梓醇及其衍生物在制备防治脑血管疾病药物中的用途的制作方法

专利名称：：梓醇及其衍生物在制备防治脑血管疾病药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及梓醇及其衍生物医药用途，即梓醇及其衍生物在有效治疗多种脑血管疾病药物中的应用。
背景技术：
：脑血管疾病是严重危害人类健康的一组常见病和多发病，是继心脏病、恶性肿瘤之后威胁人类健康的第三大"杀手"。脑血管疾病分缺血性脑血管病和出血性脑血管病两大类，前者常见的有短暂脑缺血发作(TIA)和脑梗塞，后者常见的有脑出血和蛛网膜下腔出血。因其高发病率、高致残率、高致死率和高复发率而给个人、家庭和社会带来了极大的痛苦、巨大的精神压力和沉重的经济负担。幸存者也往往要面对躯体功能障碍、视力听力缺失、认知功能下降和情感人格改变等一系列神经精神功能损害的症状，还得承受由躯体疾病所引起的沉重心里负担。严重的后遗症往往显著降低脑血管病幸存者的生活独立性，使患者生活质量和自然社会适应能力明显下降。随着我国人口预期寿命的延长和人口老龄化速度的加快，脑血管疾病的发病率和患病率逐年增高。一直以来，脑血管疾病造成的神经细胞死亡没有切实有效的治疗方法，留下无法恢复的神经功能缺损，给患者及家庭带来极大的痛苦。虽然国内外研究人员从溶栓治疗到介入微创治疗，都力求恢复血供，保护处于"半暗带"的神经元，治疗脑血管疾病的药物都以维持生命机能、对症支持治疗和防治并发症为主要目的，但是都不能阻断脑损伤的发生和促使受损脑组织再生。因此，能够促使神经再生，替代坏死神经而重建神经功能而达到"无后遗症"才是治疗的最终目标。经检索发现，梓醇及其衍生物目前尚无在治疗脑血管疾病上的应用。
发明内容研究证明，梓醇及其衍生物能够能够通过血脑屏障，可以提高机脑组织缺血缺氧的耐受能力，促进神经元轴突和树突生长、增强突触重构、促进脑损伤后神经功能恢复。因此，本发明的目的是提供梓醇及其衍生物在制备防治或治疗脑血管疾病药物上的应用。本发明提供的预防或治疗脑血管疾病的化合物是梓醇和其衍生物，即为所示化合物I:OH(I)其中化合物R,为H、OH或者OR4(R4为QCs酰基，dC5的垸基或糖苷基)，R2为H、OH或ORs(R5为QCs酰基，C,C5的烷基)，R3为OH或者OR6(R6为酰基)；在I式中若R,为OH，R2为OH，R3为OH，则该结构式所确定的化合物是梓醇；若R,为H。^^!_。，R2为OH,R3为OH，则该结构式所确定的化合物是梓苷；若&为OH，胡黄连苦苷；若Ri为OH，胡黄连苷；若Rl为HO物是黄金树苷；若Ri为OH，R2为H。_^|_。，R3为OH，则该结构式所确定的化合物是R2为OH，R3为。°。，则该结构式所确定的化合物是—!-。，R2为OH，R3为OH，则该结构式所确定的化合R2为''，R;为OH，则该结构式所确定的化合物是Scutellarioside-II;上述化合物的药学应用采用的实验的方法及结果开颅法制备SD大鼠局灶性永久性脑缺血模型。造模成功后分为模型组、生理盐水组、梓醇低、中、高剂量(1、5、10mg/kg体重)治疗组和胞磷胆碱阳性药物对照组，同时设立假手术组为对照。以腹腔注射给予不同剂量梓醇为干预措施，首次给药时间分为脑缺血后6h或脑缺血后24h，每天给药一次，连续7天；采用Bederson评分、肌力测试、平衡木试验和前肢技巧性食物抓取试验评价各组神经功能恢复状况；采用高效液相色谱技术定性检测梓醇能否进入脑脊液；采用Golgi-Cox染色显示神经元树突和树突棘，观察梓醇对神经元树突生长的影响；采用免疫荧光组化和Westernblot检测新生轴突和突触分子标志GAP-43和P38蛋白表达，观察梓醇对脑缺血后神经元轴突新生和突触重构的影响；采用电镜技术观测大脑皮质神经毡内突触数目，观察梓醇对脑缺血后神经元超微结构的影响；采用神经示踪和免疫荧光双标技术显示脊髓颈膨大区皮质脊髓束芽生纤维以及脑缺血灶周围残存大脑皮质与健侧感觉运动皮质区的纤维联系，观察梓醇对长距离轴突芽生的影响；采用免疫荧光组化和Westernblot检测各实验组NogoA、NgR、BDNF和TrkB蛋白表达变化，初步探讨梓醇促神经修复作用分子基础。1.梓醇及其衍生物促进脑缺血大鼠神经缺失功能恢复采用Bederson神经功能评分、肌力评定、平衡木行走试验和左前肢食物抓取试验等多种方法评定脑缺血后1、4、7、15和21天各实验组神经缺失功能恢复状况，证实梓醇及其衍生物对脑缺血后功能恢复有促进作用。在脑缺血后21天，梓醇及其衍生物中、高剂量组受累前肢(左)食物抓取成功率分别为48.7%±5.4%(约相当于基线值72%)和47.3%±4.8%(约相当于基线值70%)，与模型组(25.8%±4.1%，约相当于基线值38%)比较差异具有显著性0<0.05)。提示梓醇及其衍生物对脑缺血后感觉运动功能恢复有促进作用。且脑缺血后21天时，术后6h开始给药组和术后24h开始给药组左前肢抓取成功率差异无显著性(p>0.05)。提示脑缺血后给予梓醇及其衍生物治疗能促进大鼠功能恢复。2.梓醇及其衍生物促进大鼠脑缺血后神经元轴突和树突生长作用(i)梓醇及其衍生物促进缺血灶周围大脑皮质GAP-43蛋白表达GAP-43是神经元新生轴突的分子标志。缺血灶周围区大脑皮质GAP-43阳性细胞数模型组和生理盐水组均较假手术组增加，但差异无显著性(&0.05)梓醇及其衍生物各剂量治疗组和胞磷胆碱组阳性细胞均比假手术组、模型组和生理盐水组明显增加，且梓醇及其衍生物各剂量治疗组比胞磷胆碱组增加更明显(/<0.05)。Westernblot检测结果与此相符。提示梓醇及其衍生物对神经元轴突新生有促进作用。(2)梓醇及其衍生物促进脑缺血灶周围皮质神经元树突生长模型组缺血周围残存大脑皮质神经元树突平均分支为24.67±4.04，较假手术组14.67±2.08明显减少(/<0.05);梓醇及其衍生物中剂量组为23.67士3.51，比模型组和胞磷胆碱组显著增加。<0.05)，接近假手术组水平(p〉0.05)。各组树突棘密度变化趋势与树突分支变化趋势相似。提示脑缺血后缺血灶周围大脑皮质神经元树突分支和树突棘密度均明显减少；梓醇及其衍生物可促进树突分叉，增加树突棘密度。(3)梓醇及其衍生物增强缺血灶周围大脑皮质芽生轴突与健侧感觉运动皮质区的联系绿色荧光显示BDA标记的神经细胞和纤维，绿色荧光强度系数越大反映缺血灶周围大脑皮质内BDA标记纤维的数量越多。红色荧光标记GAP-43表达阳性的神经细胞和轴突，红色荧光强度系数越大反映缺血灶周围大脑皮质具有生长反应的神经细胞和新生突纤维的数量越多。两者共定位呈黄色，显示缺血灶周围皮质新生的芽生轴突已经与健侧感觉运动皮质建立纤维联系；Pearson相关系数反映芽生轴突被BDA标记的频度，其值越大反映缺血灶周围皮质芽生轴突与健侧感觉运动皮质区的纤维联系越密切。结果绿色荧光强度系数各实验组间无明显差异(p>0.05)，提示梓醇及其衍生物不增加健侧感觉运动皮质区向缺血灶周围皮质区单位面积纤维投射数目。红色荧光强度系数梓醇及其衍生物中剂量组明显大于假手术组、模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组(p<0.05)，提示梓醇及其衍生物可明显促进缺血灶周围皮质神经元轴突芽生。pearson相关系数模型组较假手术组明显增加(p<0.05)，梓醇及其衍生物中剂量组明显大于模型组和胞磷胆碱组(/<0.05)，提示缺血灶周围皮质芽生轴突是缺血灶周围大脑皮质与健侧感觉运动皮质脑区建立联系的纤维基础之一；梓醇及其衍生物治疗可增加健侧感觉运动皮质区和缺血灶周围大脑皮质间的纤维联系。(4)梓醇及其衍生物增加脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束越边纤维数量大鼠皮质脊髓束在脊髓颈膨大节段集中走行在脊髓后(背)索。正常情况下，皮质脊髓束绝大部分纤维发枝支配同侧脊髓前角，很少越边支配对侧脊髓前角。脑缺血后，模型组健侧皮质脊髓束越边纤维占4.7%±1.3%，较假手术组1.4%±0.5%明显增加(p<0.05)，提示健侧大脑半球感觉运动皮质在脑缺血后功能恢复过程可能发挥重要作用。梓醇及其衍生物干预后，健侧皮质脊髓束越边纤维占8.5%±2.1%，较模型组和胞磷胆碱组(5.5%±1.8%)明显增加(p<0.05)，提示梓醇及其衍生物对脑缺血后神经元长距离轴突芽生有促进作用。(5)梓醇及其衍生物促进脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束纤维芽生用绿色荧光显示BDA标记的健侧皮质脊髓束，红色荧光显示GAP-43表达阳性的新生轴突纤维，BDA/GAP-43共定位后呈黄色，显示健侧皮质脊髓束芽生的轴突。BDA/GAP-43共定位分析，红色荧光强度系数越大GAP-43表达水平越高；Pearson相关系数越大脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束新生的芽生轴突越多。模型组红色荧光强度系数明显大于假手术组(;<().05);梓醇及其衍生物组较其他各实验组均明显增大05);提示梓醇及其衍生物对神经元轴突芽生有促进作用。模型组Pearson相关系数明显大于假手术组(p<0.05)，梓醇及其衍生物组较模型组和胞磷胆碱组均明显增大(/<0.05)。提示脑缺血损伤可刺激健侧皮质脊髓束芽生；梓醇及其衍生物对脑缺血后健侧皮质脊髓束芽生有明显促进作用。(6)梓醇及其衍生物下调健侧大脑皮质Nogo-A蛋白表达Nogo-A阳性细胞呈现红色，分布在损伤侧和健侧大脑皮层、海马、纹状体等脑区。大脑皮层Nogo-A阳性细胞数(个/视野)假手术组为56.33士5.51，模型组为213.33±3.78，差异具有显著性("<0.05);梓醇及其衍生物中、高剂量组分别为121.5土8.35和100.33±7.51，均比模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组明显减少(p<0.05)。Westenblot检测结果与此相符。提示脑缺血后大脑皮质内Nogo-A表达上调，梓醇及其衍生物对Nogo-A蛋白表达有下调作用。(7)梓醇及其衍生物下调健侧大脑皮质NgR蛋白表达损伤侧和健侧大脑皮层、海马、纹状体等脑区均可见NgR阳性细胞，胞浆和突起呈绿色，细胞核未着色，具有神经元的典型形态特征。健侧大脑皮质NgR阳性细胞数假手术组、模型组和生理盐水组组间差异无显著性(;〉0.05)，提示脑缺血后15天，大脑皮质内NgR表达水平接近正常生理状态。梓醇及其衍生物中、高剂量组NgR阳性细胞数均比模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组明显减少(p<0.05)。Westenblot检测结果与NgR原位检测结果相符。提示梓醇及其衍生物对脑缺血后大脑皮质内NgR蛋白表达有下调作用。3.梓醇及其衍生物对大鼠脑缺血后突触重构的诱导作用(1)梓醇及其衍生物上调脑缺血后脑内突触素蛋白表达突触素(P38)是突触的分子标志，用FITC标记，呈现绿色荧光。阳性着色部位呈大小较均匀的点状或颗粒状，主要分布在神经毡内。阳性着色部位IOD值模型组和生理盐水组与假手术组差异无显著性(/〉0.05)，梓醇及其衍生物中、高剂量组均显著高于模型组和胞磷胆碱组(尸<0.05)。Westernblot半定量分析结果与此基本一致。提示梓醇及其衍生物能上调脑缺血后脑内突触素蛋白表达。(2)梓醇及其衍生物增加大脑感觉运动皮质神经毡内突触数目电镜下，感觉运动皮质神经毡内突触数目除假手术组外，各实验组缺血侧均比健侧减少。模型组健侧神经毡内突触数目与假手术组差异无显著性(P〉0.05)，但缺血侧明显少于假手术组(p<0.05),提示脑缺血后存在突触丢失现象；梓醇及其衍生物中剂量组健侧和缺血侧均比模型组和生理盐水组明显增加(p<0.05)，但与胞磷胆碱组差异无显著性(p〉0.05)，提示梓醇及其衍生物对脑缺血后突触重构有明显促进作用。G)梓醇及其衍生物促进缺血灶周围大脑皮质新生轴突形成突触连接绿色荧光显示P38标记的突触前末端，红色荧光显示GAP-43表达阳性的轴突纤维，GAP-43/P38共定位后呈现黄色，显示新生轴突形成的突触末端。用Pearson相关系数反映GAP-43/P38共定位频度。Pearson相关系数越大说明新生轴突形成突触越多。模型组和生理盐水组Pearson相关系数明显大于假手术组(p<0.05)，提示脑缺血可刺激新生轴突形成突触连接；梓醇及其衍生物各剂量组均比模型组明显增大(p<0.05)，且梓醇及其衍生物中、高剂量组明显大于胞磷胆碱组(;<0.05)。提示梓醇及其衍生物可增强脑缺血后新生轴突形成新的突触连接，促进脑缺血后有效轴突芽生。(4)梓醇及其衍生物上调缺血灶周围大脑皮质BDNF蛋白表达BDNF阳性细胞被Cy3标记，胞浆和突起呈现红色，胞核不着色，阳性细胞主要为神经元。BDNF阳性细胞数模型组和生理盐水组均较假手术组明显增加(尸<0.05)，提示脑缺血后BDNF表达上调；梓醇及其衍生物治疗组均比模型组明显增加(尸<0.05)，且梓醇及其衍生物中、高剂量治疗组也比胞磷胆碱组明显增加(尸<0.05)。Westernblot检测结果与此相符。提示梓醇及其衍生物可上调脑缺血后BDNF蛋白表达。(5)梓醇及其衍生物上调缺血灶周围大脑皮质TrkB蛋白表达TrkB阳性细胞胞浆和突起被FITC标记，呈现绿色，胞核不着色。缺血灶周围大脑皮质TrkB阳性细胞数模型组较假手术组有减少趋势，但差异无显著性(尸〉0.05);梓醇及其衍生物中剂量治疗组明显多于模型组和胞磷胆碱组(尸<0.05)。Westernblot检测结果与此相符。提示梓醇及其衍生物可上调脑缺血后TrkB蛋白表达。4.梓醇及其衍生物能够通过血脑屏障给药后40min的大鼠脑脊液，HPLC法检测分析发现在保留时间为10.4min处可见梓醇及其衍生物的紫外吸收峰，与脑脊液加样对照梓醇及其衍生物的紫外吸收峰保留时间相同，表明给药后梓醇及其衍生物分布到大鼠脑脊液中。本发明中梓醇及其衍生物毒性很小。梓醇及其衍生物急性毒性试验口服最大给药量为36.0g/kg43.0g/kg，未见动物死亡。腹腔注射给药LDs。为9.0g/kg17g/kg，静脉注射给药LDw,为1.lg/kg2.4g/kg。图1olgi-Cox染色显示各实验组缺血周围大脑皮质代表性神经元树突和树突棘(Golgi-Cox染色，A100X，B200X,C-F400X)，图中A显示大脑皮质神经元分层排列、B显示大脑皮质锥体细胞层、C假手术组锥体神经元、D模型组锥，神经元、E梓醇中剂量治疗组锥体神经元、F胞磷胆碱治疗对照组锥体神经元；图2脑缺血15天后健侧感觉运动皮质区注入神经示踪剂前后大鼠的姿势反射；图中A注入神经示踪剂BDA之前，右侧大脑中动脉缺血所致的左侧前肢瘫痪巳部分恢复(可以伸直)；B健侧(左)感觉运动皮质区注入神经示踪剂后3h，先前受累前肢(左)再度出现屈曲抱胸体征。图3脑缺血后健侧感觉运动皮质与其他脑区的纤维投射；图中A假手术组，B模型组，C梓醇中剂量组，D胞磷胆碱组图4缺血侧大脑皮质芽生轴突及其与健侧感觉运动皮质的联系，图中左为假手术组，右为模型组；图5DA和GAP-43免疫荧光双标脊髓颈膨大区皮质脊髓束轴突芽生，图中左为梓醇组，右为胞磷胆碱组；图6实验组缺血灶周边残存大脑皮质神经元突触超微结构变化，图中A:假手术组，B:模型组，C:中剂量梓醇治疗组，D:胞磷胆碱治疗对照组。具体实施例用以下的实施例对本发明作具体说明，但本发明并不局限于所列举的实施例包含内容。本发明的实验动物，购自重庆医科大学实验动物中心(合格证号检动字2002A040)。实例1、梓醇及其衍生物诱导大鼠大脑皮质神经元轴突生长的离体实验无菌条件下取出生后24h内的乳鼠大脑皮质，剪去胼胝体和其他白质，D-Hank液清洗两遍，0.2X胰酶溶液37。C消化5min，制备细胞悬液，以lXl(f细胞密度接种于两块96孔板内，每孔种100"1。在37。C、5%的0)2培养箱中培养，培养基为DF12，血清浓度为15%。培养24h后全量换成NeurobasalA神经元专用培养基(含2XB27)，选择性培养神经元，以后每3天半量换液1次。皮层神经元培养第6天后进行神经元鉴定，并分组开始作相应药物干预，继续培养48h后行指标检测。实验分为空白对照组、梓醇及其衍生物干预组和胞磷胆碱组。空白对照组不用任何药物进行干预；梓醇及其衍生物干预组分设终浓度为O.25、0.5、1.0、2.5、5.0mg/ml五个亚组，梓醇及其衍生物用NeurobasalA神经元专用培养液配制；胞磷胆碱组为本实验阳性药物对照组，其终浓度为lmg/ml。每组重复3次。各实验组药物干预48h后，1000rmin'离心2min，弃原培养液，每孔加入无血清培养液及20riMTT,继续培养4h。1000rmirT离心2min，弃原液，每孔加入二甲亚砜(DMSO)200W，震荡5min，选择570nm波长，用全自动酶标仪(BioRad550型)检测各孔吸光值(A值)。神经元种植后定时在倒置相差显微镜下观察其生长情况。药物千预48h后，HE染色，400倍镜下测量神经元轴突起始部至生长锥末端的距离，计为神经元轴突长度。每组各孔随机选择5个视野，共测量100个神经元轴突长度，所测细胞必须有晕光和突起，取其平均值作为该组的实验结果。本实验中测量目尺1个刻度二25X10/98Mm。表1-1.不同药物干预对神经元生存活性及轴突长度的影响(无±s)吸光度A值组另lj(570nm)轴突平均长度(um)空白对照组0.463±0.04272.779±21.404胞磷胆碱组0.464±0.12872.562±15.783梓醇及其衍生物各浓度治疗组0.25mg/ml亚組.0.357±0.10058.107±12.548"0.5mg/ml亚组0.338±0.12678.231±16.7571.0mg/ml亚组0.351±0.06998.098±38.356"2.5mg/ml亚组0.358±0.132132.885土40.982""5.0mg/ml亚组0.325±0,195106.122±40.087*"注梓醇及其衍生物各浓度治疗组吸光度A值分别与空白对照组和胞磷胆碱组相比较，均pX).05;梓醇及其衍生物各浓度治疗组轴突平均长度与空白对照组比较*尸<0.05,**尸<0.01:与胞磷胆碱组比较▲/<().05,"尸<0.01。从表中可以分析得出梓醇及其衍生物能明显促进皮质神经元轴突生长，但对其生存活性无显著影响。实例2、梓醇及其衍生物促脑缺血大鼠神经修复的行为学评价实验一、制备局灶脑缺血模型，造模后6h开始腹腔注射不同剂量梓醇及其衍生物进行干预，采用神经行为学评定方法观察造模后不同时点各组大鼠神经功能恢复状况，初步明确梓醇及其衍生物对脑缺血大鼠神经功能恢复有无积极作用。同时，设置一组造模后24h首次给予梓醇及其衍生物中剂量治疗组，初步了解大鼠脑缺血后延迟给予梓醇及其衍生物治疗是否有效，探讨梓醇及其衍生物的有效给药时间窗。实验分为8组，即假手术组，模型组，生理盐水组，造模后6h给药梓醇及其衍生物低、中、高剂量(分别为l、5、10mg/kg体重)治疗组，造模后24h给药梓醇及其衍生物中剂量治疗组和胞磷胆碱治疗对照组。每组6只。实验二、采用高效液相色谱(HPLC)法检测正常大鼠尾静脉一次性注射中剂量梓醇及其衍生物后脑脊液中是否含有梓醇及其衍生物，初步明确梓醇及其衍生物能否透过血脑屏障。重复3次。Bederson评分粗略反映各组脑缺血大鼠神经功能恢复状况，可见术后第15天和第21天，术后6h给药梓醇及其衍生物高、中剂量组和术后24h给药梓醇及其衍生物中剂量组大部分鼠已恢复到假手术组的功能状态，比其他实验组恢复更好，且差异具有显著性(y^c:0.05)。提示梓醇及其衍生物可促进脑缺血大鼠神经功能恢复，且延迟至脑缺血后24h给药仍然有效。肌力评定除假手术组外，各组术后第24小时，肌力低下程度与首次给药前相同，组间无明显差异(/^>0.05)，各组与假手术组比较差异有显著性(尸<0.05)。术后第4天，各组(假手术组除外)肌力开始恢复，7天时肌力已明显改善(,<0.05)，尤其是梓醇及其衍生物各剂量治疗组和胞磷胆碱组改善更明显，与模型组和生理盐水组比较差异具有显著性(尸<0.05)。术后第15天和第21天时，术后6h给药梓醇及其衍生物各剂量治疗组、术后24h给药梓醇及其衍生物中剂量治疗组和胞磷胆碱组肌力已恢复正常，而模型组和生理盐水组仍未完全恢复正常，提示梓醇及其衍生物可促进脑缺血大鼠瘫痪肢体肌力恢复，且脑缺血后延迟用药仍有效。平衡木试验反映脑缺血大鼠感觉运动整合能力和运动协调功能的恢复状况。可见术后15d和21d时，术后6h开始给药的梓醇及其衍生物高、中剂量组和术后24h开始给药的梓醇及其衍生物中剂量组得分明显低于其他各实验组(尸<0.05)，但均未恢复至假手术组水平。提示梓醇及其衍生物对脑缺血大鼠运动平衡功能的恢复有促进作用，且延迟给药也有效。食物抓取试验反映脑缺血大鼠受累肢体精细感觉和运动功能恢复状况。各实验组大鼠术前测定左前肢食物抓取成功率基线为65.7%±4.8%68.0%±3.6%，组间无明显差异(/〉0.05)。假手术组术后l、4、7、15和21d左前肢食物抓取成功率维持在基线水平，波动在65.0%±5.1%70.2%±5.3%之间。模型组、生理盐水组、梓醇及其衍生物治疗组和胞磷胆碱组术后第1天，大鼠抓取成功率明显下降，各组抓取成功率降为1.5%±1.2%2.5%±1.9%，组间差异无显著性(/〉0.05)。术后第4天，各组左前肢抓取功能开始恢复，抓取成功率上升至11.55%±2.5%13.8%士2.2%,但组间无明显差异(&0.05)。术后第7天，各实验组大鼠受累前肢抓取成功率明显增加，其中，模型组为15.7%±4.1%,梓醇及其衍生物低、中、高治疗组分别为17.7%±3.6%、30.3%±7.1%、29.2%±7.1%，梓醇及其衍生物中、高剂量治疗组与模型组差异具有显著性(尸<0.05)。术后第15天，各组大鼠左前肢抓取功能仍在恢复，梓醇及其衍生物高、中剂量组明显比其他实验组恢复好，差异具有显著性(尸<0.05)。术后21天，模型组受累前肢抓取成功率恢复至25.8%±4.1%(约相当于基线值38%)，梓醇及其衍生物中、高剂量治疗组抓取成功率分别为48.7%±5.4%(约相当于基线值72%)和47.3%±4.8%(约相当于基线值70%)，与模型组差异具有显著性(尸<0.05)。提示梓醇及其衍生物对脑缺血后感觉运动功能恢复有促进作用。术后24h开始给予梓醇及其衍生物治疗组，观察至术后21天，发现术后7d、15d和21d受累前肢抓取功能均比模型组对应时点恢复更好(P<0.05)，并与术后6h开始给予梓醇及其衍生物治疗组对应时点无显著性差异(/〉0.05)。提示脑缺血后延迟给予梓醇及其衍生物治疗仍对大鼠功能恢复有促进作用。采用HPLC法检测给药后40min的大鼠脑脊液，分析发现在相同保留时间处出现了梓醇及其衍生物的紫外吸收峰，说明给药后的大鼠脑脊液中含有梓醇及其衍生物，梓醇及其衍生物可以分布到脑脊液中。上述实验提示梓醇及其衍生物可促进脑缺血大鼠肢体功能恢复，中剂量(5mg/kg体重)效佳；脑缺血后24h梓醇及其衍生物延迟给药仍然有效；梓醇及其衍生物可以分布到脑脊液中。实例3、梓醇及其衍生物对大鼠脑缺血后神经元轴突树突生长的影响实验一、采用免疫荧光组织化学技术和WesternBlot分析方法检测各实验组大鼠局灶脑缺血后缺血周围区和健侧运动皮质区轴突再生标志物GAP-43蛋白表达变化，初步明确梓醇及其衍生物对大鼠局灶脑缺血后轴突再生的影响。实验分为7组，即假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇及其衍生物高、中、低剂量治疗组，胞磷胆碱治疗对照组。每组6只。实验二、采用神经示踪技术显示大鼠局灶脑缺血后缺血周围区和脊髓颈膨大(C4-C6)区轴突芽生状况，观察梓醇及其衍生物对脑缺血后轴突芽生的干预作用。实验分为5组，即假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇及其衍生物中剂量治疗组和胞磷胆碱治疗对照组。每组3只。实验三、采用神经示踪技术结合免疫荧光双标染色进一步显示各实验组大鼠局灶脑缺血后健存神经元轴突再生现象，观察梓醇及其衍生物对大鼠局灶脑缺血后神经元轴突再生的影响。实验分为5组，即假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇及其衍生物中剂量治疗组和胞磷胆碱治疗对照组。每组3只。实验四、采用Golgi-Cox染色显示各实验组大鼠局灶脑缺血后健存神经元树突分支和树突棘密度变化，观察梓醇及其衍生物对其影响，初步明确梓醇及其衍生物对大鼠局灶脑缺血后神经元树突可塑性的可能作用。实验分为5组，即假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇及其衍生物中剂量治疗组和胞磷胆碱治疗对照组。每组3只。实验五、采用免疫组织化学技术和WesternBlot分析方法检测各实验组大鼠局灶脑缺血后缺血周围区和健侧运动皮质区勿动蛋白-A(NogoA)及其受体NogoR(NgR)蛋白表达变化，观察梓醇及其衍生物对其影响，初步了解梓醇及其衍生物影响大鼠局灶脑缺血后神经元突起可塑性变化的可能机制。实验分为7组，即假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇及其衍生物低、中、高剂量治疗组，胞磷胆碱治疗对照组。每组6只。梓醇及其衍生物低、中、高剂量治疗组给药剂量分别为1、5、10mg/kg体重，胞磷胆碱组给药剂量为0.5g/kg体重。梓醇及其衍生物和胞磷胆碱均用生理盐水配制，每次给药总体积为3ml。生理盐水组经腹腔注射等体积生理盐水。假手术组和模型组不给任何药物干预。药物干预组均于术后24h首次经腹腔注射给药，以后每天1次，连续7d。表3-1.各实验组缺血周围区大脑皮质GAP-43蛋白表达(5±5",/f3)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>与假手术组比，Ap<0.05;与模型组比，Ap<0.05;与生理盐水组比，*p<0.05;与胞磷胆碱组比，^<0.05。表3_2.梓醇对神经元树突分支和树突棘密度的影响(^士S,/2=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3-3.各实验组脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束越边纤维相对量(％,无土^S^g)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3-5各实验组缺血灶对侧大脑皮质NgR蛋白表达_1^±&n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>梓醇高剂量组_136.33±5.25，_0.07±0.02，_^!手术组比，A。<0.05;与模型组比，A。<0.05,与生理盐水组比，、<0.05;与胞磷胆碱组比，^。<0.05。实验结果提示梓醇及其衍生物可促进脑缺血灶周围皮质神经元轴突芽生；梓醇及其衍生物可促进脑缺血灶周围皮质神经元树突分叉和树突棘密度增加；梓醇及其衍生物可促进脑缺血后健侧皮质脊髓束发芽并越边支配脊髓失神经支配区；梓醇及其衍生物可下调局灶脑缺血后脑内Nogo-A和NgR蛋白表达。实例4、梓醇及其衍生物对大鼠脑缺血后突触重构的诱导作用实验一、采用免疫荧光组化染色(单标)和Westernblot分析方法检测大鼠局灶脑缺血后缺血灶周围残存大脑皮质内突触标志物突触素(P38)蛋白表达变化，从光镜形态和蛋白质水平观察梓醇及其衍生物对大鼠局灶脑缺血后突触分子标志的影响，初步明确梓醇及其衍生物对脑缺血后突触重构的作用。实验分为7组，即假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇及其衍生物低、中、高剂量治疗组，胞磷胆碱治疗对照组。每组6只。实验二、采用免疫荧光双标技术观察各实验组大鼠局灶脑缺血后缺血灶周囤残存人脑皮质内新生轴突形成突触连接的变化，进一步了解梓醇及其衍生物是否能够促进脑缺血后有效轴突芽生，即芽生轴突是否能够形成突触。实验分为7组，即假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇及其衍生物低、中、高剂量治疗组和胞磷胆碱治疗对照组。每组6只。实验三、采用投射电镜结合体视学方法观察各实验组大鼠局灶脑缺血后缺血灶周围残存大脑皮质内神经元突触数目的变化，进一步从超微结构水平了解梓醇及其衍生物是否能促进大鼠局灶脑缺血后有效轴突芽生。实验分为5组，即假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇及其衍生物中剂量治疗组和胞磷胆碱治疗对照组。每组3只。实验四、采用免疫炎光组织化学技术和Westernblot分析方法检测各实验组大鼠局灶脑缺血后缺血灶周围残存脑组织内脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体TrkB蛋白表达的变化，初步探讨梓醇及其衍生物影响大鼠局灶脑缺血后突触重构的可能机制。实验分为7组，即假手术组，模型组，生理盐水组，梓醇及其衍生物低、中、高剂量治疗组和胞磷胆碱治疗对照组。每组6只。梓醇及其衍生物高、中、低剂量分别为IO、5、lmg/kg体重，胞磷胆碱钠剂量为0.5g/kg体重，上述药物均用生理盐水配制，终体积为3ml。生理盐水组给予等体积生理盐水。术后1天开始腹腔注射给药，每日1次，连续7天。假手术组和模型组不给任何干预。表4-1.各实验组大鼠健側和缺血侧大脑皮质突触数目比较(5士S,n=3)组别突触数目(个/40000倍视野)健侧感觉运动皮质缺血灶周围残存皮质假手术组11.50±1.3812.83±1.47模型组11.17±2.326.17±2.40A生理盐水组12.50±1.876.67±2.07^胞磷胆碱组15.67±2.66AA10.33±3.27A梓醇中剂量组17.33士1.21"11.33±2.88A与假手术组比，<0.05;与模型组比,<0.05;与生理盐水组比，><0.05;与胞磷胆碱组比,°/7<0.05.表4-2.各实验组缺血灶周围大脑皮质P38和GAP-43共定位相关参数比较(5±S，n=3)组别绿色荧光强度系数红色荧光强度系数Pearson相关系数假手术组1.04±0.110.60±0.020.14±0.02模型组L19士0.10※0.66±0.090.27土0.04※生理盐水组1.14±0.18《0.68±0.030.32±0.03《胞磷胆碱组1.01±0.090.85士0.07※a0.48士0.01※a梓醇低剂量组1.31士0.03※"0.83±0.03"^0.50土0.04※a梓醇中剂量组1.38土0.10※"0.92土0.06※"0.63±0.03《A*梓醇高剂量组1.53士0.19※"0.80±0.10《A0.72土0.06※"注与假手术组比较，※P〈0.05;与模型组比较，<0.05;与胞磷胆碱组比较,*/7<0.05.表4-3.各实验组缺血灶周围大脑皮质TrkB蛋白表达二丄5±S，n=3)组另ljTrkB阳性细胞数(个/400倍视野)TrkB蛋白相对表达量(TrkB/e-actin校正OD值)假手术组122.30±3.780.59±0.01模型组104.17±8.250.67±0.07生理盐水组107.67±14.150.84±0.22胞磷胆碱组106.33±7.371.39±0.39AA梓醇低剂量组142.83±6.17AA1.29±0.06AA梓醇中剂量组174.67±8.33AA1.85±0.47"*0梓醇高剂量组146.00士4.82"1.92±0.37"*0与假手术组比，Ap<0.05;与模型组比，'\p<0.05;与生理盐水组比，、<0.05;与胞磷胆碱组比，p<0,05。实验结果提示梓醇及其衍生物可有效减轻脑缺血后神经元及突触超微结构损伤，增加突触数目；上调突触素蛋白表达，促进脑缺血后芽生轴突形成新的突触连接；上调脑缺血后脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体TrkB蛋白表达，促进神经元有效轴突芽生。权利要求1、一种新型的预防治疗脑血管疾病的化合物。其特征是梓醇和其衍生物，即为所示化合物I其中化合物R1为H、OH或者OR4(R4为C1～C5酰基，C1～C5的烷基或糖苷基)，R2为H、OH或OR5(R5为C1～C5酰基，C1～C5的烷基)，R3为OH或者OR6(R6为酰基)；在I式中若R1为OH，R2为OH，R3为OH，则该结构式所确定的化合物是梓醇；若R1为，R2为OH，R3为OH，则该结构式所确定的化合物是梓苷；若R1为OH，R2为，R3为OH，则该结构式所确定的化合物是胡黄连苦苷；若R1为OH，R2为OH，R3为，则该结构式所确定的化合物是胡黄连苷；若R1为R2为OH，R3为OH，则该结构式所确定的化合物是黄金树苷；若R1为OH，R2为R3为OH，则该结构式所确定的化合物是Scutellarioside-II；2、权利要求1所述化合物I梓醇及其衍生物在制备防治脑血管疾病药物中的应用。全文摘要本发明涉及梓醇及其衍生物在制备脑血管疾病防治药物中的医药用途。梓醇及其衍生物能够通过血脑屏障，有耐缺氧作用提高脑组织缺血缺氧的耐受能力，促进神经元轴突和树突生长、增强突触重构，促进脑缺血后受累肢体神经功能恢复，可以与在药理学上可接受的赋型剂配制成不同的剂型防治脑血管疾病。梓醇及其衍生物可以与其它促神经修复药物和脑可塑性药物以不同的比例配成具有上述治疗和预防作用的组合物，并配制成药理学上可接受的不同剂型。文档编号C07H17/04GK101250205SQ200810069458公开日2008年8月27日申请日期2008年3月12日优先权日2008年3月12日发明者东万,胡子成,鹏谢申请人:谢鹏;万东