小麦条锈病抗性相关蛋白TaSPX-MFS及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及小麦条锈病抗性相关蛋白TaSPX-MFS及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术：

在漫长的进化过程中，植物产生了复杂的机制来识别病原菌的侵染并触发自身有效的免疫反应。植物先天免疫体系包括两大分支，一个是PAMP(pathogen-associated molecular pattern)触发的免疫系统(PAMP-triggered immunity，PTI)，它是通过跨膜的受体蛋白PRRs(pattern recognition receptors)与PAMP相互应答而产生的早期对病原菌的抗性反应；另一个是效应子触发的免疫系统(effector-triggered immunity，ETI)，它是通过植物抗性基因(R基因)编码的R蛋白对由病原菌无毒基因(Avr基因)编码的效应子进行直接或间接的识别而产生的免疫反应(Chisholm ST,Coaker G,Day B,Staskawicz BJ.(2006).Host-microbe interactions:shaping the evolution of the plant immune response.Cell 124:803-814；Nimchuk Z,Eulgem T,Holt III BF,Dangl JL.(2003).Recognition and response in the plant immune system.Annu.Rev.Genet.37:579-609)。

大麦条纹花叶病毒(Barley Stripe Mosaic Virus,BSMV)为由α、β、γ共3条链组成的3链RNA病毒。利用BSMV-based介导的基因沉默系统被成功用于大麦和小麦功能基因的研究上(Hein I,Barciszewska-Pacak M,Hrubikova K,Williamson S,Dinesen M,Soenderby IE,Sundar S,Jarmolowski A,Shirasu K,Lacomme C.(2005).Virus-Induced Gene Silencing-Based Functional Characterization of Genes Associated with Powdery Mildew Resistance in Barley.Plant Physiology 138:2155-2164；Zhou HB,Li SF,Deng ZY,Wang XP,Chen T,Zhang JS,Chen SY,Ling HQ,Zhang AM,Wang DW,Zhang XQ.(2007).Molecular analysis of three new receptor-like kinase genes from hexaploid wheat and evidence for their participation in the wheat hypersensitive response to stripe rust fungus infection.The Plant Journal 52,420–434.；Wang G,Wei X,Fan R,Zhou H,Wang X.Yu C,Dong L,Wang X,Kang Z,Ling H,Shen Q,Wang D,Zhang X.(2011)Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein 90(hsp90):functional involvment of ctosolic hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance.New Phytol.,191:418-431)。

当BSMV侵染植物时，植物通过DCL4和DCL2产生相应的siRNA对病毒RNA进行剪接，由此抵御病毒的伤害。但病毒RNA中携带有外源基因片段时，其siRNA也会导致植物内源基因的沉默，由此产生植物基因沉默的表型(Dekeris A.,Gallego-Bartolome J.,Bao J.,Kasschau K.,Carrington J.,Voinnet O.(2006).Hierarchical Action and Inhibition of Plant Dicer-Like Proteins in Antiviral Defense.Science.313(5783),68-71)。分子病毒学研究表明，在γb基因后插入外源片段时不影响其对植物的侵染活性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物条锈病抗性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了与植物条锈病抗性相关蛋白，本发明所提供的与植物条锈病抗性相关蛋白的名称为TaSPX-MFS，是如下a)-e)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

c)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；

d)在序列2所示或序列4或序列6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

e)将序列2所示或序列4或序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码上述蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述相关生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)-5)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)其编码序列是序列3所示的cDNA分子或DNA分子；

3)其编码序列是序列5所示的cDNA分子或DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或与上述蛋白质相关生物材料的新用途。

本发明提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关生物材料在调控植物条锈病抗性中的应用。

本发明还提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关生物材料在培育条锈病抗性降低的转基因植物中的应用。

上述应用中，所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。

本发明还有一个目的是提供一种培育条锈病抗性降低的转基因植物的方法。

本发明提供的培育条锈病抗性降低的转基因植物的方法包括将抑制上述蛋白质表达的物质导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的条锈病抗性低于所述受体植物。

上述方法中，所述抑制上述蛋白质表达的物质为如下A)或B)：

A)BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和含有序列3自5′端第255-442位所示的DNA分子的BSMV病毒载体γ；

B)BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和含有序列3自5′端第2067-2250位所示的DNA分子的BSMV病毒载体γ。

上述方法中，所述转基因植物的条锈病抗性低于所述受体植物具体体现在如下a1)或a2)：

a1)转基因植物的条锈菌丝比受体植物长；

a2)转基因植物的条锈菌孢子堆比受体植物多。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物；所述单子叶植物具体为小麦。

本发明的最后一个目的是提供抑制上述蛋白质表达的物质。

本发明提供的抑制上述蛋白质表达的物质为如下A)或B)：

A)BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和含有序列3自5′端第255-442位所示的DNA分子的BSMV病毒载体γ；

B)BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和含有序列3自5′端第2067-2250位所示的DNA分子的BSMV病毒载体γ。

本发明从普通小麦(Triticum aestivum L.)品种小偃54中克隆到SPX基因，将其命名为TaSPX-MFS，并构建了用于沉默小麦中TaSPX-MFS基因的病毒诱导性载体，降低TaSPX-MFS基因的表达，得到沉默TaSPX-MFS小麦。通过试验证明：沉默TaSPX-MFS小麦接种条锈病CYR31后，小麦叶片上出现许多条锈菌孢子堆，小麦植株显现明显的条锈病抗性丧失表型。说明通过敲除或沉默等手段来抑制小麦中的 TaSPX-MFS基因在植物中的表达，可以降低小麦对条锈病的抗性，反之推测，在小麦中的过表达TaSPX-MFS基因可提高小麦对于条锈病的抗性，对于研究小麦条锈病，提供敏感型株系，为小麦抗病基因的研究作出贡献。

附图说明

图1为BSMV-based VIGS系统载体结构示意图，以TaPDS基因为例作为外源基因片段反向插入γ链γb基因突变的终止子处。

图2为基因沉默后TaSPX-MFS的表达情况。

图3为病毒诱导TaSPX-MFS基因沉默后小偃54对条锈菌小种CYR31的抗性变化。

图4为病毒诱导重组大麦条纹花叶病毒侵染植株后内部条锈菌丝的生长及寄主细胞反应观察。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的普通小麦品种小偃54是2000年8月通过陕西省农作物品种审定委员会审定品种，在文献“吴会杰，魏学宁，周新力，曹双河，李宏伟，王献平，童一平，井金学，张相岐。小偃54和小偃81高温抗条锈性及其与几丁质酶基因表达的关系。麦类作物学报，2007,27(6):1117-1122”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中的高保真Pyrobest Taq、Premix Ex Taq、RNA酶抑制剂、各种限制性内切酶、反转录试剂盒、pMD18-T Vector均购自大连宝生物(TaKaRa)公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根生物技术公司；转录相关试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。

下述实施例中的BSMV病毒载体(包括BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和BSMV病毒载体γ)是由Andy Jackson教授(University of California,Berkeley)馈赠，在文献“Petty I,Hunter B,Wei N,Jackson A.(1989).Infectious barley stripe mosaicvirus RNA transcribed in vitro from full-length genomic cDNA clones.Virology,171,342-349”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中的条锈菌小种CYR31在文献“Li XH,Fan RC,Fu SL,Wei B,Feng J,Zheng Q,Wang XP,Han FP,Zhang XQ.(2015).Development of Triticum aestivum-Leymus mollis translocation lines and identification of resistance to stripe rust.Journal of Genetics and Genomic 42(3),129-132.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所购得。

下述实施例中的GFP(BSMV:GFP)质粒在文献“Holzberg S.，Brosio P.，Gross C.，Pogue G.(2002)Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.Plant J.,30:315-327”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中的GKP Buffer含有50mM甘氨酸(glycine)、30mM K₂HPO₄1％(质量百分比)膨润土(bentonite)、1％(质量百分比)硅藻土(celite)。

实施例1、TaSPX-MFS基因的获得

1、cDNA的获得

取生长7天的普通小麦品种小偃54幼苗叶片，洗净后放入经DEPC处理、灭菌后的研钵中，研磨粉碎，加入TRIzol(Invitrogen)研磨、匀浆，室温放置5分钟，加入氯仿抽提2次，取上清，用异丙醇沉淀总RNA，空气干燥后，溶于适量DEPC水。以带polyT的引物(TaKaRa)进行反转录获得cDNA。

2、PCR扩增

以步骤1获得的cDNA为模板，采用正向引物TaSPX-MFS-F和反向引物TaSPX-MFS-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：

TaSPX-MFS-F：5′-CGAAGTATTGTGCTTGAGTTGATTG-3′

TaSPX-MFS-R：5′-CCTGCTAGCATTTGCTAGCTTGATACCAC-3′；

上述PCR扩增反应条件：94℃ 1min，然后94℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 2min 30个循环，最后72℃ 5min。

3、电泳和测序

将上述步骤2获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果表明，PCR扩增获得了大小约2.3kb的片段，并将PCR扩增产物连接到pMD18-T载体(TaKaRa Biotech)上用于测序，采用DNAman软件对测序结果进行序列拼接，结果表明：上述从普通小麦品种小偃54中共克隆得到3条不同的cDNA序列，3个基因序列相似性非常高，核苷酸同源性在96.6～98.3％，氨基酸序列相似性都在97.3-99％之间，因此将3个基因统称为TaSPX-MFS基因，分别命名为TaSPX-MFS-6A基因、TaSPX-MFS-6B基因和TaSPX-MFS-6D基因，其中，TaSPX-MFS-6A基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，自5’端第1-2082为OFR，其编码的氨基酸序列如序列表中序列4所示；TaSPX-MFS-6B基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，自5’端第1-2082为OFR，其编码的氨基酸序列如序列表中序列5所示；TaSPX-MFS-6D基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，自5’端第1-2082为OFR，其编码的氨基酸序列如序列表中序列6所示。

实施例2、沉默TaSPX-MFS小麦的获得及其条锈病抗性分析

一、沉默TaSPX-MFS小麦的获得

1、基因沉默片段的获得

(1)以步骤1中TaSPX-MFS-6D基因作为模板，采用SPXdm-VF1：5’-TACGCTAGCCATACTCACGGAACATTCCG-3’；SPXdm-VR1：5’-CCTGCTAGCCACGAGTCGAGACGTAATAA-3’进行PCR扩增，扩增得到188bp的片段(自序列3的5′端第255-442位核苷酸)，将其命名为SPXdm-VR1；

(2)以步骤1中TaSPX-MFS-6D基因片段作为模板，采用3UTR-VF1：5’-TACGCTAGCTTATAACACCCTGTACTGAC-3’；3UTR-VR1:5’-CCTGCTAGCATTTGCTAGCTTGATACCAC-3’，扩增得到184bp的片段(自序列3的5′端第2067-2250位核苷酸)将其命名为3UTR-VR1。

2、BSMV重组病毒载体的构建

按照常规分子生物学手段，参见“精编分子生物学实验指南，2001，科学出版社，颜子颖，王海林译”中的方法进行载体构建。具体步骤如下：

将上述步骤1获得的SPXdm-VR1插入BSMV病毒载体γ的NheI酶切位点间，且保持BSMV病毒载体γ的其他序列不变，得到重组载体VIGS-SPXdm。

将上述步骤1获得的3UTR-VR1插入BSMV病毒载体γ的NheI酶切位点间，且保持BSMV病毒载体γ的其他序列不变，得到重组载体VIGS-3UTR(图1，以TaPDS为例说明外源基因片段插入位置及方向)。

BSMV病毒载体α、β和BSMV:GFP共同构成了病毒系统BSMV:GFP病毒载体。

BSMV病毒载体α、β和重组载体VIGS-SPXdm共同构成了可沉默TaSPX-MFS基因的病毒系统BSMV:SPXdm病毒载体。

BSMV病毒载体α、β和重组载体VIGS-3UTR共同构成了可沉默TaSPX-MFS基因的病毒系统BSMV:3UTR病毒载体。

3、BSMV体外转录

(1)用MluI酶切BSMV病毒载体α、BSMV:GFP、VIGS-SPXdm，VIGS-3UTR，用SpeI酶切BSMV病毒载体β，分别得到酶切产物。

(2)以(1)中的酶切产物为模板进行体外转录，分别得到体外转录的BSMV病毒载体α、体外转录的BSMV病毒载体β、体外转录的BSMV:GFP、体外转录的VIGS-SPXdm和体外转录的VIGS-3UTR。体外转录反应按照AmpliCap-MaxTM T7High Yield Message Maker Kit(Epicentre)说明书进行操作：RNase-free water XμL，线性化质粒1.5μg，10×Transcription Buffer 2μL，Cap/NTP PreMix 8μL，100mM DTT2μL，Amplicap-Max^TM T7Enzyme Solution 2μL，反应总体积20μL，42℃反应2.5h， 转录产物置-70℃保存备用。

4、BSMV接种

待小偃54生长至二叶期时，将8μl BSMV病毒混合液(灭菌超纯水稀释3倍后体外转录的BSMV病毒载体α、体外转录的BSMV病毒载体β、体外转录的BSMV:GFP等量混合，加入等体积的2×GKP Buffer)涂抹接种于植株平展的第二叶上，10分钟后用灭菌超纯水喷施叶面，覆保鲜膜保湿24小时，之后转为正常条件培养，得到转BSMV:GFP株系。

待小偃54生长至二叶期时，将8μl BSMV病毒混合液(灭菌超纯水稀释3倍后体外转录的BSMV病毒载体α、体外转录的BSMV病毒载体β、体外转录的VIGS-SPXdm等量混合，加入等体积的2×GKP Buffer)涂抹接种于植株平展的第二叶上，10分钟后用灭菌超纯水喷施叶面，覆保鲜膜保湿24小时，之后转为正常条件培养，得到转BSMV:SPXdm株系。

待小偃54生长至二叶期时，将8μl BSMV病毒混合液(灭菌超纯水稀释3倍后体外转录的BSMV病毒载体α、体外转录的BSMV病毒载体β、体外转录的VIGS-3UTR等量混合，加入等体积的2×GKP Buffer)涂抹接种于植株平展的第二叶上，10分钟后用灭菌超纯水喷施叶面，覆保鲜膜保湿24小时，之后转为正常条件培养，得到转BSMV:3UTR株系。

以接种1×GKP(buffer模拟接种)为对照，获得了MOCK(对照)。

转BSMV:SPXdm和转BSMV:3UTR株系即为本发明条锈病抗性降低的沉默TaSPX-MFS的小麦株系。

5、沉默TaSPX-MFS小麦的鉴定

通过RT-PCR检测转BSMV:SPXdm和转BSMV:3UTR株系中的TaSPX-MFS基因沉默的情况。具体方法如下所述：

(1)分别提取步骤4中病毒接种后获得的MOCK(对照)、转BSMV:GFP株系、转BSMV:SPXdm和转BSMV:3UTR株系的总RNA，反转录获得cDNA。

(2)以上述步骤(1)获得的cDNA为模板，采用如下引物进行RT-PCR，分别检测小麦TaSPX-MFS-6A、TaSPX-MFS-6B和TaSPX-MFS-6D的表达量。以Actin为内参基因，引物序列如下：

SPX-MFS-6A：qTaSPX-MFS-6A-F：5′-CTTCCGGTCAACGTCATCGTT-3′；

qTaSPX-MFS-6A-R：5′-CGACACGACGTACTGAGCTT-3′；

SPX-MFS-6B：qTaSPX-MFS-6B-F：5′-CTCCATCGCCGCGACGTTT-3′；

qTaSPX-MFS-6B-R：5′-GCTAGCTTGATACCACAAGCC-3′；

SPX-MFS-6D：qTaSPX-MFS-6D-F：5′-TCCGGTCAACGTCATCGTG-3′；

qTaSPX-MFS-6D-R：5′-ACAGGTTGACCCCTTCAAGA-3′；

Actin：qActin-F:5′-CGAGCTCCGTGTCGCA 3′；

qActin-R:5′-GAGGAAGCGTGTATCCCTCATAG-3′。

结果如图2所示：MOCK(对照)和转BSMV:GFP株系中三个TaSPX-MFS基因(TaSPX-MFS-6A基因、TaSPX-MFS-6B基因和TaSPX-MFS-6D基因)的表达没有明显变化，而转BSMV:SPXdm和转BSMV:3UTR株系中三个TaSPX-MFS基因(TaSPX-MFS-6A基因、TaSPX-MFS-6B基因和TaSPX-MFS-6D基因)的表达得到了明显的抑制，达到基因沉默的效果。

二、沉默TaSPX-MFS小麦的条锈病抗性分析

1、条锈菌小种CYR31的接种

MOCK(对照)、转BSMV:GFP株系、转BSMV:SPXdm株系、转BSMV:3UTR株系接种BSMV病毒混合液，培养20天后开始接种条锈菌小种CYR31。具体步骤如下：将待接种的小麦苗放到接种桶内，用0.1％(体积百分含量)的Toween20溶液将小麦苗及接种桶周围均匀喷湿，然后进行CYR31小种的扫抹接种，之后再用0.1％的Toween20均匀喷湿，用塑料纸将桶口封严保湿。接种后，幼苗进行低温(10℃)黑暗处理24h，以保证条锈菌的成功侵染。第二天再移至人工气候室生长，白天温度为15-18℃，晚上11-14℃，湿度为80％左右，光照强度为6000Lux，光照时间为16h/d。15天后观察表型。

结果如图3所：接种和反应型分级标准按Li and Shang描述的方法(Li ZQ,Shang HS.(1989).Wheat rusts and their control.Shanghai Science and Technology Press,Shanghai,China.)，0-2级为抗病，3-4级为感病。转BSMV:SPXdm株系和转BSMV:3UTR株系接种条锈菌CYR31后，小麦叶片上出现许多条锈菌孢子堆(3级)，而MOCK(对照)和转BSMV:GFP株系上则出现了许多坏死斑(0级)，产生了超敏反应(HR)，MOCK(对照)和转BSMV:GFP株系的条锈病的抗性高于转BSMV:SPXdm株系和转BSMV:3UTR株系。上述结果说明，TaSPX-MFS参与了小麦对条锈病原菌CYR31的抗性过程。

2、菌丝的形态观察

为了更好地理解TaSPX-MFS参与小偃54高温诱导抗条锈性的植物病理组织学机制，利用荧光显微镜对接种CYR314天后的MOCK(对照)、转BSMV:GFP株系、转BSMV:SPXdm株系、转BSMV:3UTR株系叶片材料中条锈菌的生长扩展情况和寄主叶肉细胞反应进行了观察，并对菌丝长度进行了统计。研究材料为接菌4天的叶片，叶片处理参照“Wang CF,Huang LL,Buchenauer H,Han QM,Zhang HC,Kang ZS.(2007)Histochemical stidies on the accumulation of reactive oxygen species(O2-and H2O2)in the incompatible and compatible interaction of wheat-Puccinia striiformis f.sp.tritici.Physiol.& Mol.Plant Pathol.,71:230-239”中的方法。具体步骤如下：

剪取的2厘米长的叶段放入95％的乙醇溶液中固定、脱色，观察前转到饱和水合氯醛溶液中过夜。随后，在50％甘油溶液中保存。观察与统计方法参照“Wang XJ,Tang CL,Zhang HC,Xu JR,Liu B,Lv J,Han DJ,Huang LL,Kang ZS.(2011)TaDAD2,a negative regulator of programmed cell death,is important for the interaction between wheat and the stripe rust fungus.Mol.Plant Microbe Interact.,24:79-90”中的方法。脱色后的叶段用Olympus BX-51微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope,DIC)对条锈菌侵染点和入侵菌丝的长度进行观察，记录。利用荧光显微镜观察坏死叶肉细胞的自发荧光，并记录坏死点面积。

结果如图4所示：在转BSMV:SPXdm株系、转BSMV:3UTR株系的叶肉细胞坏死很少，没有限制条锈菌丝的扩展，条锈菌产生了次生菌丝(图4-c,d)，菌丝长度显著长于MOCK(对照)、转BSMV:GFP株系中菌丝的长度(图4-e)。在MOCK(对照)、转BSMV:GFP株系叶片中，条锈菌丝较短，在与初生菌丝接触的位点，寄主叶肉细胞产生坏死，限制了菌丝的扩展(图4-a,b)。