专利名称：一种制备异戊二烯的重组细胞及其制备方法
技术领域：
本发明涉及异戊二烯化合物的制备领域，特别涉及利用重组细胞生物法制备异戊二烯的领域。
背景技术：
异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法 (包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸 (MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体，细菌，藻类。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)，之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。因此增加异戊二烯前体物质 DMAPP的含量是提高异戊二烯产量的重要因素之一。微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。目前，随着分子生物学技术的发展，研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。 例如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了 50微克/克干细胞/天的产率(Pia Lindberg等，2009)，但藻类生长缓慢、生物量低下是利用藻类制备异戊二烯的瓶颈问题。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而利用工程菌发酵生产异戊二烯(美国专利公开，2009/020310 。该工程菌中获得外源MVA途径时需要转入多达8个异源基因，由于过多的异源基因才表达可能会导致细胞自身代谢的紊乱，影响细胞的正常生长代谢，最终导致目标产物产量低下。
发明内容
本发明提出利用可再生资源葡萄糖为原料，通过生物催化剂制备异戊二烯，建立可持续发展的异戊二烯合成工艺路线。本发明主要通过基因工程手段提高甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径中限速酶活性 (脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)，异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi))，增加异戊二烯的合成前体物DMAPP，再利用植物异戊二烯合成酶将DMAPP催化合成目标产物异戊二烯。最终在大肠杆菌细胞中成功建立一种异戊二烯生物合成代谢途径。本研究方法是利用大肠杆菌原有的MEP代谢途径，避免了由于过多外源基因的表
3达而导致细胞自身的代谢的影响，同时通过高效表达代谢途径的限速酶基因，优化MEP代谢途径，提高DMAPP的含量，组合植物的异戊二烯合成酶基因，最终在大肠杆菌中构建生物基异戊二烯合成途径。更具体地，本发明提供以下各项1、一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括在重组细胞体内，通过基因工程手段提高甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径中的3个限速酶(即脱氧木酮糖5-磷酸合成酶(dxs)，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶(dxr)和异戊烯基焦磷酸异构酶(idi))的活性，再通过表达外源的植物异戊二烯合成酶基因(IspQ合成异戊二烯的步骤。2、根据第1项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶和异戊烯基焦磷酸异构酶活性的提高是通过过表达内源或外源的脱氧木酮糖 5-磷酸合成酶基因(dxs)、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)实现的。3、根据第2项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)是来源于1)埃希氏菌属大肠杆菌，或幻来源于其他细菌，优选枯草芽孢杆菌，或幻和dxs基因同源性超过70%的核酸序列，或4)来源于其它生物体，和dxs基因没有明显的同源性，但和 dxs基因具有相同或相似功能的核酸序列。4、根据第2项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)是来源于1)埃希氏菌属大肠杆菌，或幻来源于其他细菌，优选枯草芽孢杆菌，或幻和dxr基因同源性超过70%的核酸序列，或4)来源于其它生物体，和dxr基因没有明显的同源性，但和 dxr基因具有相同或相似功能的核酸序列。5、根据第2项所述的方法，其中所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)是来源于 1)埃希氏菌属大肠杆菌，或幻来源于其他细菌，或幻来源于酵母，优选酿酒酵母，或4)和 idi基因同源性超过70%的核酸序列，或幻来源于其它生物体，和idi基因没有明显的同源性，但和idi基因具有相同或相似功能的核酸序列。6、根据第1或2项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶、脱氧木酮糖 5-磷酸还原酶和异戊烯基焦磷酸异构酶这三种酶活性的提高可增加异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的含量。7、根据第1项所述的方法，其中所述异戊二烯合成酶基因(IspQ是来源于1)植物，优选杨树，或幻和IspS基因同源性超过70%的核酸序列，或幻来源于其它生物体，和 IspS基因没有明显的同源性，但和IspS基因具有相同或相似功能的核酸序列。8、重组细胞，其中过表达脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)、异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)以及异戊二烯合成酶基因(IspS)。9、根据第8项所述的重组细胞，其优选为细菌细胞，更优选为埃希氏菌属大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。10、根据第1项所述的方法、根据第8或9项所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物包括异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。附图简述
图1是利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛生物合成异戊二烯代谢途径示意图；图2是载体构建示意图(PYJM6质粒图谱)；图3是载体构建示意图(pYJMll质粒图谱)；图4显示通过本发明的重组细胞发酵生产异戊二烯的产量；图 5 是Populus alba ispS mRNA(optimized sequence)1683bp ；图 6 是Populus alba χ Populus tremula ispS mRNA(sequence)；图 7 是 Populus nigra mRNA for isoprene synthase (IspS gene)0
具体实施例方式以下将以实施例方式，详细描述本发明实施例1通过在大肠杆菌中共同过量表达来源于E. coli的脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因 (dxs)，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)，异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)和异戊二烯合成酶基因(IspS)，利用葡萄糖降解中间产物丙酮酸和3-磷酸甘油醛生物合成异戊二火布。1. 1外源基因的克隆和表达载体的构建1.1.1外源基因的克隆1. 1. 1. IE. coli脱氧木酮糖5_磷酸合成酶基因的克隆提取E. coli (ATCC No. 10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)，GenBank登记号6059543。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。扩增引物序列为Ds-L :5，-CGCGGATCCGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCGA-3'DS-R :5’ -CATGGAGCTCTTATGCCAGCCAGGCCTTGATT-31. 1. 1. 2E. coli的脱氧木酮糖5_磷酸还原酶基因的克隆提取E. coli (ATCC No. 10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因dxr，GenBank登记号945019。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。扩增引物序列为Dr-L 5' -CGCGGATCCGAAGCAACTCACCATTCTGG-3‘Dr-R :5，-CCCAAGCTT TCAGCTTGCGAGACGCAT-3，1. 1. 1. 3E. coli的异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆提取E. coli (ATCC No. 10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi，GenBank登记号949020。再利用胶回收试剂盒回收目的基因。扩增引物序列为IDI-L :5，-GGGTTTCATATGATGCAAACGGAACACGTCAT-3‘IDI-R :5，-GGGTTTCATATGTTATTTAAGCTGGGTAAAT-3，1. 1. 1. 4植物来源异戊二烯合成酶基因的克隆利用化学合成方法(上海捷瑞生物工程有限公司，上海市松江区九亭镇同利路433号) 合成植物来源(Populus alba χ Populus tremula ；Populusnigra ；Populus alba) IspS基因，并经过密码子优化，序列见附图5所示(SEQ ID N0:1)。扩增Populus alba IspS基因的引物序列为IspS I-F 5 ‘-GGAAGATCTCAGATGTAGCGTGTCCACCGAA-3，IspS I-R :5，-CCGCTCGAGTAGCGTTCAAACGGCAGAATC-3，扩增Populus nigra IspS基因(附图7，SEQ ID NO 3)的引物序列为IspS2-L:5， -GGAAGATCTCGCGACCGAACTGCTGTGCCT-3，IspS2-R 5' -CCGCTCGAGTTAACGTTCGAACGGCAGGATC-3，扩增Populus alba χ Populus tremula IspS 基因(附图 6，SEQ ID NO :2)的弓| 物序列为IspS3-F 5 ‘-GGAAGATCTCGAAGCCAGACGGTCTGCCAA-3，IspS3-R 5’ -CCGCTCGAGTTATCTCTCAAAGGGTAG-3 ’1. 1.2表达载体的构建1. 1. 2. IpYJMl 载体的构建将胶回收后的dxs基因与pACYCDuet-Ι载体(Novagen)分别用BamHI和&icl进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 他，连接产物转化E. coli DH5 α，然后涂布加有34 μ g · mL_l氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒PYJMl (pACY-dxs)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。1. 1. 2. 2pYJM2 载体的构建将胶回收后的dxr基因与pACYDuet-Ι载体用BamHI和HindIII进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 他，连接产物转化E.coli DH5ci，然后涂布加有34 μ g ^mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒PYJM2 (pACY-dxr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。1. 1. 2. 3pYJM3 载体的构建以pYJM2质粒载体为模板，扩增含有T7启动子的dxr基因即T7-dxr ；用相同的限制性酶O3StI和HindIII)酶切pYJMl与T7dxr，载体与外源片段按摩尔比1 5 的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 他，连接产物转化E. coli DH5a，然后涂布加有 50μ g · mL—1卡那霉素素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒 PYJM3 (pACY-dxs-T7dxr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。扩增T7dxr基因的引物序列为T7dr2-L 5' -GCGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGGAAT-3’Dr2-R 5' ATTTGCGGCCGC TTATGTGAGTATTGAATTGACGTAT 3’1. 1. 2. 4pYJM4 载体的构建将胶回收后的idi基因与pYJM3载体分别用NdeI进行单酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 6h，连接产物转化E. coli DH5a，然后涂布加有34μ g .mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM4 (pACY-dxs-T7dxr-idi)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。1. 1. 2. 5pYJM5 载体的构建将胶回收后的ispS基因与pACYDuet-Ι载体(Novagen)分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 他，连接产物转化E. coli DH5 α，然后涂布加有SAygmL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒PYJM5 (pACY-ispS)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。1. 1. 2. 6pYJM6 载体的构建以pYJM5质粒载体为模板，扩增含有T7启动子的ispS基因即T7_ispS ；将胶回收后的T7-ispS基因与pYJM4载体分别用BglII和B10I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 6h，连接产物转化E. coli DH5a，然后涂布加有34μ g .mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒 PYJM6 (pACY-dxs-T7dxr-idi-T7ispS)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。1. 2E. coli pYJM6重组菌株的构建将pYJM6重组质粒热击转化E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有PYJM6的工程大肠杆菌 E.coli pYJM6。1. 3SDS-PAGE鉴定目标蛋白的表达将活化后的工程大肠杆菌按1 100的接种量接种到IOmL LB液体培养液中(内含34μ g · mL—1氯霉素)，37°C，225rpm振荡培养2h，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度 0. Immol ·Ι^，然后转入30°C，225rpm继续培养3-4h，诱导表达目的蛋白。取出诱导后的培养物，12000g离心2min，收集菌体，菌体细胞用0. 05mol/L的磷酸缓冲液(pH7. 8)洗涤一次，按1 10的比例再用此缓冲液重悬细胞，加入等体积2XSDS-PAGE上样缓冲液，煮沸 lOmin，瞬时高速离心，10% SDS-PAGE电泳检测，即可检测到目标蛋白的表达。1. 4工程大肠杆菌的培养将活化后的工程大肠杆菌按1 100的比例接种到含有34 μ g ^171氯霉素M9液体培养液中，37°C，225rpm条件下振荡培养，当OD6tltlnm为0. 6-0. 8时，在菌液中加入诱导剂 IPTG至终浓度0. Immol · Γ1 l.Ommol · Γ1，然后转入在30°C，225rpm条件下，继续培养 24-72h。1.5工程菌发酵试验挑取单克隆到50ml M9 种子培养基(1L M9salts :20g Glucose, 6gNa2HP04, 3g KH2PO4, Ig NH4CIjO. 5g NaCl，0. 24g MgSO4,121 °C高压蒸汽灭菌 15min。)中。将种子按 10% 的接种量接种至含有 3L 发酵培养基(29. 4g K2HP04. 3H20 ；6. 3g citric acid. H20 ；0. 9g 柠檬酸铁铵；1. 2ml 浓硫酸；60g 葡萄糖，(NH4)6Mo7O24. 4H20 0. 185mg ；ZnSO4. 7H20 0. 145mg ； H3BO4L 235mg ；CuSO4. 5H20 0. 125mg ；MnC12. 4H20 0. 79mg，6ml lMMgS04, 2850ml 蒸馏水)的 5L小型发酵罐中，通气量2. 5L/min，转速400rpm，37°C培养至OD6tltl约为0. 6时，0. ImM-ImM IPTG，37°C诱导表达，以氨水调pH，控制pH在7. 0。得到的异戊二烯产物通过GC-MS对其进行定性和定量分析。检测条件分析仪器Agilent7890A GC，色谱柱HP_AL/S，25mX 320 μ mX 8 μ m。 检测器FID。气相色谱条件进样口温度200°C，压力15psi，检测器FID温度250°C ；程序升温初始温度 50°C，保持:3min ； 10°C /min，升至 70°C，保持 12min ； 10°C /min，升至 150°C，保持 Imin。
得到的异戊二烯产物通过GC-MS对其进行定量分析(GC-MS分析方法参见 Julsing, Μ. K. , Rijpkema, M. , Woerdenbag, H. J. , Quax, W. J. , Kayser, 0. Functional analysis of genes involved in the biosynthesis of isoprene inBacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol 2007Jul ；75(6) :1377-84)。发酵目标异戊二烯产物累计含量达 9. 52mg/L。实施例2通过在大肠杆菌中共同过量表达来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)和脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)，大肠杆菌 (E. coli)或酿酒酵母异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)、植物来源异戊二烯合成酶基因 (IspS) (Populus alba χ Populustremula ；Populus nigra ；Populus alba)，禾Ij用葡萄糖降解中间产物丙酮酸和3-磷酸甘油醛生物合成异戊二烯。2. 1外源基因的克隆和表达载体的构建2. 1.1外源基因的克隆2. 1. 1. IBacillus subtilis的脱氧木酮糖5_磷酸合成酶基因基因的克隆提取Bacillus subtilis (ATCC NO. 23857)的基因组 DNA，根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)，GenBank登记号938609。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。扩增引物序列为Ds2-L 5' CGCGGATCCGGATCTTTTATCAATACAGGACCCG-3‘Ds2-R:5，GCGTCGACTTATGATCCAATTCCTTTGTGTG-3‘2. 1. 1. 2Bacillus subtilis脱氧木酮糖5_磷酸还原酶基因的克隆提取Bacillus subtilis的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)，GenBank登记号939636。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。扩增引物序列为Dr2-L 5' -CGGGATCCG AAAAATATTTGTCTTTTAGGAGCA-3’Dr2-R 5' -CCCAAGCTT TTATGTGAGTATTGAATTGACGTAT-3’2. 1. 1. 3S. cerevisiae异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆提取S. cerevisiae (ATCC No. 26108 )的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物， PCR扩增异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)，GenBank登记号855986。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。扩增引物序列为IDI2-L 5' -GGGTTTCATATGACTGCCGACAACAATAGTA-3‘IDI2-R 5' -GGGTTTCAT TTATAGCATTCTATGAATTT-3，2. 1.2表达载体的构建2. 1. 2. lpYJM7 载体的构建将胶回收后的Bacillus subtilis dxs 基因与 pACYDuet-1 载体(Novagen)分别用BamHI和McI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C 连接4 Mi，连接产物转化E. coli DH5 α，然后涂布加有34 μ g · mL—1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM7 (pACY-Bdxs)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。2. 1. 2. 2pYJM8 载体的构建将胶回收后的Bacillus subtilis dxr 基因与 pACYDuet-1 载体(Novagen)分别用BamHI和HindIII进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或 16°C连接4 6h，连接产物转化E. coli DH5a，然后涂布加有34 μ g · mL—1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM8 (pACY-Bdxr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。2. 1. 2. 3pYJM9 载体的构建以pYJM8质粒载体为模板，扩增含有Τ7启动子的dxr基因即T7-Bdxr ；用相同的限制性酶(PstI和HindIII)酶切pYJM7与T7dxr，载体与外源片段按摩尔比1 5 的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 他，连接产物转化E. coli DH5a，然后涂布加有 50μ g · mL—1卡那霉素素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒 PYJM9 (pACY-Bdxs-T7Bdxr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。2. 1. 2. 4pYJMlO 载体的构建将胶回收后的idi基因与PYJM9载体分别用NdeI进行单酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 6h，连接产物转化E. coli DH5a，然后涂布加有34μ g .mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJMlO (pACY-Bdxs-T7Bdxr-idi)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。2. 1. 2. 5pYJMll 载体的构建以PYJM5质粒载体为模板，扩增含有T7启动子的ispS基因即T7_ispS ；将胶回收后的T7-ispS基因与pYJMlO载体分别用BglII和B10I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 6h，连接产物转化E. coli DH5a，然后涂布加有34μ g .mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒 pYJMll(pACY-Bdxs-T7Bdxr-idi-T7ispS)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。2. 2E. coli pYJMll重组菌株的构建将pYJMll重组质粒热击转化E. coli BL21 (DE!3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pYJMll的工程大肠杆菌 E.coli pYJMll。2.3工程大肠杆菌的培养将活化后的工程大肠杆菌按1 100的比例接种到含有34 μ g ^171氯霉素M9液体培养液中，37°C，225rpm条件下振荡培养，当OD6tltlnm为0. 6-0. 8时，在菌液中加入诱导剂 IPTG至终浓度0. Immol · Γ1 l.Ommol · Γ1，然后转入在30°C，225rpm条件下，继续培养 24-72h。2. 4异戊二烯产物测定得到的异戊二烯产物通过GC-MS对其进行定量分析(GC-MS分析方法参见 Julsing, M. K.，Rijpkema, M.，Woerdenbag, H. J.，Quax, W. J.，Kayser, 0. Functional analysis of genes involved in the biosynthesis of isoprene inBacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol 2007Jul ；75 (6) :1377-84)。发酵条件和检测条件同上。
如图4所示，发酵目标产物异戊二烯的含量达到289mg/L。
权利要求
1.一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括在重组细胞体内，通过基因工程手段提高甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径中的3个限速酶(即脱氧木酮糖5-磷酸合成酶 (dxs)，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶(dxr)和异戊烯基焦磷酸异构酶(idi))的活性，再通过表达外源的植物异戊二烯合成酶基因(IspQ合成异戊二烯的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶和异戊烯基焦磷酸异构酶活性的提高是通过过表达内源或外源的脱氧木酮糖 5-磷酸合成酶基因(dxs)、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)实现的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)是来源于1)埃希氏菌属大肠杆菌，或幻来源于其他细菌，优选枯草芽孢杆菌，或幻和dxs基因同源性超过70%的核酸序列，或4)来源于其它生物体，和dxs基因没有明显的同源性，但和 dxs基因具有相同或相似功能的核酸序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)是来源于1)埃希氏菌属大肠杆菌，或幻来源于其他细菌，优选枯草芽孢杆菌，或幻和dxr基因同源性超过70%的核酸序列，或4)来源于其它生物体，和dxr基因没有明显的同源性，但和 dxr基因具有相同或相似功能的核酸序列。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)是来源于 1)埃希氏菌属大肠杆菌，或幻来源于其他细菌，或幻来源于酵母，优选酿酒酵母，或4)和 idi基因同源性超过70%的核酸序列，或幻来源于其它生物体，和idi基因没有明显的同源性，但和idi基因具有相同或相似功能的核酸序列。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶、脱氧木酮糖 5-磷酸还原酶和异戊烯基焦磷酸异构酶这三种酶活性的提高可增加异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的含量。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述异戊二烯合成酶基因(IspS)是来源于1)植物，优选杨树，或幻和IspS基因同源性超过70%的核酸序列，或幻来源于其它生物体，和 IspS基因没有明显的同源性，但和IspS基因具有相同或相似功能的核酸序列。
8.重组细胞，其中过表达脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)、异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)以及异戊二烯合成酶基因(IspS)。
9.根据权利要求8所述的重组细胞，其优选为细菌细胞，更优选为埃希氏菌属大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。
10.根据权利要求1所述的方法、根据权利要求8或9所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物包括异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、 苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
全文摘要
本发明提供了从丙酮酸和3-磷酸甘油醛生物合成异戊二烯的方法、重组细胞，其中丙酮酸和3-磷酸甘油醛最终是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得。
文档编号C11B9/00GK102559769SQ20101060069
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者咸漠, 张海波, 张英伟, 杨建明, 杨路, 高毅 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 北京旭阳化工技术研究院有限公司