一种人GTPBP9多肽及其抗体制备方法与流程

本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测。

2.

背景技术：

1)GTPBP9功能：GTPBP9是Obg家族GTP水解酶中一种新的NTP水解酶(Koller-Eichhon et al.，J.Biol.Chem.2007 282：19928-19937)。研究显示GTPBP9能够更有效地结合并水解ATP而不是GTP分子。不同种群中的此类蛋白也同时具有ATP和GTP两种水解酶的功能。通过X光晶体结构分析，并用AMPPCP，一种不可水解的ATP分子类似物做为分析底物，人们发现造成这类NTP水解酶核苷酸结合特异性改变的一个原因是所有相关的Obg家族GTP水解酶中的一个疏水氨基酸基团被谷氨酰胺分子所替代，从而造成这些水解酶与ATP分子的结合效率高于同GTP分子的结合。同样的替代也可以使Ras样GTP水解酶失活。GTPBP9分子的中心G区域的两侧分别被一个螺旋线圈结构和一个功能未知的TGS区域(ThrRS，GTPase，SpoT)所包含。根据这些结构特征，人们预测GTPBP9是一种调节蛋白，它与下游的效应蛋白相互作用，并通过它与ADP和ATP结合产生的构象改变行使其调节功能。2)GTPBP9抗体产品信息：经检索，除我公司产品外，市场上没有其他Anti-GTPBP9多克隆抗体。

3)GTPBP9抗体的应用：

一组发表在美国国家科学院杂志上的研究数据显示GTPBP9具有抑制人体细胞抗氧化功能的作用。GTPBP9基因敲出可增加人体细胞对氧化剂，包括叔丁基过氧化氢物(tBH)和二酰胺的抵抗能力，并且不影响细胞的增殖，基础凋亡和对其他细胞毒性因子的敏感性(Zhang et al.，Proc Natl Acad Sci USA.2009 Sep 8；106(36)：15356-61)。相反，过度表达GTPBP9可增加细胞对tBH和二酰胺等氧化物的敏感性。经过过氧化物处理后，GTPBP9基因敲除的人体细胞内聚集的活性氧化物水平物明显低于母细胞内的水平，并且其还原性谷胱甘肽的利用率也显著降低。该研究小组还发现GTPBP9是在非转录水平上产生的对抗氧化功能的抑制作用。GTPBP9基因敲出后人体细胞抗氧化功能增强的结果显示该靶蛋白在不久的将来将成为很有潜力的抗氧化治疗的药 物靶点。

3.

技术实现要素：

本发明提供了一种GTPBP9多肽，其序列为：RAFEDDDITHVEGS。用此多肽制备的抗GTPBP9抗体可以在免疫印迹(Western blot)及免疫组化(IHC)分析中特异识别组织或细胞中的天然GTPBP9蛋白。

抗GTPBP9抗体是通过以下步骤获得的：

步骤一：多肽序列的分析和设计：利用DNAstar软件对GTPBP9蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定GTPBP9蛋白125-138位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为RAFEDDDITHVEGS。

步骤二：多肽合成和交联：采用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；为增强多肽的抗原性，将GTPBP9多肽与载体蛋白KLH采用Sulfo-SMCC交联法进行交联。

步骤三：多肽免疫和抗血清制备：将交联后的GTPBP9-KLH与弗氏佐剂混合乳化，在新西兰兔背部进行皮内注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时停止免疫。

步骤四：抗体纯化：实验兔抗体效价达到标准后，采用心脏取血，分离抗血清，采用Protein A纯化全抗体后，进一步采用肽亲和纯化，得到目标抗体。

抗GTPBP9抗体是通过以下步骤鉴定的：

步骤一：免疫印迹：将所获得的GTPBP9抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法，确认该抗体能够与变性后的天然GTPBP9蛋白相互作用，可用于免疫印迹试验。

步骤二：免疫组化：将所获得的GTPBP9抗体作为一抗，采用标准的免疫组化方法，用于检测组织芯片(9种人体组织)，确认该抗体能够与具有天然结构的GTPBP9蛋白相互作用，可用于免疫组化试验。

4.附图说明

图1为免疫印迹图(Western blot)

图2为免疫组化(IHC)图

5.具体实施方式

1.多肽序列的分析和设计

利用DNAstar软件对GTPBP9蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定GTPBP9蛋白125-138位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为RAFEDDDITHVEGS。同时，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在N末端增加一个半胱氨酸C，最终待合成多肽序列为C-RAFEDDDITHVEGS。

2.多肽合成和交联

采用ACT396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50％乙腈，采用质谱仪进行鉴定，确认所获得的多肽为目的多肽。采用Sulfo-SMCC作为交联剂将载体蛋白KLH与合成多肽进行交联：取10mg KLH溶于0.5ml超纯水中；取3mg sulfo-SMCC溶于0.5ml超纯水中，用3M NaOH调pH值7左右。在混匀情况下，把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入KLH溶液中，室温下旋转混匀反应物30min。将反应好的sulfo-SMCC/KLH混合液上样到预先用平衡缓冲液(0.05M PB，pH6.0)平衡过30min的Sephadex G25柱中，收集浅灰色洗脱液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS(pH7.3)溶解待2mg交联多肽，把0.2体积的sulfo-SMCC/KLH复合物溶液加入到多肽溶液中，调pH值到7.3，室温振摇4小时，-70冷冻后，用冻干机冻干24小时后备用。通过Ellman法检测交联前后多肽巯基确定多肽交联效率。

3.多肽免疫和抗血清制备

将交联好的KLH-多肽400μg溶于400μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化(至在水中不扩散为准)。采用兔龄3个月，体重1.75-2.25Kg的健康新西兰兔进行免疫，进行背部皮内注射免疫，至少要注射20点以上。首次免疫3周后，将300μg多肽溶于300μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行皮内免疫，作为第一次加强免疫，要求背部皮内注射免疫，至少要注射15点以上。第二次免疫3周后，进行第二次加强免疫，方法和要求同第一次加强免疫。1周后，采用耳缘静脉微量取血，用未交联的合成多肽包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。重复加强免疫和效价测定，直至血清效价达到1∶60000以上，采用心脏取血，标准方法获得抗血清。

4.抗体亲和纯化

(1)、TIgG纯化：用移液器将50％的Protein-A Sepharose混悬液10ml加到30ml层析柱中，去掉顶盖和底帽，液体流出后的柱床体积即为5ml，然后用25ml去离子水冲洗3遍。取出对应的血清10ml，与2ml PBS混合后加入30ml层析柱中，旋转混合器上室温(20-25℃)混旋1小时，让血清样品流出。再用15ml纯化洗液洗层析柱3次，加入10ml洗脱液进行洗脱。

(2)、肽亲和纯化：在层析柱中加入1ml Sulfo-link凝胶悬液(0.5ml凝胶)，待柱内液体流干，用4ml偶联缓冲液冲洗层析柱。用1ml偶联缓冲液溶解合成的RBPMS多肽，并加入层析柱，再加入1ml偶联缓冲液至层析柱中，室温颠倒混匀1小时。用6ml偶联缓冲液冲洗层析柱，然后加入3ml封闭液，室温混匀1小时。冲洗层析柱3次，然后向层析柱内加入6ml IgG及3ml PBS，室温颠倒混匀1小时。用PBS冲洗层析柱3次，然后用2ml洗脱液洗脱。将所获得的纯化抗体装入透析袋内4℃透析。透析过夜，然后4000rpm×35min离心除沉淀，收集上清。用间接ELISA法测定抗体效价并用Bradford法测定蛋白浓度。

抗GTPBP9抗体是通过以下步骤鉴定的：

1.免疫印迹分析

按照标准方法配制SDS-PAGE凝胶，将5μl蛋白浓度为5mg/ml的细胞或者组织裂解液依次加样，恒压80V约30分钟，待样品跑过浓缩胶基本呈一条直线时，改换160V电压，电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶(约60分钟)时终止电泳，采用电转膜方法恒压100V电转80分钟转膜至PVDF膜。将所获得的GTPBP9抗体作为一抗，采用浓度为1μl/ml与上述转膜得到的抗原芯片在室温下杂交1小时，然后用HRP标记的羊抗兔抗体在室温下杂交1小时，采用ECL显色法进行显色，在暗室中用X片进行显色和曝光，得到免疫印迹结果。

2.免疫组织化学分析

将4％甲醛溶液固定的组织切成1.5mm×1.5mm×2.0-3.0mm的组织块，乙醇梯度脱水后二甲苯透明30分钟，62℃石蜡浸蜡2小时后，在组织包埋机上将9种组织按照3×3的排列方式用石蜡进行包埋。采用标准石蜡切片方法将切好的4-5μm厚的组织芯片蜡片贴附于APES处理过的载玻片上，在烤片机60℃烤片1小时，然后在烤箱中60℃烤片6小时。采用标准免疫组化方法，室温下用100μl 10％羊血清于湿盒中封闭切片30分钟，加入 100μl浓度为2-4μg/ml的GTPBP9抗体，湿盒中4℃过夜，PBS清洗后加入生物素标记羊抗兔IgG于湿盒中37℃孵育30分钟，然后PBS清洗后加入HRP标记的链霉卵白素浓缩液，湿盒中37℃孵育30分钟，洗片后1％DAB显色，苏木素复染，复蓝，脱水，透明，封片，镜检，检查结果并拍照。