甘薯扩展蛋白cDNA和使用该cDNA的高产转基因植物的制作方法

专利名称：甘薯扩展蛋白cDNA和使用该cDNA的高产转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于产生高产转基因植物的甘薯扩展蛋白(expansin)cDNA。更具体地说，本发明涉及甘薯扩展蛋白cDNA，携带该cDNA的转化载体，以及制备具有提高的生物量和/或种子产量的转基因植物的方法。
背景技术：
自从Cosgrove及其合作者发现了扩展蛋白(McQueen-Mason等人，1992，Plant Cell 4，1425～1433)，人们对扩展蛋白已经进行了深入研究。在早期的研究中，扩展蛋白被认为是细胞壁疏松酶，其至少部分介导植物细胞壁的pH依赖性扩展以及细胞的生长(Cosgrove，2000，Nature 407，321～326)。其后，发现扩展蛋白是α-形式或β-形式(Shcherban等人，1995，PNAS 92，9245～9249)。
最近，已经发现扩展蛋白除了参与调节细胞扩展外，还参与调节多种其他植物过程，其包括形态发生(Ruan等人，2001，Plant Cell 13，47～60)、果实的软化(Rose等人，2000，Plant Physiology 123，1583～1592；Civello等人，1999，Plant Physiology 121，1273～1280)、花粉管的生长(Cosgrove等人，1997，PNAS 94，6559～6564)、重力应答根(graviresponding root)的伸长(Zhang和Hasenstein，2000，Plant CellPhysiology 41，1305～1312)以及根部细胞的伸长(Lee等人，2003，PlantPhysiology 131，985～997)(参见综述，Lee等人2001，Cur.Opin.Plant Biol.4，527～532)。
此外，充分研究了扩展蛋白在受淹涝的水稻(flooded rice)和番茄中的表达模式。已经发现在番茄的芽的顶端分生组织中表达扩展蛋白以用于早期叶原基的发端(Reinhardt等人，1998，Plant Cell 10，1427～1437)。克隆了一种扩展蛋白基因(Exp1)并且发现该基因通过其转化体而在番茄果实的生长和成熟中发挥重要作用(Brummell等人，1999，Plant Cell，112203～2216)。扩展蛋白mRNA在细胞壁的生长速率或疏松程度刚要开始提高时积聚，这暗示扩展蛋白基因的表达与细胞的伸长相关(Cho和Kende，1997a，Plant Cell 9，1661～1671；1997b，Plant Physiology 113，1137～1143；1998，Plant Journal 15，805-812)。已观察到在其中过表达扩展蛋白的转基因水稻植株与野生型相比进一步提高了子叶长度31％～97％(Choi等人，2003 Plant Cell，151386～1398)。然而，该转基因水稻植株因为雄性不育而不能够结种。
提高谷粒的产量是非常重要的，因为谷类植物的种子是大部分人的主食。因为淀粉通常占每颗谷粒的60重量％～70重量％，所以科学家已经进行了大量努力以增加谷粒的淀粉含量，借此提高谷粒的产量。
已知腺苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-AGPase)是别构酶，其催化质体中淀粉合成的首要关键步骤(即，将葡萄糖-1-磷酸和ATP转化为ADP-葡萄糖和PPi)并且对于别构调节非常敏感，其中3-磷酸甘油酸(3PGA)作为激活剂，Pi作为抑制剂。已经将编码这种酶的基因用于增强谷粒中淀粉合成的研究中。通过加入对应于6个核苷酸的2个氨基酸残基(酪氨酸和丝氨酸)衍生自玉米AGPase的突变体(Sh2-Rev6)变得对AGPase的抑制剂不敏感并且促进玉米粒中的淀粉合成，从而使种子重量提高了11％～18％(Giroux等人，1996，PNAS 93，5824～5829)。该玉米突变体AGPase(Sh2r6hs)已经降低了对抑制剂的敏感度，并且表现出其小亚基和大亚基间的更稳定结合。与野生型相比，使用CaMV35S启动子的转基因Sh2r6hs小麦系每株植物产生了平均多38％的种子重量(Smidansky等人，2002，PNAS 99，1724～1729)。与野生型相比，使用胚乳特异性启动子(玉米泛素启动子)的转基因Sh2r6hs水稻系产生了平均多20％的种子和植株重量(Smidansky等人，2003，Planta，216，656-664)。
因此，已经有对能够显著提高生物量或种子产量的转基因植物的需要。

发明内容
因此，考虑到现有技术中所存在的上述问题，已经实现了本发明，并且本发明的目的是提供甘薯扩展蛋白(IbExpansin)cDNA，使用该cDNA能够制备高产的转基因植物。
本发明的另一个目的是提供携带IbExpansin cDNA的植物转化载体。
本发明进一步的目的是提供包含携带有IbExpansin cDNA的载体的高产转基因植物。
根据本发明的一个方面，提供了分离的DNA片段，其包含SEQ IDNO.1的核苷酸序列。
优选该DNA片段是从甘薯(Ipomoea batatas cv Jinhongmi)扩展蛋白基因(IbExpansin)合成的cDNA。
根据本发明的另一个方面，提供了用于转化植物的双元载体，其包含该DNA片段。
根据本发明进一步的方面，同样提供了包含所述DNA片段或所述载体的微生物。
在另外一个方面中，本发明提供了包含所述DNA片段或所述载体的转基因植物。
在更进一步的方面中，本发明提供了适合扩增DNA片段的PCR引物，所述DNA片段包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列，所述引物由SEQID NO5或6中所示的核苷酸序列表示。
在另外一个方面中，本发明提供了甘薯扩展蛋白基因(IbExpansin)的可读框(ORF)，其包含SEQ ID NO.11的核苷酸序列，其范围是SEQID NO.1的第34位核苷酸～第750位核苷酸。
在更加进一步的方面中，本发明提供了用于转化植物的二元载体，其包含甘薯扩展蛋白基因(IbExpansin)的ORF。
在另外一个方面中，本发明提供了包含所述ORF或所述二元载体的微生物。
在更加进一步的方面中，本发明提供了包含所述ORF或所述二元载体的转基因植物。
在另外一个方面中，本发明提供了一种从所述ORF翻译而来的分离的多肽，其包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
在最后一个方面中，本发明提供了用于提高种子产量和/或生物量的方法，其包括将扩展蛋白基因插入到二元载体中，并将该二元载体引入到植物中。


通过下面的详细描述并结合附图，将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，其中图1是显示用于克隆全长甘薯扩展蛋白cDNA的初次PCR(聚合酶链式反应)的结果的图；图2是显示用于克隆全长甘薯扩展蛋白cDNA的再次PCR的结果的图，其使用初次PCR的产物作为模板；图3是显示根据本发明通过PCR克隆的全长甘薯扩展蛋白cDNA的图；图4显示本发明的甘薯扩展蛋白cDNA的氨基酸序列与其他植物扩展蛋白cDNA的氨基酸序列的比较；其中PcExpansm‘欧洲酸樱桃(Prunus cerasus)’PpExpansm‘桃(Prunus persica)’PaExpansin‘欧洲甜樱桃(Prunus avium)’CaExpansm‘辣椒(Capsicum annuum)’LeExpansin‘番茄(Lycoperson esculentum)’IbExpansin‘甘薯(Ipomoea batatas)’；图5显示在检测本发明的甘薯扩展蛋白基因的表达模式中所使用的甘薯组织；其中在Northern印迹分析中所使用的甘薯组织如下

图6显示根据本发明的甘薯扩展蛋白基因(IbExpansin)的表达模式；其中，1FRN；2茎-FRN；3叶-FRN；4叶柄-FRN；5FRLS；6SR；7茎-SR；8叶-SR；9叶柄-SR；图7显示在构建用于携带本发明的甘薯扩展蛋白cDNA进入拟南芥(Arabidopsis)的二元载体的各种过程阶段所得到的结果；其中，aKpnI/BamHI消化；b菌落PCR；cKpnI/BamHI消化；图8是显示用于携带本发明的甘薯扩展蛋白cDNA进入拟南芥的pIbExpansin二元载体的结构的示意图；图9显示本发明的甘薯扩展蛋白cDNA在拟南芥转化体中的表达；其中，1大小标记物；2WT；3Exp-1；4Exp-4；5Exp-22；图10显示表达本发明的甘薯扩展蛋白cDNA的拟南芥转化体与野生型之间叶子生长的比较；其中，在a中，□宽度，长度40mm；图11显示表达本发明的甘薯扩展蛋白cDNA的拟南芥转化体与野生型的种子；图12显示表达本发明的甘薯扩展蛋白cDNA的拟南芥转化体与野生型之间种子中淀粉含量的比较；图13显示表达本发明的甘薯扩展蛋白cDNA的拟南芥转化体与野生型之间种子中蛋白质含量的比较。
具体实施例方式
为了达到这些目的，本发明的发明人取得了以下成功克隆了甘薯扩展蛋白cDNA(IbExpansin)，构建了适合植物转化的携带有所述克隆的二元载体，和将该载体转化入拟南芥。发现该转基因拟南芥在生物量方面有了显著提高，并且特别是种子产量提高了3倍。
因此，在一个方面，本发明提供了分离的DNA片段，其包含SEQID NO.1的核苷酸序列。
所述cDNA具有长1,213bp的核苷酸序列，其由33bp的5’-UTR、717bp的ORF(可读框；SEQ ID NO.11)以及463 bp的3’-UTR构成。
根据另一个方面，本发明提供了分离的多肽，其具有从所述ORF翻译而来的SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
根据进一步的方面，本发明提供了用于转化植物的携带有所述甘薯(Ipomoea batatas cv Jinhongmi)扩展蛋白cDNA(IbExpansin)的二元载体(pIbExpansin)。
所述植物转化载体是二元载体，其能够在植物中稳定表达感兴趣的外源基因。
在pMBP1载体中，本发明的甘薯扩展蛋白cDNA(IbExpansin)定位在CaMV35S启动子和NOS终止子之间。本领域技术人员应该理解，可以使用任何其他植物转化载体来代替pMBP1载体。
根据更进一步的方面，本发明提供了在二元载体上携带有本发明的甘薯扩展蛋白cDNA(IbExpansin)的转基因拟南芥。
所述二元载体可以通过使用农杆菌(Agrobacterium)或基因枪而引入到植物中。在本发明的实施方式中，将浸花法(floral dip)(Clough和Bent，1998，Plant J.)用于转化拟南芥。
除了拟南芥外，还可以将本发明的甘薯扩展蛋白cDNA(IbExpansin)引入到任何适合具有提高的生物量或种子产量的植物中。
根据另外一个方面，本发明提供了用于PCR扩增本发明的甘薯扩展蛋白cDNA(IbExpansin)的一对引物，其分别由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所表示。
进一步，本发明提供了提高种子产量和/或生物量的方法，其通过将扩展蛋白基因插入到二元载体并将该二元载体引入到植物中。如上所述，已公开了一些扩展蛋白家族基因，但是在本发明之前的报告中，没有任何地方提到扩展蛋白基因用于种子产量的提高的应用。根据本发明，可将多种扩展蛋白基因引入到植物中以提高它们的生物量和/或种子产量。
本发明针对甘薯(Ipomoea batatas)扩展蛋白cDNA(IbExpansin)，如果使用该cDNA进行转化则使得植物能够提高生物量和/或种子产量。因此，本发明能够有效地用于高产植物的产生。
通过以下实施例能够得到对本发明的更好理解，提供以下实施例是为了说明本发明，而不能解释为对本发明的限制。
实施例1甘薯扩展蛋白cDNA的克隆从甘薯的新鲜贮藏根分离总RNA，并将其用于构建EST(表达序列标签)文库。使用该文库，克隆了2,859个EST，并保存在国家生物技术信息中心(National Center for biotechnology Information，NCBI)，其NCBI登记号为NO.BU690119～BU692977(You等人，2003，FEBSLetters 536，101～105)。其中，发现IbExpansin(NCBI登记号No.BU691452)为大约1kb长，并将其鉴定为缺少起始密码子ATG的部分cDNA。为了得到全长IbExpansin，在存在IbExpansin-特异性引物(SEQID NO.3)和T3载体引物的情况下，使用先前存在的早期甘薯贮藏根发育的EST文库作为模板进行PCR。然而，在所期望的5’全长大小的位置没有见到的条带(图1)。
从在期望的全长位置的琼脂糖凝胶切下来的凝胶片中洗脱DNA片段，并将所述DNA片段作为模板进行PCR，其利用一组基因特异性的嵌套引物(SEQ ID NO.4)和T3引物。结果，得到了具有大约350bp长度的PCR产物(图2)。
将该PCR产物插入到pGEM-T Easy载体中，以进行测序分析并鉴定IbExpansin的5’序列。
以该核苷酸序列为基础，合成了分别在其末端提供有BamHI和KpnI限制性位点的5’和3’引物。使用这些引物进行RT-PCR以获得全长IbExpansin(图3)。
实施例2全长IbExpansin的核苷酸序列的测序和分析通过PCR克隆了1.2kb的全长cDNA，并将其插入到pGEM-T Easy载体中，接着对所述载体进行扩增。测序分析揭示IbExpansin为1,213bp长，并且由33bp的5’-UTR、717bp的ORF和463bp的3’-UTR构成。将该全长IbExpansin cDNA保存在NCBI，其登记号为No.DQ515800)。由239个氨基酸构成的IbExpansin氨基酸序列除了N-末端区域外都是高度保守的(图4)，并且与番茄和胡椒的扩展蛋白氨基酸序列具有高达78％的同源性(表1)。在表1中显示本发明的甘薯扩展蛋白cDNA与其他植物扩展蛋白cDNA之间氨基酸序列的同源性。
表1扩展蛋白氨基酸序列之间的同源性

实施例3组织的Northern印迹分析1.Northern印迹通过Northern印迹利用处于不同发育阶段的各种组织检测IbExpansin的表达模式。
为了分离总RNA，将处于各种发育阶段的甘薯的根、茎、叶和叶柄用作RNA源。即从以下组织中分离总RNA(图5)处于非贮藏根阶段的组织，例如根(FRN处于非贮藏根阶段的须根)、茎(茎-FRN)、叶(叶-FRN)和叶柄(叶柄-FRN)；处于早期贮藏根阶段的组织，例如根(处于早期贮藏根阶段的须根，FRES)；处于贮藏根阶段的组织，例如根(SR)、茎(茎-SR)、叶(叶-SR)和叶柄(叶柄-SR)；和处于晚期贮藏根阶段的组织，例如根(处于晚期贮藏根阶段的须根，FRLS)。使用4.4M的胍盐-SDS裂解缓冲液(Chirgwin等人1979)/5.7M CsCl梯度法(Glisin等人，1974)进行总RNA的提取。在1％琼脂糖-甲醛凝胶上对大约20μg所提取的总RNA进行电泳，并将其转移到Tropilon-plusTM尼龙膜(Tropix，美国)上。
通过扩增从2.5ng的携带有1kb扩展蛋白EST克隆的质粒利用PCR得到了探针，其中所述PCR是在PCR混合物中进行的，所述PCR混合物含有100μM除了dCTP之外的dNTP混合物、100μM的dCTP-生物素、各为10μM的载体(pBluescript II)引物T3(5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’；SEQ ID NO.7)和T7(3’-CGGGATATCACTCAGCATAATG-5’；SEQ ID NO.8)、1×PCR缓冲液和1单位的Taq聚合酶，终体积为10μl，开始时在95℃预变性5分钟；接着进行35个循环95℃变性10秒、65℃退火30秒；以及72℃延伸30秒。
使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(QIAGEN，德国)对PCR扩增的生物素标记的探针进行纯化，并将其以大约100ng的量加到膜上，接着在65℃杂交18个小时。使用2×SSC/1％SDS在室温下对膜清洗两次，每次5分钟，接着使用0.1×SSC/1％SDS在室温下清洗两次，每次15分钟，最后使用1×SSC在室温下清洗两次，每次5分钟。使用Southern-starTM试剂盒(Tropix，美国)进行探针检测。使用封闭缓冲液(1×PBS、0.2％I-BlockTMReagent和0.5％SDS)对印迹进行处理，并使用偶联有碱性磷酸酶的链霉抗生物素蛋白进行标记，接着使用CDP-StarTM(Ready-to-Use)进行处理。将膜暴露到X-光胶片(Fujifilm，日本)，时间为10分钟～1.5小时。
2.IbExpansin的表达模式在包括FRN、茎-FRN、叶-FRN和叶柄-FRN的处于非贮藏根阶段的组织中对IbExpansin的表达进行检测，其中FRN和叶柄-FRN具有最高的水平。然而，在晚期贮藏根阶段的须根(FRLS)中检测到IbExpansin显著降低的表达水平，同时在处于贮藏根阶段的茎和叶中检测到显著低水平(图6)。这些表达模式强烈暗示IbExpansin在处于活跃伸长生长的组织中活跃表达。
实施例4二元载体的构建BamHI和KpnI限制性酶切位点在用于PCR扩增全长IbExpansincDNA的引物(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)中的存在使得利用BamHI和KpnI对pGEM-T Easy载体进行消化以从其切出cDNA成为可能。将cDNA插入到pMBP1载体中的CaMV35S启动子和NOS终止子之间以构建二元载体pIbExpansin(图8)。通过菌落PCR和限制性酶消化对该插入进行确认(图7)。
实施例5将pIbExpansin转化入拟南芥中利用冻融法(An，G.1987，Methods in Enzymology)，将在实施例4中所构建的pIbExpansin载体引入到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58C1中。
在28℃对在载体上携带有感兴趣基因的农杆菌随着搅拌培养2天，接着在刚刚开花之前使之与拟南芥(Arabidopsis thaliana cv.columbia)的柱头接触以便转化该植物。
实施例6对拟南芥转化体进行筛选和鉴定从实施例5中所制备的拟南芥转化体收集种子，并将其铺在含有30mg/L卡那霉素的组织培养MS平板上。将推定的转化体(T1)移植到土壤中，并用于培育T2植株，所述T2植株由于引入了单拷贝的IbExpansin cDNA而表现出对卡那霉素抗性的3∶1的分离比例，并从T2植株中收集纯合的种子。定量分析从T2植株中随机选择的3个品系(Exp-1、Exp-4和Exp-22)的IbExpansin表达水平。
为了测定被转化的拟南芥中IbExpansin的表达水平，借助Tri-Reagent(Invitrogen，美国)从被转化的拟南芥的叶子中分离总RNA和并将其在存在SuperScriptTMIII(Invitrogen，美国)的情况下，利用寡聚(dT)进行反转录。将拟南芥的eIF4A1基因用作内参。同时使用IbExpansin特异性引物(5’-GTAGGATCCCATTCCTCTACCAATTCAACTGAA-3’；SEQ ID NO.5；5’-GATGGTACCACTGTCTCCACACTCAGCATT-3’；SEQ ID NO.6)和eIF4A1引物(5’-GCTCTCCCGTGGTTTCAAGGACCAGATC-3’；SEQ ID NO.9；5’-GTCTGTGAGCCAATCAACCTTACGCCTG-3’；SEQ ID NO.10)进行RT-PCR，所述RT-PCR开始时是在94℃预变性5分钟；接着是进行30个循环94℃变性30秒、58℃退火30秒以及72℃延伸1分钟；之后是最终在72℃延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳对这样所产生的PCR产物进行分离，以检测野生型带中未出现的IbExpansin转录体(图9)。
实施例7转基因拟南芥的生长分析在IbExpansin拟南芥转化体和野生型之间进行生长模式的比较。将Exp-1、Exp-4和Exp-22以及野生型播种到土壤中，并在花柄刚刚出现之前，对叶子的生长状态进行比较。在叶子数目方面，Exp-1、Exp-4和Exp-22与野生型没有不同，但生长要超过野生型，因此它们的叶子在长度和宽度方面都大于野生型(图10和表2)。
表2

实施例8转基因拟南芥的种子产量的分析对IbExpansin拟南芥转化体的种子大小进行测定，并与野生型进行比较。在这方面，使用T3代的纯合种子。如在光学显微镜下所观察到的，与野生型相比，Exp-1、Exp-4和Exp-22全部在种子大小方面有提高(图11)。
实施例9转基因拟南芥的种子中淀粉含量的分析对IbExpansin拟南芥转化体的种子中淀粉含量进行测定，并与野生型进行比较。在这方面，拟南芥转化体和野生型都采用了T4代纯合种子。在液氮中使用研杵和研钵将这些种子磨碎，并将1g每种磨碎的种子加入到在150mL锥形瓶中的25ml蒸馏水中。将蒸馏水中的样品随着搅拌煮沸3分钟，接着在灭菌器中于135℃降解淀粉1小时。将水溶液置于室温以将温度降低到大约60℃。在加入100ml蒸馏水后，使用淀粉化验试剂盒(SIGMA)根据制造商的程序对样品溶液的淀粉浓度进行分析。IbExpansin拟南芥转化体具有在一颗Exp-1种子中1.55±0.13μg的淀粉含量，在一颗Exp-4种子中具有1.48±0.03μg的淀粉含量，在一颗Exp-22种子中具有1.54±0.06μg的淀粉含量，这都在重量上超过了野生型(0.98±0.06μg)(图12和表3)。
表3

实施例10转基因拟南芥的种子中蛋白质含量的分析对IbExpansin拟南芥转化体的种子中蛋白质含量进行测定，并与野生型进行比较。在这方面，使用T3代的纯合种子。将每种所述转化体和野生型的T3代的100个种子在蛋白质提取溶液(250mM蔗糖、50mMTris HCl(pH8.0)、2mM DTT、2mM EDTA和蛋白质抑制剂混合物)中使用钻子和塑料棒磨碎，之后在4℃于12,000rpm离心10分钟。将上清液转到新管中，并使用蛋白质化验试剂盒(BioRad)对上清液进行定量分析以得到每颗种子的蛋白质含量。发现所有的IbExpansin拟南芥转化体Exp-4和Exp-22均具有比野生型高的蛋白质含量。这通过将2μl的每种样品上样到12％的SDS/聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳并使用考马斯亮蓝显像而确认(图13和表4)。
表4

实施例11转基因拟南芥的种子产量的分析检验IbExpansin拟南芥转化体Exp-4每1000颗种子的重量、每棵植株的长角果数目、每个长角果的种子数目、种子的总数目以及种子的总重量。其结果提供在图12和表3中。如该图和表所示，在每1000颗种子的重量、每棵植株的长角果数目、每个长角果的种子数目、种子的总数目以及种子的总重量方面，IbExpansin拟南芥转化体均优于野生型。结果，测定的每棵IbExpansin拟南芥转化体植株的种子产量为444.27±0.62mg，这比野生型的149.73±0.19mg重3倍(表5)。在表5中显示表达本发明的甘薯扩展蛋白cDNA的拟南芥转化体与野生型之间种子产量的比较。
表5转基因IbExpansin-拟南芥的种子产量

1以每1,000颗种子的mg数表示所产生的种子的重量。
因此，本发明的IbExpansin cDNA能够用于提高植物的生物量，特别是能够用于提高农作物的种子产量。
工业实用性正如目前为止所描述的，本发明提供了能够用于转化植物的IbExpansin cDNA(获自Ipomoea batatas cv Jinhongmi的扩展蛋白cDNA)，所得到的转基因植物能够以比之前高的速度生长，并且大大提高了种子产量和/或生物量。因此，本发明能够用于高产转基因植物的产生。
尽管为说明目的，已经公开了本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员会理解可以进行各种改进、增加和替换，而不离开所附权利要求中所公开的本发明的范围和精神。
序列表<110>高丽大学校产学协力团<120>甘薯扩展蛋白cDNA和使用该cDNA的高产转基因植物<130>FAI07KR0892-C<150>KR 10-2006-0049596<151>2006-06-01<160>11<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>1213<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<400>1cattcctcta ccaattcaac tgaagcaata acaatggcgg ttcttgagct tcttctggtc 60ggagttcttg ccacgttgtc tccggtgcat ggctactggg gctggagcag cgctcgcgcc120accttctacg gcggcggtga tgcttctgga acaatgggcg gagcctgcgg gtatgggaac180ctgtatagct caggctatgg caccaacact gcggcactta gcaccgctct gttcaacaat240gggctcagct gcgggtcctg tttccagata aggtgtgtga acgaccggtc ctgcctccgc300ggcgtaatca ccgtcaccgc caccaatttc tgcccgcccg gcggctggtg cgagcccccc360aacccacact ttgatctctc tcagcctgtt ttcttgagaa ttgcccagta cagagccgga420gttgttcccg ttgcttaccg acgggtgcct tgcaggagga gtggaggaat caggttcacc480attaacggcc atgctttctt caacctggta ctagtaacca acgtgggagg ctccggcgac540gtacacgccg tgtacatcaa aggatcaaga accgggtggc aaatgatgtc cagaaactgg600ggccaaaact ggcagagcaa cgccaacctc aacggccaaa gcctctcatt ccgggtggtc660accggcgaca gccgcagcgt cgtctcctac aacgccgctc cccccggctg gtccttcggc720cagacctact ccggcgccca gttccgctag gccggaattc atcaaacacc cccatttttt780tcccgccata tatatatgat ctccaaacct atacataact aaagcctaca ccatttttac840aagtttgaaa tgcaattaaa gtcatgggga tgggaaaatg ttgatcaagt ttccggccgc900cctctctcac ttttttttct aaaagggatt ggttttgatc gaaagccctt ttggccatga960aaattggcca ttcaatcaac aagaattgaa gcagagttga agtggtagtt agttatatca 1020agattgtgct accccatgac tagcttaatt agtactgcat tatttatgtg attattatta 1080ttatgcagac aaaatgtgtc tgcataccta ccctgtggaa caacattaat ttttttttcc 1140tcgtcttctt cgtcgtcgtt tgtaattagt atagcattaa ggttaaacag ctaatgctga 1200gtgtggagac agt<210>2
<211>238<212>PRT<213>甘薯(Ipomoea batatas)<400>2MAVLELLLVG VLATLSPVHG YWGWSSARAT FYGGGDASGT MGGACGYGNL YSSGYGTNTA 60ALSTALFNNG LSCGSCFQIR CVNDRSCLRG VITVTATNFC PPGGWCEPPN PHFDLSQPVF 120LRIAQYRAGV VPVAYRRVPC RRSGGIRFTI NGHAFFNLVL VTNVGGSGDV HAVYIKGSRT 180GWQMMSRNWG QNWQSNANLN GQSLSFRVVT GDSRSVVSYN AAPPGWSFGQ TYSGAQFR<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物<400>9gctctcccgt ggtttcaagg accagatc<210>10
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>10gtctgtgagc caatcaacct tacgcctg<210>11<211>717<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<400>11atggcggttc ttgagcttct tctggtcgga gttcttgcca cgttgtctcc ggtgcatggc 60tactggggct ggagcagcgc tcgcgccacc ttctacggcg gcggtgatgc ttctggaaca120atgggcggag cctgcgggta tgggaacctg tatagctcag gctatggcac caacactgcg180gcacttagca ccgctctgtt caacaatggg ctcagctgcg ggtcctgttt ccagataagg240tgtgtgaacg accggtcctg cctccgcggc gtaatcaccg tcaccgccac caatttctgc300ccgcccggcg gctggtgcga gccccccaac ccacactttg atctctctca gcctgttttc360ttgagaattg cccagtacag agccggagtt gttcccgttg cttaccgacg ggtgccttgc420aggaggagtg gaggaatcag gttcaccatt aacggccatg ctttcttcaa cctggtacta480gtaaccaacg tgggaggctc cggcgacgta cacgccgtgt acatcaaagg atcaagaacc540gggtggcaaa tgatgtccag aaactggggc caaaactggc agagcaacgc caacctcaac600ggccaaagcc tctcattccg ggtggtcacc ggcgacagcc gcagcgtcgt ctcctacaac660gccgctcccc ccggctggtc cttcggccag acctactccg gcgcccagtt ccgctag
权利要求
1.一种分离的DNA片段，其包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的DNA片段，其中所述的DNA片段是来自甘薯(Ipomoea batatas cv Jinhongmi)扩展蛋白基因(IbExpansin)的cDNA。
3.一种用于转化植物的二元载体，其包含权利要求1所述的DNA片段。
4.一种微生物，其包含权利要求1所述的DNA片段或权利要求3所述的载体。
5.一种转基因植物，其包含权利要求1所述的DNA片段或权利要求3所述的载体。
6.一种适合扩增DNA片段的PCR引物，所述DNA片段包含SEQ IDNO.1的核苷酸序列，所述引物由SEQ ID NO5或6中所示的核苷酸序列所表示。
7.甘薯扩展蛋白基因(IbExpansin)的可读框(ORF)，其包含SEQID NO.11的核苷酸序列。
8.一种用于转化植物的二元载体，其包含权利要求7所述的甘薯扩展蛋白基因(IbExpansin)的ORF。
9.一种微生物，其包含权利要求7所述的ORF和权利要求8所述的载体。
10.一种转基因植物，其包含权利要求7所述的ORF或权利要求8所述的载体。
11.一种由权利要求7所述的ORF翻译而来的分离的多肽，其包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
12.一种用于提高生物量和/或种子产量的方法，其包括将扩展蛋白基因插入到二元载体中，并将所述二元载体引入到植物中。
全文摘要
本发明涉及甘薯扩展蛋白cDNA和使用该cDNA的高产转基因植物，具体地说，本发明公开了甘薯扩展蛋白cDNA(IbExpansin)，携带有该cDNA的植物转化载体以及包含该载体的转基因植物。使用该IbExpansincDNA制备的转基因拟南芥生长超过野生型拟南芥，借此增加了大小，并将种子产量提高到最高达3倍。这样，该基因能够用于产生高产量的转基因植物，以提高生物量和/或种子产量。
文档编号C07K14/415GK101082048SQ20071010224
公开日2007年12月5日 申请日期2007年5月8日 优先权日2006年6月1日
发明者裵贞明, 卢雪娥, 朴宣希, 郭满燮, 申正燮, 白敬喜 申请人:高丽大学校产学协力团