专利名称：一种猪圆环病毒2型的乳胶凝集检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家畜类免疫学技术领域，涉及免疫学和免疫化学等相关领域。具体的讲本发明涉及一种猪圆环病毒2型乳胶凝集检测方法及应用。
背景技术：
猪圆环病毒病是一种近年来倍受关注的在世界各地广泛流行的疾病，是由猪圆环病毒2型引起的一系列疾病的总称。自1974年Tischer等首次发现猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)以来，随着对PCV研究的深入，根据PCV的致病性及其基因组差异又可将其分为无致病性的猪圆环病毒1型(PCVl)和有致病性的猪圆环病毒2型(PCM)。PCVl对猪无致病性，但能产生血清抗体，在猪群中普遍存在。PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪间质性肺炎、猪皮炎肾病综合征以及母猪繁殖障碍等症状。PCV2可导致母猪返情率增高，流产，产死胎、木乃伊胎和弱子等，所产仔猪断奶前死亡率上升。公猪感染PCV2后，可通过交配传染给与配母猪，从而导致其繁殖障碍。除此之外，PCV2可致使感染猪的免疫力大大降低，从而为其他病毒或病菌的入侵创造了条件。如PCV与蓝耳病病毒协同作用，使猪继发感染金色葡萄球菌、链球菌时，从而使病猪出现体温升高、充血性皮疹、呕吐、腹泻、呼吸困难等症状。PCV2对猪业的发展造成了重大的经济损失，因此，研究PCV2的检测方法对于这些疾病的早期诊断、控制、预防、治疗及减少经济损失均具有重大的理论和实际意义。猪群中普遍存在着PCV抗体，单一的抗体阳性不能确诊为阳性，确诊必须依靠实验室方法检测出PCV2抗原或核酸。由于病毒复制困难，所以检测和防控研究非常困难。同时，该病易与一些病毒性和细菌性疾病混合或继发感染，因此仅凭症状、病变及流行病学调查很难做出准确判断。为此，国内外兽医工作者以及科学家进行了大量的研究，建立了多种高度特异性的病毒学、免疫学和分子生物学诊断方法，但迄今为止，尽管有多种检测PCV的方法，但各种方法都有其局限性，检测结果及其判定经常受多种因素的影响。如病毒分离技术，由于病毒在培养细胞上不出现细胞病变，通常在病料接种后3天才会出现结果；通过免疫组织化学染色法(IHC)、聚合酶链式反应(PCR)或电子显微镜观察，确认病毒分离情况，病毒分离费时费力，不适于疾病检测的；免疫组化法(IHC)，操作比较烦琐，时间较长，且必须在实验过程中除去内源过氧化物酶对反应的干扰；原位杂交(ISH)，敏感性高，可以精确定位 PCV病毒DNA在细胞中的部位，为进一步深入研究PCV的致病机理提供了帮助，但缺点是费时费力，非特异性比较强；间接免疫荧光实验(IFA)，该方法在PCV的抗体检测中应用广泛， 国外已有标准化试剂盒问世通过检测猪血清中的病毒抗体，确定PCV感染情况，但此方法不能有效区分抗体是针对PCVl还是PCV2 ；免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)，该方法不能区分PCV两种血清型，应用较为局限，国内很少使用该方法；酶联免疫吸附实验(ELISA)、 抗原捕获ELISA等虽然最近很受吸引，在某些方面有些优势，但仍然有关于仪器、费用等方面的原因不能普遍使用。此外还用许多方法也由于存在一些缺陷而还不能造福于世界以及我国的猪业的发展。所以现在急需一种灵敏、快速、低成本、对猪本身没有副作用，而且还能得到有效普及的检测方法。乳胶凝集试验(LAT)由于其快速、简单和无需专门的技能和任何仪器设备而具有巨大优势。从上个世纪中叶聚苯乙烯乳胶颗粒开始做凝集试验的材料以来，由于其具有的独特优点，如操作简便，不需要特殊仪器，肉眼判断，也不需要对操作过程进行培训；时间短，一般在2分钟内可以出结果；价格低廉，检测单份血清样品比其它血清学、病原学方法便宜的多；适用于现场检测等，在临床检验中得到了广泛的应用。传统的乳胶凝集试验是以惰性聚苯乙烯乳胶颗粒作载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到相应的抗体和抗原成分时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。在利用乳胶凝集技术建立病原学检测方法时，一般是将特异性抗体致敏到乳胶颗粒表面，普通聚苯乙烯乳胶和抗体的结合是无选择性的物理静电吸附，由于抗体的分子量小，很难结合到乳胶表面，即使致敏上的抗体也容易从乳胶颗粒上脱落或者变性失活，导致致敏好的乳胶试剂保存期短，难以适合产品开发的需要。为此，本申请人以带有磺酸基的三元聚合物乳胶颗粒为载体，将抗体偶联到乳胶表面。本发明的方法克服了普通乳胶致敏抗体时，致敏量少，不稳定，抗体容易脱落等缺点，提高了抗体的结合效率，而且致敏上的抗体不容易从乳胶上脱落，进而提高乳胶的敏感性和保质期，适合了产品开发和大规模生产的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种快速检测猪圆环病毒2型的乳胶凝集方法及应用。本发明通过以下技术方案实现的(总体技术路线图见图1所示)申请人:用猪圆环病毒2型WH株，免疫小鼠得到免疫血清，从该免疫血清中提取单克隆抗体(承载单克隆抗体的杂交瘤细胞株PCV2/3E5，于2010年4月四日保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO :C201043)， 用该单克隆抗体制敏乳胶得到乳胶诊断试剂，并以该乳胶诊断试剂为核心试剂建立了一种用于快速检测猪圆环病毒2型的乳胶凝集方法。本发明提供了一种猪圆环病毒2型的快速乳胶凝集检测方法，它包括制备乳胶溶液、乳胶诊断试剂、阳性对照样品、阴性对照样品，其特征在于，它是由下列步骤制备的A、用猪圆环病毒2型免疫小鼠得到免疫血清，从该免疫血清中提取并得到保藏号为CCTCC-C201043的单克隆抗体，用该单克隆抗体制敏乳胶得到所述的乳胶诊断试剂；和B、乳胶溶液的制备由下列步骤获得1)取14. ImL苯乙烯、0. 78mL甲基丙烯酸甲酯和IOOmL去离子水于250mL三口烧瓶中，混合搅拌，通氮气保护；2)待瓶中液体温度升至70°C时，将混合液A快速加入瓶中于70°C下聚合2-4小时后，加入混合液B，再聚合4-6小时，得到均一乳胶；3)取ImL的乳胶在lOOOOr/min的条件下离心，去掉上清液；在沉淀中加pH为7. 4 的磷酸缓冲液lmL，得到均勻的乳胶溶液；其中步骤幻所述的磷酸缓冲液组分为氯化钠8g，磷酸氢二钾0. 2g，磷酸氢二钠 1. 15g,氯化钾0. 2g，补充去离子水至lOOOmL，pH7. 4 ；
步骤幻所述的混合液A组分为碳酸氢铵0.506g，甲基丙烯酸丙基磺酸钾 0. 1-0. 4g，硫代硫酸铵0. 73g，加去离子水IOmL ；步骤2)混合液B组分为苯乙烯2. 81mL,甲基丙烯酸甲酯0. 6mL甲基丙烯酸丙基
磺酸钾0. 5g，碳酸氢铵0. lg，加去离子水IOmL ；所述的阳性样品为灭活的猪圆环病毒2型WH，所述的阴性样品为不含猪圆环病毒 2型的猪血清。本发明应用的具体步骤是1)在上述所得的乳胶溶液中加入10μ 1保藏号为CCTCC-C201043的的杂交瘤细胞株PCV2/3E5所分泌单克隆抗体，将该乳胶-单克隆抗体混合溶液稀释2倍体积，置于25°C 恒温箱中放置70min，得到乳胶诊断试剂，备用；2)将收集得到的猪血液于37°C存放1小时，于5000r/min离心，得到待检的猪血清；3)于干净的载玻片上分别滴加10μ 1待检的猪血清、阳性样品和阴性样品，再向所述的猪血清、阳性样品、阴性样品中滴加10μ 1所述的乳胶诊断试剂，搅拌均勻，摇动30 秒后观察结果。4)结果判定30秒内出现如下结果，试验方可成立阳性对照与乳胶抗体复合物作用出现明显均勻一致的凝集，阴性对照与乳胶诊断试剂不凝集，待检血清30秒内出现均勻一致的凝集判定为阳性，呈现原有均勻乳状判定为阴性。该方法能直接对样本中的猪圆环病毒2型进行检测。若样本中含有猪圆环病毒2 型，则乳胶试剂在30秒内出现明显均勻一致的凝集，判为阳性结果；若样本中不含有猪圆环病毒2型，则乳胶试剂在30秒内液滴仍然呈原有的均勻乳状，判为阴性结果。与现有技术相比，本发明具有如下优点直接对猪圆环病毒2型进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(Imin之内出结果)的特点；2.本发明的检测方法不需要任何特殊的仪器、设备，有利于推广和普及，且具有检测成本低的特点。
图1 是本发明的总体技术路线图。图2:是本发明分离、鉴定的猪圆环病毒2型负染病毒粒子的电镜照片 (X 100，000)。图3 是阴性、阳性对照样品检测结果照片。
具体实施例方式实施例1单克隆抗体及乳胶溶液的制备1单克隆抗体的制备1)抗原制备用含50 μ g/ml氨苄青霉素(简称Amp)的LB固体平板复苏的含猪圆环病毒2型开放阅读框2(PCV2-0RF2)基因的重组沙门氏菌(陈冬焕，表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定[D].华中农业大学.2009,http://epub. cnki. net/grid2008/ detail, aspx ？ QueryID = 4&CurRec = 1)挑取单菌落接种于 5mL 含 50 μ g/ml Amp 抗生素的LB培养基中，于37下振荡培养约12h。将菌液按体积比为1 100稀释接种于新鲜的含50 μ g/ml Amp抗生素的LB培养基中，于30°C下低温培养至0D600达到0. 5-2. 0时， 加入终浓度为2mmol/L异丙基-0-0-硫代半乳糖苷，301低温诱导^1 ；4°C 8000r/min离心lOmin，收集菌体并置于冰上，按每毫升培养基50 μ L的量加入1 X磷酸缓冲液(其成分为氯化钠8g、磷酸氢二钾0. 2g、磷酸氢二钠1. 15g、氯化钾0. 2g，加去离子水lOOOmL，即为磷酸缓冲液，PH为7. 4)重悬菌体，用超声波破碎(工作频率18KHz) ；4°C 12000r/min离心lOmin，弃沉淀，用可溶性蛋白用50%浓度的谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化。按IOOmL超声波破碎裂解液中加入2mL50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶悬液的量加入该悬液，室温下轻轻摇动 30min,使胱甘肽S转移酶标签融合蛋白充分结合到谷胱甘肽琼脂糖凝胶上；于500 X g下离心5min，弃上清；按10X琼脂糖凝胶体积的量加入1 XPBS缓冲液洗涤凝胶，于500X g下离心5min，弃上清，并重复该洗涤过程3-4次，以去除与谷胱甘肽琼脂糖凝胶非特异性结合的杂蛋白；按每毫升凝胶体积加入ImL的量加入洗脱液(配方0. 154g还原性谷胱甘肽溶解于50mL 50mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中即为洗脱液)洗脱，轻轻混勻，使凝胶重悬，于室温下作用lOmin，使融合蛋白从谷胱甘肽琼脂糖凝胶上洗脱下来，再于500 X g下离心5min， 收集上清。重复上述洗脱过程2次以上，使融合蛋白充分洗脱下来，并通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的洗脱情况及纯度。2)小鼠免疫将步骤1)得到的纯化蛋白用磷酸缓冲液稀释到300 μ g/mL,与弗氏完全佐剂等体积混勻乳化，选择6周龄雌性BALB/c小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心)5只，颈背部皮下多点注射0. 2mL。第14d时加强免疫1次(佐剂改用弗氏不完全佐剂，免疫剂量和部位同首次免疫)。在第24d时尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法(华中农业大学硕士研究生论文，陈冬焕，表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定[D].华中农业大学.2009)检测抗体水平，在第42d时对免疫效果最好的BALB/c小鼠用不加佐剂的抗原 0. 2mL尾静脉注射加强免疫一次，3d后即可融合。3)细胞融合(1)将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以体积比为1 10比例在50mL离心管中混勻，1500r/min 离心 IOmin0(2)倒空上清，用灭菌的滤纸吸干，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略有松动。(3)将装有细胞混合物的离心管放于37°C水浴中。然后在Imin内慢慢滴入37°C 预温的最后聚乙二醇40000. 8mL，边加边轻轻搅拌。(4)继续搅拌30秒后静置lmin。然后慢慢加入37°C预温的IOmL 1640基础培养基(购自于美国GBICO公司)。具体方法为第1分钟和第2分钟各加lmL，第3-^iin加 3mL，第5分钟加其余的5mL，每次需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。(5)在 1000r/min 离心 5min，弃去上清。(6)加入30mL 1640基础培养基重悬细胞沉淀，于1000r/min离心5min，弃去上清。
(7)用IOmL HAT培养基(购自美国GBICO公司。)悬浮融合后的细胞，同时用90mL HAT培养基悬浮饲养脾细胞，将二者混合均勻后，滴加于96孔细胞培养板中，约250 μ L/孔。 置于37°C，5% C02培养箱中培养。(8)融合后于第3d补加1滴HAT培养基，第5d时吸去96孔板100 μ L培养基换 HT培养基100 μ L。待融合细胞集落长至培养孔1/4时，即可进行抗体检测。4)单克隆抗体生产取8周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0. 5mL/只，7d后腹腔注射杂交瘤细胞(杂交瘤细胞株PCV2/3E5，保藏编号为CCTCC NO :C201043) 5 X 105_5 X IO6/只，7_10d 后采集小鼠腹水，于1200r/min离心IOmin取上清，冻存备用。5)腹水中单克隆抗体的纯化采用腹水用辛酸-硫酸铵法纯化。具体步骤如下(1)将步骤4)所得的小鼠腹水和细胞1200r/min离心lOmin，取上清于 40C 12000r/min 离心 30min，弃去杂质。(2)向步骤(1)的每毫升腹水中加入2倍体积O. 06mol/L(pH 5. 0)的乙酸溶液。(3)然后逐渐滴加入辛酸(每毫升腹水加33 μ L)，室温搅拌30min，12000r/min离心30min，弃沉淀。(4)上清经滤纸过滤后调pH至7. 4。(5)在4°C冰浴下缓慢加入pH为7. 4的饱和硫酸铵，使硫酸铵最终饱和度50%，搅拌 30min，4°C 过夜。(6)4°C下 12000r/min 离心 20min，弃去上清。(7)沉淀用0. Olmol/L的PBS缓冲液(pH 7. 4)重悬，在pH为7. 4的PBS缓冲液中透析3d，冻存备用。2乳胶溶液的制备1)取14. Iml苯乙烯、0. 78ml甲基丙烯酸甲酯、IOOml去离子水于250ml三口烧瓶
中，混合搅拌，通氮气保护。2)待瓶中液体温度升至70°C时，将混合液A (含如下成分碳酸氢铵0. 506g,甲基丙烯酸丙基磺酸钾0. 1-0. 4g，硫代硫酸铵0. 73g，加去离子水10ml，混合该成分即为混合液 A)，快速加入瓶中与70°C下聚合2-4小时后，再加入混合液B (含如下成分苯乙烯2. 81ml, 甲基丙烯酸甲酯0. 6ml甲基丙烯酸丙基磺酸钾0. 5g，碳酸氢铵0. lg，加去离子水10ml，即为混合液B)，再聚合4-6小时，得到均一乳胶。3)取Iml步骤2)的乳胶在lOOOOr/min的条件下离心，去掉上清液；在沉淀中加 PH = 7. 4的磷酸缓冲液Iml (其成分为氯化钠Sg、磷酸氢二钾0. 2g、磷酸氢二钠1. 15g、氯化钾0. 2g，加去离子水至IOOOmL,即为磷酸缓冲液)，得到均勻的乳胶溶液。在上述乳胶溶液中加入10 μ 1保藏号为CCTCC-C201043的杂交瘤细胞株PCV2/3E5 所分泌的单克隆抗体，并将该乳胶-单克隆抗体混合溶液稀释2倍体积，置于25°C恒温箱中放置70min，即为本发明的乳胶诊断试剂。实施例2猪圆环病毒2型乳胶凝集检测方法的建立取稀释好的乳胶溶液，加入实施例1制备好的单克隆抗体，于室温下放置70min， 形成乳胶诊断试剂。
1最佳偶联抗体量的确定在乳胶溶液中，加入10 μ L不同浓度的抗体(倍比稀释1 1，1 2，1 4，1 8)， 置于25°C恒温箱中放置60min。用致敏好的乳胶抗体复合物检测猪圆环病毒2型。经试验验证，在乳胶溶液中加入稀释2倍的抗体，其偶联效率达到最大，检测灵敏度最高。具体结果见表1。表1最佳偶联抗体量的确定
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株PCV2/3E5，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCCNO :C201043。
2.一种由保藏编号为CCTCC-C201043的杂交瘤细胞株分泌的能够专门识别猪圆环病毒2型的单克隆抗体。
3.包含权利要求2所述的单克隆抗体的乳胶诊断试剂，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC-C201043的杂交瘤细胞株分泌的。
4.一种猪圆环病毒2型的乳胶凝集检测方法，包括制备乳胶溶液、乳胶诊断试剂、阳性对照样品、阴性对照样品，其特征在于，它是由下列步骤制备的A、用猪圆环病毒2型免疫小鼠得到免疫血清，从该免疫血清中提取并得到保藏号为 CCTCC-C201043的单克隆抗体，用该单克隆抗体制敏乳胶得到所述的乳胶诊断试剂；和B、乳胶溶液的制备由下列步骤获得1)取14.ImL苯乙烯、0. 78mL甲基丙烯酸甲酯和IOOmL去离子水于250mL三口烧瓶中， 混合搅拌，通氮气保护；2)待瓶中液体温度升至70°C时，将混合液A快速加入瓶中于70°C下聚合2-4小时后， 加入混合液B，再聚合4-6小时，得到均一乳胶；3)取ImL的乳胶在lOOOOr/min的条件下离心，去掉上清液；在沉淀中加pH为7.4的磷酸缓冲液lmL，得到均勻的乳胶溶液；其中步骤幻所述的磷酸缓冲液组分为氯化钠8g，磷酸氢二钾0. 2g，磷酸氢二钠1. 15g，氯化钾0. 2g，补充去离子水至IOOOmL, ρΗ7· 4 ；步骤2)所述的混合液A组分为碳酸氢铵0. 506g,甲基丙烯酸丙基磺酸钾0. 1-0. 4g， 硫代硫酸铵0. 73g，加去离子水IOmL ；步骤2)混合液B组分为苯乙烯2.81mL，甲基丙烯酸甲酯0. 6mL甲基丙烯酸丙基磺酸钾0. 5g，碳酸氢铵0. lg，加去离子水IOmL ；所述的阳性样品为灭活的猪圆环病毒2型WH，所述的阴性样品为不含猪圆环病毒2型的猪血清。
5.权利要求4所述的检测方法的应用，其特征在于，1)在权利要求4所得的乳胶溶液中加入10μ 1保藏号为CCTCC-C201043的杂交瘤细胞株PCV2/3E5所分泌的单克隆抗体，将该乳胶-单克隆抗体混合溶液稀释2倍体积，置于 25°C恒温箱中放置70min，得到乳胶诊断试剂；2)将收集得到的猪血液于37°C存放1小时，于5000r/min离心，得到待检的猪血清；3)于干净的载玻片上分别滴加10μ 1待检的猪血清、权利要求4所述的阳性样品和阴性样品，再向所述的猪血清、阳性样品、阴性样品中滴加10μ 1权利要求4所述的乳胶诊断试剂，搅拌均勻，摇动30秒后观察结果。
6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备猪圆环病毒2型的乳胶凝集检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜免疫检测技术领域，涉及免疫化学技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型的乳胶凝集反应方法及应用。本发明利用三元聚合物乳胶颗粒表面磺酸基的静电吸附作用，将筛选的单克隆抗体偶联到乳胶颗粒表面支撑致敏乳胶作为诊断试剂，建立了一种猪圆环病毒2型的乳胶凝集检测方法。本发明的方法具有样品处理简单、检测速度快、特异性强、灵敏度高、可视化和便于推广等突出优点。本发明制备的单克隆抗体已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC NOC201043)。
文档编号C07K16/18GK102465116SQ20101054449
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者何启盖, 张慧敏, 李文涛, 盛宗海, 韩鹤友 申请人:华中农业大学