一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法与流程

技术特征：
1.一种非诊断目的的结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过生物信息学分析，选择结核分支杆菌的16SrRNA的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQIDNO.5；选择结核分支杆菌的23SrDNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQIDNO.9；（2）应用primerexpress软件和primerpremier5.0软件，设计关于16SrRNA和23SrDNA的引物和探针序列，具体为：16SrRNA引物和探针序列：逆转录引物：SEQIDNO.1；上游引物：SEQIDNO.2；下游引物：SEQIDNO.3；Taqman探针序列：SEQIDNO.4；23SrDNA引物和探针序列：上游引物：SEQIDNO.6；下游引物：SEQIDNO.7；Taqman探针序列：SEQIDNO.8；（3）构建和制备质粒定量标准品利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因SEQIDNO.5和SEQIDNO.9克隆到质粒载体pGEM-TEasyVector中，构建的重组质粒作为检测结核杆菌RNA/DNA同步定量分析的定量标准品；（4）分离样本中结核分枝杆菌，提取总核酸，使提取的样本中同时含有DNA与RNA成分；（5）分别以结核分枝杆菌复合群的16SrRNA和23SrDNA为靶目标，对16SrRNA，使用设计的一条逆转录引物SEQIDNO.1、一对PCR引物SEQIDNO.2和SEQIDNO.3以及一条Taqman探针SEQIDNO.4；对23SrDNA，使用设计的另一对PCR引物SEQIDNO.6和SEQIDNO.7以及另一条Taqman探针SEQIDNO.8，对提取的同一例样本同时进行RT-qPCR，其中，RT部分为单重的只针对16SrRNA的逆转录反应,qPCR部分为两重的针对16SrRNA和23SrDNA的实时定量PCR反应；通过比较16SrRNA和23SrDNA的Ct值以及5个绝对浓度已知的定量内参做出的标准曲线，求得待测标本中结核分枝杆菌DNA的绝对浓度，作为待测标本中结核分枝杆菌DNA定量检测结果；计算分别对应FAM和HEX检测通道的16SrRNA与23SrDNA的Ct值，算出(DNA+RNA)/DNA比值，作为判定标本中结核分枝杆菌生长活性的标准：当该比值大于200时，待测标本中结核分枝杆菌为活跃生长的活菌，当比值在2-200之间，为生长较慢的活菌，比值小于2时，为不生长的死菌。2.一种关于结核分支杆菌23SrDNAPCR反应的引物和探针序列，其特征在于具体为：上游引物：SEQIDNO.6；下游引物：SEQIDNO.7；Taqman探针序列：SEQIDNO.8。