日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白的基因序列的制作方法

专利名称：日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白的基因序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因领域，具体涉及日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白的基因序列以及在大肠杆菌中的表达。
日本血吸虫抱雌沟蛋白是雄虫特异性表达蛋白质，其表达局限于雄虫抱雌沟(雌雄合抱作用发生部位)表面，是合抱依赖性的，该蛋白质通过雌雄合抱而广泛分布于雌虫体表，其表达产物氨基酸序列于具有发育调节功能的生物分子成束蛋白Fascilin I等有高度同源性，因而推断抱雌沟蛋白具有发育调节功能，在雌雄合抱促进雌虫发育及性成熟方面发挥作用。
在亚洲，尤其是中国和菲律宾，引起人畜血吸虫病的主要是日本血吸虫(Schistosoma japonicum)。血吸虫卵是血吸虫病致病和传播的主要原因，且日本血吸虫的雌虫产卵量是曼氏血吸虫和埃及血吸虫雌虫产卵量的10倍，因此从控制血吸虫成熟及生殖着手防治血吸虫病对于我国血吸虫病防治具有更大的意义。
本发明根据已报道的曼氏血吸虫编码抱雌沟蛋白的基因SmGcp序列和编码日本血吸虫抱雌沟蛋白保守区的cDNA序列SjGcp1设计两对引物，分别扩增出日本血吸虫抱雌沟蛋白编码序列的5’和3’区段，再根据测序结果设计第三对引物，然后从日本血吸虫体中分离有关的mRNA作为模板，经反转录获得cDNA，用PCR方法扩增和克隆了抱雌沟蛋白的完整阅读框，并分析测定其序列；其cDNA5’端序列的获得是以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板，根据已知抱雌沟蛋白基因序列设计一系列下游引物GSP1、GSP2、GSP3、GSP4，利用试剂盒提供的锚定上游引物进行巢氏PCR法扩增和克隆，并对所克隆的序列进行测定。
本发明公开的日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白的基因序列如表1所示。日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因阅读框架编码1932个核甘酸，即643个氨基酸，见表1。比曼氏血吸虫多了三个碱基(序列中以黑体表示的碱基)见表3。其理论推测氨基酸组成在N端比曼氏的缺少46个氨基酸，其余氨基酸同源性为83.7％，见表2。
本发明所要解决的另一技术问题是
公开日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白在大肠杆菌中的表达。
本发明公开的日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白通过下述步骤实现在大肠杆菌中的表达1、总RNA的提取由日本血吸虫中国大陆株安徽品系尾蚴感染新西兰大白兔，5周后剖杀冲虫，液氮冻备用。取液氮冻存的虫体200mg，用Gibco公司的Trizol试剂抽提其总RNA，按其说明书进行操作。
2、引物设计依据，引物合成的方法1)获得完整ORF的引物设计依据根据已报道的曼氏血吸虫抱雌沟蛋白编码全基因序列SmGcp和日本血吸虫抱雌沟蛋白编码保守区基因SjGcpl序列设计两对引物，分别扩增出日本血吸虫抱雌沟蛋白编码全基因序列的5’和3’区段，再根据测序结果设计第三对引物，扩增日本血吸虫抱雌沟蛋白全基因。引物在Bechman公司生产的Bechman oligo 1000引物合成仪上合成。
5’区段引物upper5′-TTCAATCATTGCATCATGTACACCATTTAC-3′；lower5′-CGTTCTTTACCAGTTGAATCAGTTTCACAA-3′。
3’区段引物upper5′-ATGGGAATTATTACGTCAAAAGTATTCAAGTGAAC-3′；lower5′-TTAGGACTCAATAAGTGTAACCGTTGTTTCAC-3′。
编码全长引物upper5′-CGAAGCTTGACATGGAATCAATTCGGAATCACTC-3′；lower5′-CTGCTCGAGTTAGGACTCAATAAGTGTAACCG-3′。
2)获得cDNA5’端区段的引物设计依据根据测序结果所得的日本血吸虫抱雌沟基因序列设计一系列下游引物GSP1、GSP2、GSP3、GSP4，引物在Bechman公司生产的Bechman oligo 1000引物合成仪上合成。巢氏PCR引物GSP15′-CTGCTCGAGTTAGGACTCAATAAGTGTAACCG-3′GSP25′-CGTTCTTTACCAGTTGAATCAGTTTCACAA-3′GSP35′-CGAGTTACATTACATGTCAGCATCCAC-3’GSP45′-TATTTCTCGGCGTTTC3、反转录、PCR扩增和基因克隆1)完整ORF的获得以血吸虫总RNA为模板，下游引物为引物作反转录。反转录试剂盒购自Gibco BRL公司操作按其说明书进行。从前步所得cDNA为模板，以合成的上下游引物进行PCR扩增，特异性扩增产物连接入pGEM-T Easy Vector中(pGEM-T Easy Vector购自Sigma公司)，并转化到大肠杆菌TG1中，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，获得重组克隆。
2)cDNA5’端区段的获得按5’RACE试剂盒说明书介绍的方法操作，以日本血吸虫总RNA为模板，以GSP1为引物引导反转录合成该基因5’端cDNA，用RNA酶去除模板RNA后，转录产物经GLASSMAX柱纯化，用末端转移酶在其3’端加上poly(dC)尾。然后分别以GSP2、GSP3、GSP4为下游引物，以5’RACE试剂盒提供的锚定引物为上游引物进行巢式PCR，将最后一轮PCR的产物按上述方法克隆、鉴定。
4、日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白编码基因鉴定本发明对所有基因片段的各两个阳性克隆进行序列测定，其中大部分序列为双向测序确定。日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因阅读框架编码1932个核甘酸，即643个氨基酸。该蛋白基因于来源于曼氏血吸虫的抱雌沟蛋白基因相比，其ORF在5’端比曼氏血吸虫该基因的ORF缺少138个碱基，同源性为85％，有368个碱基不同，且在第696至733碱基之间日本血吸虫比曼氏血吸虫多了三个碱基(序列中以黑体表示的碱基)见表3。其理论推测氨基酸组成在N端比曼氏的缺少46个氨基酸，其余氨基酸同源性为83.7％，见表2。
本发明将编码日本血吸虫抱雌沟蛋白的完整阅读框序列克隆入表达载体pET28c(+)中，在大肠杆菌BL21中获得表达，以重组表达产物进行SDS-PAGE，经电转移到NC膜上，用经pET28c(+)裂解液中和的日本血吸虫成虫抗原免疫血清做一抗进行Western印迹检测，结果在约80kD处有一明显的识别条带，说明所克隆编码日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的表达产物具有良好的抗原性。见

图1。
5、日本血吸虫抱雌沟蛋白的免疫保护性效果证明本发明将SjScp的大肠杆菌表达产物用Ni-NTB柱纯化，用纯化产物作免疫原免疫昆明系小鼠，每只鼠20μg纯化蛋白，共免疫三次，按常规免疫程序操作。首免用弗氏完全佐剂，二免、三免用弗氏不完全佐剂。首免四周后二免，二免两周后三免，三免一周后攻击尾蚴，攻击五周后剖杀小鼠，计算减虫率和减卵率。结果见下表rSjgcp(全长)与rSjGCP1免疫小鼠实验减虫率和减卵率比较平均虫荷数(x±s) 减虫率 平均卵荷数 减卵率Worm burden(x±s) Wormreduction P EPG(x±s) Egg reduction Prate(％) rate(％)rSjgcp 24±3 11.3 ＜0.05 8274±2114 33 ＜0.05rSjgcp121.4±722.8 ＜0.05 9214±2757 26 ＜0.05control26.1±7- - 12400±2392- -本发明将日本血吸虫抱雌沟蛋白基因克隆入表达载体pET28c中，在大肠杆菌中得到了较高量的表达，用Ni(+)NTB亲和柱纯化与载体pET28c(+)中6×His融合的基因表达产物，然后以纯化的融合表达产物为抗原，免疫昆明系小鼠，免疫剂量为20μg/鼠，共免疫三次。同时，将抱雌沟蛋白保守区的融合表达产物同样进行免疫实验，与全长表达产物的免疫效果进行对照。从免疫结果可以看出，与保守区相比，全长具有更高的减卵率。这也揭示了抱雌沟蛋白在控制雌虫成熟与产卵上的作用。
根据已报道的曼氏血吸虫编码抱雌沟蛋白的基因SmGcp序列和编码日本血吸虫抱雌沟蛋白保守区的cDNA序列SjGcp1设计两对引物，分别扩增出日本血吸虫抱雌沟蛋白编码序列的5’和3’区段，再根据测序结果设计第三对引物，扩增日本血吸虫抱雌沟蛋白的完整编码序列。
5’区段引物upper5′-TCAATCATTGCATCATGTACACCATTTAC-3′；lower5′-GTTCTTTACCAGTTGAATCAGTTTCACAA-3′。
3’区段引物upper5′-ATGGGAATTATTACGTCAAAAGTATTCAAGTGAAC-3′；lower5′-TTAGGACTCAATAAGTGTAACCGTTGTTTCAC-3′。
编码全长引物upper5′-CGAAGCTTGACATGGAATCAATTCGGAATCACTC-3′；lower5′-CTGCTCGAGTTAGGACTCAATAAGTGTAACCG-3′。
这三对引物分别对应于SmGcp cDNA的181～1032bp、856～2278bp和350～2278bp。引物由上海基康公司合成。1.1.5 5’RACE的引物GSP15′-CTGCTCGAGTTAGGACTCAATAAGT GTAACCG-3′(全长引物之下游)GSP25′-CGTTCTTTACCAGTTGAATCAGTTTCACAA-3′(1003--1032)GSP35′-CGAGTTACATTACATGTCAGCATCCAC-3’(641--667)GSP45′-TATTTCTCGGCGTTTC(368--482)引物GSP1、GSP2、GSP3、GSP4是5’RACE特异的反向引物，括号内的数字表示该引物在曼氏血吸虫抱雌沟蛋白编码基因中的位置。1.2方法1.2.1反转录聚合酶链反应(RT-PCR)取液氮冻存的日本血吸虫成虫200mg，分别按Trizol试剂盒和反转录试剂盒说明抽提其总RNA，并反转录成cDNA，取1μl为模板进行PCR，PCR反应条件分别为94℃预变性5min，然后94℃1min+50℃55s+72℃1min 30s，共30个循环，循环结束后72℃自动延伸10min；94℃预变性5min，然后94℃ 1min+52℃55s+72℃1min 30s，共30个循环，循环结束后72℃自动延伸10min；94℃预变性5min，然后94℃ 1min+55℃55s+72℃2min，共30个循环，循环结束后72℃自动延伸10min。1.2.2PCR产物的克隆和鉴定将PCR产物用Silver Beads DNA回收试剂盒进行回收，按pGEM-T Easy Vector说明书介绍的方法进行连接，并转化到大肠杆菌TG1中，转化子初筛后进行限制性酶切分析鉴定重组克隆。将阳性克隆用Sangers双脱氧核糖核酸末端终止法测序，由上海基康公司完成，将所测序列与SmGcp基因片段序列进行比较。1.2.3 5’RACE按5’RACE试剂盒说明书介绍的方法操作，以日本血吸虫总RNA为模板，以GSP1为引物引导反转录合成该基因5’端cDNA，用RNA酶去除模板RNA后，转录产物经GLASSMAX柱纯化，用末端转移酶在其3’端加上poly(dC)尾。然后分别以GSP2、GSP3、GSP4为下游引物，以5’RACE试剂盒提供的锚定引物为上游引物进行巢式PCR，将最后一轮PCR的产物按1.2.2所述方法克隆、鉴定。1.2.4融合基因在大肠杆菌中的表达从测序后确定的重组质粒pGEM-T Easy-SjGcp中用限制性内切酶SacI和XhoI切出SjGcp全长编码基因片段，克隆到表达型质粒pET28c(+)相应的酶切位点中。将含融合基因的重组质粒转化表达宿主菌BL21，按常规方法诱导表达，制备菌体蛋白质，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。1.2.5基因表达产物的纯化选用Ni(+)NTB亲和柱纯化与载体pET28c(+)中6×His融合的基因表达产物，按纯化试剂盒说明操作。用抗His的单抗进行免疫印迹试验鉴定6×His融合蛋白。1.2.6融合蛋白抗原性鉴定将表达量高时相段的产物进行SDS-PAGE，再转移到硝酸纤维膜上，转移条件为0.25A，3h，用经pET28c(+)载体转化的大肠杆菌裂解液中和过的日本血吸虫成虫抗原免疫血清作一抗，进行Western印迹检测。2结果2.1SjGcp全长编码基因的克隆及序列分析以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板，参照SmGcp序列和SjGcp1序列设计引物，用RT-PCR扩增出一段大小为1949bp的DNA片段。将其克隆到pGEM-T Easy Vecter上，对其进行序列分析，并与SmGcp序列进行比较，推断该片段含编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白全长的基因序列。该编码基因ORF为1932bp，编码643个氨基酸残基。2.2利用5’RACE技术检验所克隆SjGcp基因cDNA的5’端我们所克隆的SjGcp基因与曼氏血吸虫SmGcp基因序列相比，在其5’端上游缺少138个碱基。为了查明所得序列确为SjGcp编码基因全长，利用5’RACE技术对其5’端进行了延伸分析。以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板，根据已知SjGcp基因序列设计一系列下游引物GSP1、GSP2、GSP3、GSP4，利用试剂盒提供的锚定上游引物进行巢氏PCR，最后扩增出一段大小为499bp的DNA片段。将其克隆到pGEM-T Easy Vecter上，序列分析结果表明其第129-499bp的碱基与SjGcp已知序列完全相同，且在其序列内没有其它合适的起始密码子，从而认为，所克隆的基因为编码该蛋白质的完整阅读框。2.3SjGcp基因在大肠杆菌中表达和表达产物的纯化用IPTG诱导SjGcp基因在大肠杆菌中获得表达，并用SDS-PAGE对不同表达时相进行结果分析，发现该融合表达产物分子量约为80kD，与推测的大小相符合(图2)，且2h已达最高表达时相。表达产物用Ni(+)-NTB亲和柱纯化，用SDS-PAGE分析纯化产物，在相应位置有明显条带，并可看到主带下有一些小分子量条带(图3)。用抗His的单抗和sj成虫抗原免疫血清进行免疫印迹试验，表明其为融合蛋白的降解产物(图1、4)，并说明降解反应发生在C端。2.4表达产物的抗原性测定以重组表达产物进行SDS-PAGE，经电转移到NC膜上，用经pET28c(+)裂解液中和的日本血吸虫抗原免疫血清做一抗进行Western印迹检测，结果在约80kD处有一明显的识别条带(图1)，证实重组表达产物与日本血吸虫抗原的一致性。说明所克隆编码日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的表达产物具有良好的抗原性。表1 日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白的基因序列gttacactgt tatactgaag tagtttaaat gaaatatgta ataataaatc aataagtaat 60tatacataac atttaattag tattactgtt tttggacaat ctataaaatt tggtaaaata 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ctt att gag tcc taa2298Thr Leu Ile Glu Ser640表2 日本血吸虫与曼氏血吸虫抱雌沟蛋白的氨基酸序列比较下划线标出的氨基酸序列为曼氏血吸虫报雌沟蛋白比日本血吸虫报雌沟蛋白多出的序列曼氏血吸虫报雌沟蛋白比日本血吸虫报雌沟蛋白的氨基酸序列同源性以阴影标出SmGcp；M Q R C G K K L E F D Y K C C A G Y D K I E K L S Y T F K D F K K G E C A L Q L S P YSmGcpE M CM E L I G N Q S D I S P F S D K M K S L N Q F K T K T P D K P Y T I F A P S T R N SjGcpM E S I R N H S D V Y P F A E K M K I L N E L N I K N P D K P Y T I F A P S T R NSmGcp A E K Y K D F T N S A E H I V P G R F Y L K D L K S T L Q L N T L D P K R K L Y V T R ESjGcp A E K Y K D F T N S A E H I V P G R F Y L K D L K S G L Q L N T L D P K R K L Y V T R ESmGcp H H G T V S V D C V E L V D A D M E C N S G I I H Q L D L N K Y S Q K G D R S S I N S LSjGcp L H G T V L V D C V E L V D A D M E C N S G I I H T I R Y P L T D T Q K L D R S S I L S LSmGcp L E S N P E T Q A F A K D L S E V F K N N F K N I N S G Q R Y T V I V P N Q K T W E L LSjGcp L E S N S E T Q S F A K D L S A A L K N N L K N I N S G H R Y T V I V P S Q K S W E L LSmGcp R Q K Y S S E Q L Q 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QSjGcp P V N N L E S Y E L D D V T I Y V T P R I N V P P E V N M T D I I N N R A D T T I A K N QSmGcp T E K A K M D E K Y F Q K S A P K N L Y L V T T D N G W K D P R A T P T T I N L Y R PSjGcp T E R A K M D E K Y F R K N A P K N L F L V T T D N G W K D P R A T Q T T I N P Y K PSmGcp E L N I Y T D K N L E N Y L L L N H I P L Y L W G G D I G Y F E K N T I H K F M S S ASjGcp E L N M Y T D K N L E N Y L L L N H I P L Y L W G G D I G Y F E K N T V H K F M S S ASmGcp G I E L I F W M D S N G I M R I G Y E G L P R D Q W P K V I Q W N L H A G D G I I W VSjGcp G I E L I F W M D N N A V M R I G Y E G L P R D Q W P K V I H W N L H A R D G I I W VSmGcp L D G I L K C P E K I C P L L V E D V D Y Y D V Y V M A C Q T S I L P G E K D P V A QSJGcp L D G L L K C P E K L C P L L A E D V D Y Y D V Y V M A C Q T S N L P G E K D A V G QSmGcp F E S R P L D I A S R H P N L C T V V L Q T S E T T V T L I E SSjGcp F E S R P L D I A S R H P N L C T V V L Q T S E T T V T L I E S表3 日本血吸虫与曼氏血吸虫抱雌沟蛋白基因cDNA的核苷酸序列比较起始密码子ATG和终止密码子TAA被框出曼氏血吸虫抱雌沟蛋白基因比日本血吸虫抱雌沟蛋白基因多出来的核甘酸序列以黑体表示5’RACE结果以下划线标出sjGcp 1GTTACACTGT.TATACTGAAG.TAGTTTAAAT.GAAATATGTA.ATAATAAATC.AATAAGTAAT.smGcpg-c.-tta-cc--t.tc-t-tctat.tcct-t-t-t.-t-c-t-t-t.sjGcp 61TATACATAAC.ATTTAATTAG.TATTACTGTT.TTTGGACAAT.CTATAAAATT.TGGTAAAATA.smGcp 44 atg-t-agt-.------g---.---cta----.aa----g---.----------.g-t-------.sjGcp 121TCTGACAAAG.TTAGTTATGC.CAATCCAGAT.CAAGCAGGGT.ATCATCATTG.TGCATTTTGG.smGcp 104-----t----.--a------a.----------.----g---a--.----------.----------.sjGcp 131CGTTTATCTG.ATGGTCAATC.AATTATTGCT.TCATGCACTC.CATTCACATT.ACAACGCTGT.smGcp 164------c-a-.-------t--.---c-----a.------t-a-.----t--- -----t--.sjGcp 241GGGAAAAAGT.TAGAATTCGA.TTACAAATGT.TGTGCGGGAT.ATGAAAAGAT.TGGAAAATTA.smGcp 224--a-----a-.-------t--.---a------.-----a--t-.----t--a--.--ag------.sjGcp 301TCATATACAT.TTCGTGATTT.CAAGAAGGAT.GAATGCGCTC.TACAAGTATC.CCCATATGAA.smGcp 284--------c-.--aaa-----.t--a--a-ga.-----t--a-.-g---c-t--.a--t------.sjGcp 361TTGTGC G.AATCAATAGG.GAATCAATCT.GACATATCTC.CATTTTCAGA.AAAAATGAAA.smGcp 344a----t----.---t---tc-.------c--c.--tg---a--.----cg-t--.c---------.sjGcp 421ACACTCAATG.AACTCAACAC.AAAGAATCCA.GATAAACCAT.ACACAATTTT.TGCACCAAGT.smGcp 404t----t---c.--t----g--.---a-c----.----------.-t-----a--.----------.sjGcp 481ACTAGAAACG.CCGAGAAATA.TAAAGATTTT.ACAAATTCAG.CAGAACATAT.TGTTCCAGGT.smGcp 464--------t-.-t--a-----.----------.--------t-.-t--------.----------.sjGcp 541CGATTTTATT.TAAAAGATTT.AAAAAGTGGA.CTACAATTGA.ATACATTAGA.TCCTAAACGA.smGcp 524--t-------.-g--------.-----c----.t-------a-.----t-----.-------a-g.sjGcp 601AAACTTTATG.TAACACGAGA.ACTTCATGGA.ACTGTTTTAG.TTGATTGTGT.TGAATTAGTG.smGcp 584----------.----------.--a-------.-------c--.----------.a---c----t.sjGcp 661GATGCTGACA.TGGAATGTAA.CTCGGGCATC.ATACATACAA.TTAGATATCC.TTTAACAGAT.smGcp 644-----a--t-.----------.---t-----t.-c--------.----------.-------a--.sjGcp 723ACACAAAAAC.TAGATAGATC.ATCTATTCTC.AGCTTACTGG.AATCGAATTC.AGAAACTCAA.smGcp 704-tt--g----.-t-g------.---------t.-a---gt--a.----t---c-.----------.sjGcp 784TCATTTGCAA.AAGATTTATC.AGCAGCATTG.AAAAATAATT.TGAAAAATAT.TAACTCTGGT.smGcp 764g-------t-.----------.t-ag-t---t.----------.-g--------.---t------.sjGcp 844CATAGATACA.CTGTGATTGT.ACCAAGTCAA.AAATCCTGGG.AATTATTACG.ACAAAAGTAT.smGcp 824--ac----t-.----a--a--.-----a----.--ga-a----.------- a-.t---------.sjGcp 904TCAAGTGAAC.AACTACAAAG.AATTGCAGCT.AATCATGTTA.TCTTGAATCA.GCATTGTTCA.smGcp 884----------.----t-----.----------.---------c.-a--a-----.a---------.sjGcp 964GGACATTTAA.TTCAATCACT.TGAAAATTAT.AAATCATTAT.TAGGAGAAAA.ACTTGAATTC.smGcp 944----------.----ta--t-.a----g----.c---------.----t-----.---------t.sjGcp 1024 ATTTGTGAAA.CTGATTCAAC.TGGTAAAGAA.CGACATTATG.TTCGTACTAT.GTTCAATGAT.smGcp 1004 c-a-------.-----a---a.---------g.aa-aca-tat.g------a--.a--tgg---a.sjGcp 1084 AAACATGAAT.TAACAATAAC.AGATTTAACG.TCTTCAAATG.GAGTAGCACA.TATTATTGAA.smGcp 1064 ---------a.------c---.g------g-a.g--a-t----.-t--------.------a---.sjGcp 1144 GAACCATTAA.TTCCATTTTC.AGTTATGACA.TTTAGAGAAT.TATTACAGAA.CAAGCAATAT.smGcp 1124 --ta------.-a---c----.t-----a---.----------.--a-t-----.t--a------.sjGcp 1204 GCTGAAAAAT.TGAAGTCTAC.TGAATTTCTA.AAACTTCTTG.CTGAATGTGA.TTTGAAAGTG.smGcp 1184 -g--------.----ag----.----------.--t-------.----------.-a-c---a--.sjGcp 1264 GAACCTGGAG.AAAAATATGC.TATCGTTTTA.CCACAAGACA.GTTCAATGAA.GTGGTGGTCA.smGcp 1244 ----ta----.----------.c--a------.--------t-.----------.a---------.sjGcp 1324 ACATATTCAC.CATTTCAAGA.TGAATATAAA.CGTTTTCAAG.CGGATAAAGA.ATATCGTTGT.smGcp 1304 --t-------.a---------.ac--c-----.---------a.-t--------.----------.sjGcp 1384 CGAGTAGCAC.GTTACCATGT.TGTGAAAAGT.GATAATCGAT.TGAATAATAT.TGGCAATTTT.smGcp 1364 --t-------.----t---a-.-a--------.a--g------.-a--------.---t--c--c.sjGcp 1444 GCTAGTCATA.CACTAGGTCA.TCGTACAATT.AATCCAAACG.AAGCTCTGTA.TGAAACAACT.smGcp 1424 ----------.---a------.---------g.--------t-.--t-at-a--.----------.sjGcp 1504 TATTTTAAGA.AGACTCCATA.TGGATCACAG.CTGAATTTCC.ATTATTCTCC.AGTCAATAAT.smGcp 1484 --------a-.-a--------.----------.t-------t-.-------c--.-a--------.sjGcp 1564 CTTGAATCAT.ATGAATTAGA.TGATGTGACA.ATCTACGTTA.CTCCAAGGAT.CAATGTTCCA.smGcp 1544 ----gcctc-.tc--------.------a.-t.--t--t----.--------a--.---------.sjGcp 1624 CCTGAAGTAA.ATATGACTGA.CATAATAAAC.AATCGAGCTG.ATACAACAAT.AGCGAAAAAT.smGcp 1604 --c--ct-c-.----------.t--tt----a.------c---.----c-----.t--c------.sjGcp 1684 CAAACAGAAA.GAGCTAAAAT.GGATGAAAAA.TATTTTAGAA.AGAATGCACC.TAAAAATTTA.smGcp 1664 -----g----.a---------.------g---.-----cca--.-a-g------.a------c--.sjGcp 1744 TTTCTTGTTA.CAACAGATAA.TGGTTGGAAG.GATCCAAGAG.CTACACAGAC.AACAATTAAT.smGcp 1724 -a---g--c-.-c--g-----.----------.------c---.------ca--.t---------.sjGcp 1804 CCATATAAAC.CTGAATTAAA.TATGTATACT.GATAAGAATT.TAGAAAATTA.CTTACTGCTT.smGcp 1784 -t-----g--.----------.---a--c--a.-----a----.----------.---gt-a---.sjGcp 1864 AACCATATAC.CATTGTATTT.ATGGGGTGGA.GATATTGGTT.ATTTCGAAAA.AAATACAGTA.smGcp 1844 --t-------.----a-----.----------.--------c-.-------g--.g------a-t.sjGcp 1924 CATAAATTTA.TGTCTTCTGC.TGGCATAGAA.TTAATCTTTT.GGATGGATAA.TAATGCAGTA.smGcp 1904 ----------.----a----t.---t------.-----t----.---------g.--t--g-a--.sjGcp 1984 ATGCGAATTG.GATATGAGGG.TCTACCACGT.GATCAATGGC.CAAAAGTGAT.TCATTGGAAT.smGcp 1964 -----t----.-------a--.----------.----------.-t--------.---a------.sjGcp 2044 CTACATGCAC.GTGACGGTAT.TATCTGGGTA.TTAGATGGTC.TATTGAAATG.TCCGGAAAAA.smGcp 2024 t--------g.----t-----.-------t--.---------a.----a-----.---t------.sjGcp 2104 CTTTGCCCAT.TACTTGCTGA.AGATGTTGAT.TATTATGATG.TTTATGTAAT.GGCATGTCAA.smGcp 2084 a----t----.--a---t---.----------.----------.----------.----------.sjGcp 2164 ACATCCAATT.TGCCGGGTGA.AAAAGATGCT.GTTGGACAAT.TTGAAAGTAG.ACCATTGGAT.smGcp 2144 -----a-ta-.-a--t-----.-------c--.----c-----.----------.----------.sjGcp 2224 ATAGCTAGTC.GGCATCCTAA.TCTCTGCACT.GTGGTATTGC.AAACAAGTGA.AACAACGGTT.smGcp 2204 --t-------.-a--------.---g--t---.--a-----a-.----------.----------.sjGcp 2284 ACACTTATTG.AGTCC smGcp 2264 ----------.-----
权利要求
1.一种编码为日本血吸虫抱雌沟蛋白的核甘酸序列，其特征在于它具有如下的DNA核甘酸及相应的氨基酸序列gttacactgt tatactgaag tagtttaaat gaaatatgta ataataaatc aataagtaat 60tatacataac atttaattag tattactgtt tttggacaat ctataaaatt tggtaaaata 120tctgacaaag ttagttatgc caatccagat caagcagggt atcatcattg tgcattttgg 180cgtttatctg atggtcaatc aattattgct tcatgcactc cattcacatt acaacgctgt 240gggaaaaagt tagaattcga ttacaaatgt tgtgcgggat atgaaaagat tggaaaatta 300tcatatacat ttcgtgattt caagaaggat gaatgcgctc tacaagtatc cccatatgaa 360ttgtgc atg gaa tca att cgg aat cac tcc gat gta tat cca ttc gca408Met Glu Ser Ile Arg Asn His Ser Asp Val Tyr Pro Phe Ala1 5 10gaa aaa atg aaa aca ctc aat gaa ctc aac aca aag aat cca gat aaa 456Glu Lys Met Lys Thr Leu Asn Glu Leu Asn Thr Lys Asn Pro Asp Lys15 20 25 30cca tac aca att ttt gca cca agt act aga aac gcc gag aaa tat aaa 504Pro Tyr Thr Ile Phe Ala Pro Ser Thr Arg Asn Ala Glu Lys Tyr Lys35 40 45gat ttt aca aat tca gca gaa cat att gtt cca ggt cga ttt tat tta 552Asp Phe Thr Asn Ser Ala Glu His Ile Val Pro Gly Arg Phe Tyr Leu50 55 60aaa gat tta aaa agt gga cta caa ttg aat aca tta gat cct aaa cga 600Lys Asp Leu Lys Ser Gly Leu Gln Leu Asn Thr Leu Asp Pro Lys Arg65 70 75aaa ctt tat gta aca cga gaa ctt cat gga act gtt tta gtt gat tgt 648Lys Leu Tyr Val Thr Arg Glu Leu His Gly Thr Val Leu Val Asp Cys80 85 90gtt gaa tta gtg gat gct gac atg gaa tgt aac tcg ggc atc ata cat 696Val Glu Leu Val Asp Ala Asp Met Glu Cys Asn Ser Gly Ile Ile His95 100 105 110aca att aga tat cct tta aca gat aca caa aaa cta gat aga tca tct 744Thr Ile Arg Tyr Pro Leu Thr Asp Thr Gln Lys Leu Asp Arg Ser Ser115 120 125att ctc agc tta ctg gaa tcg aat tca gaa act caa tca ttt gca aaa 792Ile Leu Ser Leu Leu Glu Ser Asn Ser Glu Thr Gln Ser Phe Ala Lys130 135 140gat tta tca gca gca ttg aaa aat aat ttg aaa aat att aac tct ggt 840Asp Leu Ser Ala Als Leu Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ile Asn Ser Gly145 150 155cat aga tac act gtg att gta cca agt caa aaa tcc tgg gaa tta tta 888His Arg Tyr Thr Val Ile Val Pro Ser Gln Lys Ser Trp Glu Leu Leu160 165 170cga caa aag tat tca agt gaa caa cta caa aga att gca gct aat cat936Arg Gln Lys Tyr Ser Ser G1u Gln Leu Gln Arg Ile Ala Ala Asn His175 180 185 190gtt atc ttg aat cag cat tgt tca gga cat tta att caa tca ctt gaa984Val Ile Leu Asn Gln His Cys Ser Gly His Leu Ile Gln Ser Leu Glu195 200 205aat tat aaa tca tta tta gga gaa aaa ctt gaa ttc att tgt gaa act1032Asn Tyr Lys Ser Leu Leu Gly Glu Lys Leu Glu Phe Ile Cys Glu Thr210 215 220gat tca act ggt aaa gaa acg aca tta tgt cgt act atg ttc aat gat1080Asp Ser Thr Gly Lys Glu Arg His Tyr Val Arg Thr Met Phe Asn Asp225 230 235aaa cat gaa tta aca ata aca gat tta acg tct tca aat gga gta gca1128Lys His Glu Leu Thr Ile Thr Asp Leu Thr Ser Ser Asn Gly Val Ala240 245 250cat att att gaa gaa cca tta att cca ttt tca gtt atg aca ttt aga1176His Ile Ile Glu Glu Pro Leu Ile Pro Phe Ser Val Met Thr Phe Arg255 260 265 270gaa tta tta cag aac aag caa tat gct gaa aaa ttg aag tct act gaa1224Glu Leu Leu Gln Asn Lys Gln Tyr Ala Glu Lys Leu Lys Ser Thr Glu275 280 285ttt cta aaa ctt ctt gct gaa tgt gat ttg aaa gtg gaa cct gga gaa1272Phe Leu Lys Leu Leu Ala Glu Cys Asp Leu Lys Val Glu Pro Gly Glu290 295 300aaa tat gct atc gtt tta cca caa gac agt tca atg aag tgg tgg tca1320Lys Tyr Ala Ile Val Leu Pro Gln Asp Ser Ser Met Lys Trp Trp Ser305 310 315aca tat tca cca ttt caa gat gaa tat aaa cgt ttt caa gcg gat aaa1368Thr Tyr Ser Pro Phe Gln Asp Glu Tyr Lys Arg Phe Gln Ala Asp Lys320 325 330gaa tat cgt tgt cga gta gca cgt tac cat gtt gtg aaa agt gat aat1416Glu Ser Arg Cys Arg Val Ala Arg Tyr His Val Val Lys Ser Asp Asn335 340 345 350cga ttg aat aat att ggc aat ttt gct agt cat aca cta ggt cat cgt1464Arg Leu Asn Asn Ile Gly Asn Phe Ala Ser His Thr Leu Gly His Arg355 360 365aca att aat cca aac gaa gct ctg tat gaa aca act tat ttt aag aag1512Thr Ile Asn Pro Asn Glu Ala Leu Tyr Glu Thr Thr Tyr Phe Lys Lys370 375 380act cca tat gga tca cag ctg aat ttc cat tat tct cca gtc aat aat1560Thr Pro Tyr Gly Ser Gln Leu Asn Phe His Tyr Ser Pro Val Asn Asn385 390 395ctt gaa tca tat gaa tta gat gat gtg aca atc tac gtt act cca agg1608Leu Glu Ser Tyr Glu Leu Asp Asp Val Thr Ile Tyr Val Thr Pro Arg400 405 410atc aat gtt cca cct gaa gta aat atg act gac ata ata aac aat cga1656Ile Asn Val Pro Pro Glu Val Asn Met Thr Asp Ile Ile Asn Asn Arg415 420 425 430gct gat aca aca ata gcg aaa aat caa aca gaa aga gct aaa atg gat1704Ala Asp Thr Thr Ile Ala Lys Asn Gln Thr Glu Arg Ala Lys Met Asp435 440 445gaa aaa tat ttt aga aag aat gca cct aaa aat tta ttt ctt gtt aca1752Glu Lys Tyr Phe Arg Lys Asn Ala Pro Lys Asn Leu Phe Leu Val Thr450 455 460aca gat aat ggt tgg aag gat cca aga gct aca cag aca aca att aat1800Thr Asp Asn Gly Trp Lys Asp Pro Arg Ala Thr Gln Thr Thr Ile Asn465 470 475cca tat aaa cct gaa tta aat atg tat act gat aag aat tta gaa agt1848Pro Tyr Lys Pro Glu Leu Asn Met Tyr Thr Asp Lys Asn Leu Glu Asn480 485 490tac tta ctg ctt aac cat ata cca ttg tat tta tgg ggt gga gat att1896Tyr Leu Leu Leu Asn His Ile Pro Leu Tyr Leu Trp Gly Gly Asp Ile495 500 505 510ggt tat ttc gaa aaa aat aca gta 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aca agt gaa aca acg gtt2280His Pro Asn Leu Cys Thr Val Val Leu Gln Thr Ser Glu Thr Thr Val625 630 635acg ctt att gag tcc taa 2298Thr Leu Ile Glu Ser640
2.一种如权利要求1所述的日本血吸虫抱雌沟蛋白的核甘酸序列的克隆方法，其特征在于为获得日本血吸虫抱雌沟蛋白完整ORF的核甘酸序列，所设计的引物序列如下upper5′-CGAAGCTTGACATGGAATCAATTCGGAATCACTC-3′；lower5′-CTGCTCGAGTTAGGACTCAATAAGTGTAACCG-3′。
3.一种如权利要求1所述的日本血吸虫抱雌沟蛋白的核甘酸序列的编码序列在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于为获得日本血吸虫抱雌沟蛋白完整0RF的核甘酸序列的正确表达，所使用的宿主菌为BL21，表达载体为pET28c。
全文摘要
本发明涉及生物基因领域,具体涉及日本血吸虫抱雌沟蛋白的基因序列及在大肠杆菌中的表达。本发明根据已报道的曼氏血吸虫编码抱雌沟蛋白的基因SmGcp序列和编码日本血吸虫抱雌沟蛋白保守区的cDNA序列SjGcp1设计两对引物,分别扩增出日本血吸虫抱雌沟蛋白编码序列的5’和3’区段,再根据测序结果设计编码全长引物,从虫体中抽提总RNA,用PCR克隆出该基因,克隆后经全序列测定表明该成熟蛋白cDNA编码1932个核甘酸,即643个氨基酸。该基因的成功克隆及基因序列测定为以后阐明血吸虫的生殖发育机理,以及从阻滞雌虫成熟方面防治血吸虫病打下了良好的基础。
文档编号C07K14/435GK1422953SQ0211067
公开日2003年6月11日 申请日期2002年1月28日 优先权日2002年1月28日
发明者林矫矫, 金亚美, 朱建国, 冯新港, 吴详甫, 周元聪, 蔡幼民 申请人:中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所, 上海动物生物技术研究中心