专利名称：一种利用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法
技术领域：
本发明涉及人参皂苷制备方法，公开了一种用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷20R-Rg3、20S-Rg3、Rkl和Rg5的方法，属于中医药有效成分提取分离技术领域。
背景技术：
本发明涉及的丙二酰基人参阜苷(Malonyl-ginsenosides)是人参中的天然原苷，又叫丙二酸单酰基人参皂苷，也被称为酸性皂苷，主要包括丙二酰基人参皂苷-Rb1'-Rb2、-Re和-Rd。1983年，Kitagawa等首次报道了从日本产生晒参中分离出4种丙二酰基人参皂苷；周雨等(1998)从西洋参中分离出了丙二酰基人参皂苷Rb1 ;孙光芝等(2007)从国产鲜人参中分离鉴定了 5种丙二酰基人参皂苷(M-Rb1, M-Rb2, M-Rc, M-Rd,M-NR4),其中M-NR4是首次获得的新化合物。Chuang等(1995)报道了不同人参制品中丙二酰基人参皂苷的含量占人参总皂苷含量的35-60%。Kite等(2003)采用液质联用分析了人参、西洋参和三七中丙二酰基人参皂苷，认为丙二酰基人参皂苷各单体成分在这些药材中的比例不同，可以作为化学特征用来区分这些药材。然而由于丙二酰基人参皂苷极易溶于水，不溶于乙醇，难容于正丁醇、氯仿等，在人参皂苷工业化生产中多数随水杂而流失，造成植物资源的巨大浪费。人参皂苷按照苷元的结构不同分为二醇型人参皂苷(PPD)、三醇型人参皂苷(PPT)和齐墩果酸型人参皂苷。pro和PPT型人参皂苷都属于达玛烷型四环三萜类化合物，在人参皂苷中占大多数。稀有人参皂苷，如人参皂苷Rg3、F2、compound K、Rh2、Rh3等，在人参中微量存在或不存在。最新药理学研究表明，这些稀有人参皂苷具有多种生理活性，其中抗癌活性非常显著。目前人参的加工品主要有生晒参、红参和黑参，研究表明在鲜人参和生晒参中有大量的丙二酰基人参皂苷的存在；而红参在加工的过程中需要在95-100°C下蒸煮2-3小时，黑参需要在98°C下蒸煮9次，每次3小时，由于丙二酰基人参皂苷分子中酰基键不稳定，在加热条件下会发生水解反应脱去丙二酰基，生成相应的中性人参皂苷(由丙二酰基人参皂苷-Rb1' -Rb2, -Re、-Rd转化成人参皂苷-Rb1' -Rb2, -Re、_Rd)，所以在红参和黑参中没有丙二酰基人参皂苷。Sun等(2009)报道了采用HPLC-ELSD同时检测生晒参、红参和黑参中19种皂苷的方法，结果显示在红参中仅有少量的稀有皂苷的存在，而黑参由于蒸煮9次，中性皂苷也发生了大量的转化，产生了许多稀有人参皂苷如Rh4、Rg3、Rg5> F4、Rg6, Rk3、Rs3、Rs4等。为了获得更多的人参稀有皂苷的转化率，许多研究采用更高的温度蒸煮人参。Sun等(2011)报道了使用高压锅120°C下蒸煮人参、西洋参和三七4小时，结果这些药材中的中性人参皂苷大部分转化成稀有皂苷，转化途径为二醇型皂苷Rh、Rb2、Re和Rd转化成Rg3, Rg3再转化成Rh2， Rg5和Rkl。三醇型皂苷Rg1' Re、Rf和Rg2转化成Rh1, Rh1再转化成Rk3和Rh4。然而丙二酰基人参皂苷在高温蒸煮下是如何变化的未见文献报道。
发明内容
本发明公开一种从丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷20R-Rg3、20S_Rg3、Rg5和Rkl的方法，可以最大限度的利用丙二酰基人参皂苷，解决了现有制备工艺产品流失大的缺点。本发明的技术解决方案包括以下步骤
将(原皮)鲜人参和西洋参为原料，粉碎，用60-90%的乙醇(投药量于乙醇用量之比为1/10-1/20)在室温下超声提取2-6次，每次20-60分钟，将提取液在40°C条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取3-6次，水层放到高压锅中110-150°C蒸煮10-40分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱Dltll，先用水洗五个柱体积，再用50-90%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg3、20S-Rg3、Rg5和Rkl混合物。本发明产品可以制成片剂、胶囊剂、粉剂或注射剂等药物学上的任何剂型，用于治疗癌症，肿瘤,糖尿病，高血脂症,心肌或脑缺血,机体免疫功能受损，以及消化系统等疾病。本发明的积极效果在于采用新方法对丙二酰基人参皂苷进行了全转化，既M-Rb1, M- Rb2, M-Rc、M-Rd 转化成 20R-Rg3、20S-Rg3、1 &和 Rkl。充分利用了人参资源，最大限度地提取、富集人参稀有皂苷，达到简单、快速、低成本富集的目的，为工业化生产、新药制备提供方法保证。为了进一步说明本发明方法中丙二酰基人参皂苷转化成稀有人参皂苷的途径和转化率，以下采用高效液相色谱法对转化过程和转化产物进行了定量分析实验。1实验材料和试剂
鲜人参采自抚松县，经吉林农业大学中药材学院郑毅男教授鉴定。色谱级乙腈(美国Fisher公司)，其他试剂为分析纯。酸性皂苷标准品M-Rbp M-Rb2, M-Rc和M-Rd (为自制，经IR、MS、NMR鉴定，HPLC测定其纯度在99 %以上)；人参皂苷Rb1, Rb2' Re、Rd、20R-Rg3、20S-Rg3、Rg5和Rkl标准品(中国药品生物制品检验所)。2实验方法
2.1标准品溶液的配置精密称取人参单体皂苷M-RbpM-RlvM-RcHcURbpRlvRc、Rd、20R-Rg3、20S-Rg3、Rg5和Rkl标准品各适量，用30%乙腈定容，得到浓度分别为1. 000mg/mL混和标准品储备液，摇匀，即得，4 °C下低温储藏。2.2待测试样品的制备鲜人参根粉碎，精密称取10 g，用80%乙醇200 mL超声提取3次，每次30 min, 40 1下浓缩提取液至20 mL，然后用正丁醇萃取4次，水层放于高压锅120°C下蒸煮30 min。将蒸煮后的水层浓缩至干,用30%乙腈溶解,定容至100 mL量瓶中，摇匀放置，用前以O. 25 μ m的滤膜过滤，作为供试品溶液。另取一份已知含量的人参中性皂苷(Rh、Rb2、Re、Rd)粉末O. 5g，溶于20 mL蒸馏水中，在同样条件下蒸煮，蒸后取出定容至100 mL量瓶中，摇匀放置，用前以O. 25 μ m的滤膜过滤。2.3色谱条件色谱柱0)51 )511^5(18-]^(250 11111^4.6 111111，5 4 111);流动相乙腈(A)和 O. 05 mol/L 磷酸二氢钾溶液(B);洗脱梯度为0_30 min, 26% (A) ; 30-35 min,26%-32%(A) ; 35-50 min, 32%-50% (A); 50-80 min, 50%_80%(A)。柱温25 °C ;检测波长203 nm ;流速:1· 5 mL/min ;进样量20 μ L ;分析时间80 min。2.4标准曲线的绘制分别吸取上述对照品母液10，20，40，80，160，320，640 μ L，分别置于I mL量瓶中，加30%乙腈稀释至刻度，制备成不同浓度的系列对照品溶液，分别精密吸取系列对照品溶液各20 μ L进样。以色谱峰面积(7)为纵坐标，浓度U)为横坐标。线性回归得标准曲线。3实验结果
结果表明丙二酰基人参皂苷在蒸煮后全部转化成了稀有皂苷20R-Rg3、20S-Rg3、Rg5和Rkl (见附
图1和附图2)，转化率达到了 100%，4种稀有皂苷20R-Rg3、20S-Rg3、Rg5和Rkl的含量明显增加(见表I)。而中性皂苷在蒸煮前后并未发生转化，这与其蒸煮时间较短有关，文献报道中性皂苷在蒸煮4小时后发生转化，说明丙二酰基人参皂苷更加不稳定，转化所需时
表1.丙二酰基人参皂苷提取液蒸煮前后HPLC-UV比较分析结果(％)
权利要求
1.一种利用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，包括以下步骤以鲜人参或西洋参为原料，粉碎，用10-20倍量60-90%的乙醇，在室温下超声提取2-6 次，每次20-60分钟，将提取液在40°C条件下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取3-6次，萃取后的水层放到高压锅中110-150°C下蒸煮10-40分钟，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱Dltll，先用水洗五个柱体积，再用50-90%乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷 20R-Rg3、20S-Rg3、Rg5 和 Rkl。
2.根据权利要求1所述的制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于利用丙二酰基人参皂苷制备的人参稀有皂苷为20R-Rg3、20S-Rg3、Rg5和Rkl。
3.根据权利要求1所述的制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于高压锅蒸煮温度为 120°C，时间为30分钟。
4.根据权利要求1所述的制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于将鲜人参或西洋参粉碎，室温下用80%乙醇超声提取3次，减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取 4次，萃取后的水层放到高压锅中蒸煮。
全文摘要
本发明提供了一种利用丙二酰基人参皂苷制备人参稀有皂苷的方法，将鲜人参粉碎，室温下用乙醇超声提取，减压回收溶剂，浓缩为水溶液，水溶液用正丁醇萃取，萃取后的水层放到高压锅中蒸煮，取出蒸煮过的水层上大孔树脂柱，用乙醇洗脱，回收乙醇后，得到稀有人参皂苷20R-Rg3、20S-Rg3、Rg5和Rk1。此方法最大限度地将丙二酰基人参皂苷转化成药用价值极高的人参稀有皂苷，具有操作简单、快速、成本低廉、转化率高，为人参稀有皂苷工业化生产、新药制备提供方法保证。
文档编号C07J17/00GK103030678SQ201210565188
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者刘志, 孙光芝, 阮长春 申请人:吉林农业大学