的培养和增殖方法）
[0194] 为得到自活化T淋巴细胞，通过以下工序进行了外周血淋巴细胞的培养和增殖。
[0195] (工序 1)
[0196] 相对于磷酸缓冲液(PBS)20ml，在活化T细胞的培养中，制作抗CD3抗体5μ1/πι1(正 克隆0ΚΤ3，从杨森制药公司获得)的溶液。
[0197] (工序 2)
[0198] 将工序1的溶液分别分注在不同的225cm2的烧瓶中，在4°C下静置一晚。
[0199] (工序 3)
[0200] 将工序2的烧瓶用PBS清洗2次。
[0201] (工序 4)
[0202] 从健康人（F~H)采取肝素抗凝外周血30ml，利用将Ficoll-Paque Plus(可从 Amersham Pharmacia Biotech株式会社获得)用作介质的密度梯度离心法分离外周血单核 细胞(PBMC)。
[0203] (工序 5)
[0204] 使工序4中分离出的PBMC以0.5X IO6~IX IO6个/ml的浓度悬浮在包含IL-2(500单 位/ml、Chiron公司）的NKGM培养基(从日本KOHJIN生物有限公司获得）中，再添加患者血浆 2%~10%，制成培养液。在该阶段，培养液为60ml~120ml。将该培养液添加到工序3中得到 的经固相化抗体处理后的培养烧瓶中。然后，在5 % C〇2培养器内37 °C的环境下进行培养。
[0205] (工序 6)
[0206] 在从培养开始起的第3~5天，培养出多个菌落，确认已母细胞化(blast化)后，再 追加20 %~100 %培养液，并添加了 500单位/ml的IL-2。通常，该时期是从培养开始起第3 天。
[0207] (工序 7)
[0208] 在从在工序6中追加培养液后进入对数增殖期的第1~3天(多为第1天），将含有活 化淋巴细胞的培养液注入NKGM-B(1升装的袋）。通常将其分注入2~3袋。分注后，以3~4天 为间隔，每袋添加 100mL~300ml NKGM培养基及10万单位~20万单位IL-2。
[0209] (工序 8)
[0210]在培养开始起第14~21天，将培养液从袋转移到离心管中，将其以600G离心10分 钟。从离心管吸引上清液而残留颗粒后，对颗粒加入PBS进行清洗，再次进行离心操作。重复 该操作2~3次，充分清洗培养淋巴细胞。最后，收集颗粒，使其悬浮在生理食盐水100mL中， 在其中添加人血清白蛋白2%~4%。最后，确认到无菌测试、内毒素测试为阴性。
[0211](培养活化NK细胞或者T细胞给药以及B型肝炎疫苗的给药顺序）
[0212]对于NK细胞给药组，向5名健康人(A~E)从其肘静脈给药自身的培养活化NK细胞， 3天后，肌肉注射基因重组HB疫苗0.5ml (Bimmugen，日本财团法人化学及血清疗法研究所）。 在给药疫苗4周后，调查HBs抗体效价。在该组合中，在第1次后的6周之后进行第2次，在6个 月后进行第3次。另外，对于A和C在1次给药后结束。
[0213]另外，作为对照，对于T淋巴细胞给药组，向3名健康人(F~H)分别静脉注射"不含 大量NK细胞的培养活化T淋巴细胞"，并将HB疫苗给药给其自身。给药的间隔与NK给药组相 同。
[0214] (NK细胞数的测量）
[0215]取包含实施例一中得到的NK细胞的培养淋巴细胞(悬浮在生理食盐水中）及悬浮 在上述生理食盐水中的淋巴细胞放入微量离心管(Eppendorf tube)中，在其中加入规定的 标记抗体，利用常规方法将细胞染色。对于染色过的细胞立即用流式细胞计进行解析，测量 CD3-CD56+NK 细胞数。
[0216] (NK细胞数的测量结果）
[0217] 将包含实施例一中得到的NK细胞的培养淋巴细胞及悬浮在上述生理食盐水中的 淋巴细胞中的NK细胞数的平均值示于图9中。
[0218] 图9是标绘了各例的给药NK细胞数的平均值的图。在NK细胞给药组(A~E)中给药 NK细胞数的平均值为4.8 X IO9个，而在T淋巴细胞给药组(F~H)中给药NK细胞数的平均值 为0.5 X IO9个。由此，与T淋巴细胞给药组相比较，NK细胞给药组中给药了约10倍的NK细胞。
[0219] (HBs抗体效价的测量方法）
[0220] 使用自身公知的CLIA法（化学发光免疫分析法、chemilumine scent immunoassay)测量从上述给药前后的健康人A~H获得的血中的HBs抗体效价。该方法的正 常值小于10. 〇mIU/ml。
[0221] (HBs抗体效价的测量结果）
[0222] 将从健康人A~H获得的血中的HBs抗体效价示于图10和图11中。在5例的4例 (80% :A、B、C、D这4名）中，能够诱导显著高的抗体效价(参照：图10)。
[0223] 另一方面，在作为对照的活化T淋巴细胞(给药的NK细胞少于1亿个)和B型肝炎疫 苗的给药中，未发现抗体效价的明显升高(参照：图11)。
[0224] 由以上可知，通过给药NK细胞及B型肝炎疫苗，能够提高抗体效价。尤其是当还考 虑到健康人A~D是抗体效价不易升高的60岁以上的男性时，本发明表现出非常优异的抗体 效价升高效果。
[0225] (总论）
[0226]由上述实施例三的结果可知，当将NK细胞以及肝炎疫苗给药给患者时，能够治疗 肝炎。
[0227] (产业上的可利用性）
[0228] 本发明能够提供新型的癌发病抑制剂及抗体产生能力增强剂。
【主权项】
1. NK细胞作为有效成分在制备疫苗的抗体产生能力增强剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疫苗为肝炎疫苗。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝炎疫苗为B型肝炎疫苗。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的应用，其特征在于，所述NK细胞为活化NK细胞。5. 根据权利要求1~3中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗体产生能力增强剂的 给药对象为60岁以上的人。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗体产生能力增强剂的给药对象为60 岁以上的人。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述给药对象为男性。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述给药对象为男性。
【专利摘要】本发明的课题在于提供癌发病抑制剂、抗体产生能力增强剂及肝炎治疗剂；本发明人发现：通过给药NK细胞，抑制健康人的癌的发病，并通过将NK细胞和疫苗给药给患者，使抗体产生能力增强，由此完成了本发明。
【IPC分类】A61K35/17, A61P37/04, A61P1/16, A61K39/29, A61P35/00
【公开号】CN105688205
【申请号】CN201610100875
【发明人】益山纯一, 藤田实彦
【申请人】株式会社赛莱克斯, 益山纯一, 藤田实彦
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2011年3月2日