一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用的制作方法

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用。
背景技术：
：肺结核是严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，主要由结核分枝杆菌引起，是我国重点控制的主要疾病之一。全球每年死于结核病的人口大约300万，而我国肺结核发病率呈现逐年上升趋势。目前典型肺结核的诊断主要通过对临床表现的观察、痰查结核菌、胸部影像学、支气管镜检查等作出判断，一旦确诊后有相对成熟有效的治疗方案，而且多数患者可以治愈；但一些非典型的肺结核诊断存在难度，尤其是老年患者以及合并糖尿病、艾滋病等疾病的患者，其临床表现高度可变，如无症状、非特异性症状、轻微呼吸道症状以及呼吸衰竭，可能会导致误诊、漏诊，从而严重影响疾病的预后，甚至导致患者死亡。目前肺结核的检测仍然依靠痰涂片检查、痰培养结合影像学作为主要诊断手段。然而痰培养的最大缺陷是耗时较长，容易延误治疗时机。因此开发简单快速、特异性好、灵敏度高的血清免疫学诊断试剂是近年来结核病诊断研究的重点。目前市面上的结核杆菌血清学检测试剂以基于单一的结核杆菌重组抗原为主。大量文献和临床资料表明，由于结核患者的抗体反应存在异质性，单一抗原用于血清学诊断存在敏感性低而假阳性率较高的缺点。技术实现要素：本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供涉及一种结核分枝杆菌融合基因蛋白及其应用。本发明利用结核分枝杆菌rd区蛋白对结核病人的血清抗体进行筛选，提供一种与检测肺外结核患者(eptb)，活动性结核(ptb)，潜伏性结核(ltbi)和健康对照者血清的生物标识蛋白，该标识蛋白可用于肺外结核患者，活动性结核，潜伏性结核患者的血清学诊断，建立结核患者rv0222，rv2657c，rv1509三基因b细胞结合位点融合蛋白的血清抗体检测方法，为肺活动性肺结核的及时诊断和治疗提供技术支持。结核分枝杆菌单一抗原以及融合抗原进行elisa检测对比，发现融合蛋白抗原能够提高抗体血清学检测的特异性及敏感度。本发明分别自结核分枝杆菌标准菌株h37rv(武汉大学刘君炎教授馈赠)扩增rv0222，rv2657cb，rv1509c基因片段并依次与原核表达载体连接形成融合基因，含有融合基因的质粒在大肠杆菌中成功表达并得到纯化，为结核病的临床诊断提供一组新的候选抗原。本发明通过以下技术方案实现：申请人通过基因工程的方法人工了包含结核分枝杆菌本基因的b细胞结合位点的融合基因rv0222-rv2657c-rv1509，利用protean(dnastar,madison,wi)软件分别预测三基因的b细胞受体位点，它们的核苷酸组合序列分别为rv0222：p1‐p110；rv1509：p90‐210；rv2657c：p50‐80，通过linker将结核分枝杆菌rv0222基因，rv2657c基因和rv1509基因b细胞受体位点序列串联，获得融合基因rv0222‐rv2657c‐rv1509，其核苷酸序列如seqidno：4所示。本发明的融合基因是通过如下方法构建得到的：将上述结核分枝杆菌融合基因rv0222‐rv2657c‐rv1509插入原核表达载体pet‐32a的bamhⅰ和hindⅲ位点，构建得到重组质粒pet32a‐rv0222‐linker‐rv2657c‐linker‐rv1509，并将该重组质粒转化大肠杆菌，得到重组的大肠杆菌(escherichiacoli)dh5α‐rv0222‐‐rv2657c‐‐rv1509，申请人将该菌株命名为大肠杆菌dh5α‐rv0222‐‐rv2657c‐‐rv1509，escherichiacolidh5α‐rv0222‐‐rv2657c‐‐rv1509于2016年3月31日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为cctccno：m2016159。本发明还包括结核分枝杆菌融合基因表达的融合蛋白在制备检测肺血清检测试剂盒中作为诊断标识抗原蛋白的应用。进而还包括：保藏编号为cctccno：m2016159的大肠杆菌dh5α‐rv0222‐‐rv2657c‐‐rv1509表达的融合蛋白在制备检测肺活动性肺结核血清检测试剂盒中作为诊断标识抗原蛋白的应用。利用本发明制备的结核分枝杆菌融合基因蛋白rv0222-rv2657c-rv1509表达的融合蛋白检测肺结核患者血清，相比于健康对照组血清，igg抗体水平差异显著，敏感性分别为50％，63.79％和34％。特异性为82.1％。能够区分活动性肺结核病例，确定结核分枝杆菌融合基因rv0222-rv2657c-rv1509表达蛋白可用于肺结核患者血清学诊断的标识蛋白质。本发明首次发现一种结核分枝杆菌融合基因rv0222-rv2657c-rv1509表达的融合蛋白作为一个重要的血清诊断指标，在结核病的诊断、鉴别诊断和有效观察中的作用，为今后结核病血清学诊断研究提供了依据，具有重要的理论价值和潜在实用意义。附图说明序列表seqidno:1是以结核分枝杆菌h37rv标准株基因组dna为模板，pcr扩增得到的rv0222基因核苷酸序列，序列长度为330bp。序列表seqidno:2是seqidno:1所述基因编码的蛋白质序列。序列表seqidno:3是以结核分枝杆菌h37rv标准株基因组dna为模板，pcr扩增得到的rv2657c基因的核苷酸序列，序列长度为90bp。seqidno:4-5是seqidno：3所述的基因编码的蛋白质序列。序列表seqidno:6是以结核分枝杆菌h37rv标准株基因组dna为模板，pcr扩增得到的rv1509基因核苷酸序列，序列长度为360bp。序列表seqidno:7-10是seqidno：6所述基因编码的蛋白质序列。序列表seqidno：11是本发明人工合成的结核分枝杆菌融合基因rv0222-rv2657c-rv1509的核苷酸序列，序列长度为840bp。序列表seqidno：12-16是结核分枝杆菌融合基因rv0222-rv2657c-rv1509的编码的蛋白质序列。图1：是目的基因pcr扩增结果和蛋白表达图。附图标记说明：图1a是融合基因rv0222‐rv2657c‐rv1509的pcr扩增结果图，泳道m为maker，1和2是rv0222‐rv2657c‐rv1509连接后的；图1b是融合基因rv0222‐rv2657c‐rv1509的蛋白表达图，泳道m为maker，3是纯化后的融合蛋白rv0222‐rv2657c‐rv1509。图2：结核分枝杆菌融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509检测肺外结核患者(eptb)，活动性结核(ptb)，潜伏性结核(ltbi)和健康对照者(hc)血清igg抗体水平的差异比较。附图标记说明：图2a是esat-6/cfp-10检测实验组血清igg抗体水平图；图2b是融合基因rv0222-rv2657c-rv1509检测实验组血清igg抗体水平图。图3：是商业质粒pet32a的图谱图4：是本发明构建的重组质粒pet32a-rv0222-linker-rv2657c-linker-rv1507的图谱。具体实施方式实施例1肺结核诊断标识蛋白的筛选及其制备1.pcr扩增rv0222-rv2657c-rv1509基因以mtb标准株h37rv基因组(登陆号al123456)dna为模板，利用protean(dnastar,madison,wi)软件分别预测三基因的b细胞受体位点，它们的核苷酸序列分别为rv0222(genbank登陆号mtcy08d5.17)：p1-p110；rv1509(genbank登陆号mtcy277.31)：p90-210；rv2657c(genbank登陆号mtcy441.26c)：p50-80，应用primmer5.0涉及overlapping引物如下表1，采用如下反应体系和反应程序，利用引物f1，r1扩增rv0222基因；利用引物f2，r2扩增rv2657c基因；利用引物f3，r3扩增rv1509。将rv0222，rv2657c和rv1509基因pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳后，用干净刀片切下目的片段按照天根生化科技(北京)有限公司胶回收试剂盒说明书提供的操作步骤利用该回收试剂盒回收目的片段。表1融合基因rv0222-rv2657c-rv1509的各引物序列表1说明：斜体为酶切位点序列，划线部分为linker序列50μlpcr反应体系包括：mixture缓冲液25.0μl，上游引物f10μmol/l1.0μl，下游引物r10μmol/l1.0μl，模板(dsdna)1.0μl，ddh2022.0μl。pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；56-58℃退火30s；72℃延伸1min；进行30个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。以上述纯化的pcr产物rv0222和rv2657c为模板，以f1和r2为引物，采用表2所述的反应体系和表3所述的反应程序采用重叠延伸剪切技术(splicingbyoverlappedextension,soe)(robertmetal1989；nikolaietal2004)获得rv0222和rv2657c的融合基因rv0222-rv2657c；以上述纯化的pcr产物rv0222-rv2657c和rv1507为模板，以f1和r3为引物primerstardna聚合酶进行pcr,采用soe获得融合基因表2利用soe串联扩增各目的基因pcr反应体系组分体积(μl)primerstarbuffer10primerstarmix4f1r1rv0222-rv2657c3rv15073primerstarpolymerase0.5h2o27.5总体积50rv0222-rv2657c-rv1507。将上述融合基因产物用1％琼脂糖凝胶电泳后，用干净刀片切下目的片段，用天根生化科技(北京)有限公司胶回收试剂盒回收目的片段。共计30个循环。表3利用soe串联扩增各目的基因pcrpcr反应程序温度时间94℃5min98℃10sec58℃15sec72℃3min72℃7min16℃5min2.pet32a-rv0222-rv2657c-rv1507重组质粒将rv0222-rv2657c-rv1507基因pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳后，用干净刀片切下目的片段，用天根生化科技(北京)有限公司胶回收试剂盒回收目的片段，用bamhi和hindiii分别双酶切回收产物及空载体pet32a(+)(novagen，德国)，酶切时间为3小时，温度为37℃。酶切完全之后分别将其回收。酶切回收体系见表4。表4酶切回收体系组分体积(μl)bamhⅰ1hindiii1buffer5目的基因7h2o36总体积50用t4ligase分别连接相应酶切片段及空载体，16℃水浴过夜后取10μl转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞中。连接体系见表5。表5连接体系组分体积(μl)目的片段6载体2t4连接酶1buffer1总体积10待氨苄平皿上长出单个菌落(约12h)后，无菌挑取单个菌落，转接至5mllb液体培养基中，震荡培养14h后无菌吸取2ml菌液保存，一部分进行菌液pcr鉴定，其余按常规方法提取质粒，用bamhⅰ和hindⅲ进行双酶切鉴定。送阳性克隆进行测序。测序正确后保存菌液同质粒，将重组质粒命名为pet32a–rv0222-linker-rv2657c-linker-rv1507。酶切鉴定体系见表6。表6酶切鉴定体系3.重组蛋白rv0222-rv2657c-rv1507的表达及纯化将鉴定正确的含有编码融合基因rv0222-rv2657c-rv1507重组质粒的大肠杆菌(e.coli)扩大培养，在37℃3小时及iptg较低浓度(0.8mm)诱导，120rpm/min条件下进行诱导。分别在诱导前和诱导后3h，4h，5h取样1ml，并以转化pet-32a载体的e.colibl21(de3)的细菌诱导产物为空白对照。12000r/min离心1min后，加入100ulddh2o重悬菌液后，加入25μl5倍loadingbuffer，沸水煮10min，12％sds-page进行样品分析，确定重组的原核蛋白是否表达。在确定重组原核蛋白表达后，再次诱导1l重组菌，通过高压破碎仪破碎后，12000r/min离心10min后，上清和沉淀同时煮样，进行12％sds-page进行样品检测，确定重组蛋白的表达形式，结果pet32a–rv0222-linker-rv2657c-linker-rv1507以包涵体的形式表达在沉淀中。亲和层析是基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子的原理。由于融合蛋白末端携带6个组氨酸，组氨酸侧链可亲和镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下，带组氨酸标签的目的蛋白与ni-nta琼脂糖树脂柱结合，使融合蛋白直接纯化。操作过程如下：吸取10mlni柱，填充底部垫有滤纸的纯化柱子；用8m尿素洗涤柱子，直到紫外光检测值达到稳定值从而确认柱子平衡；细菌经过8m尿素溶解过夜，超声破碎30min后，10000rpm/min离心5min；用上清缓慢过柱，通过紫外光的od值变化收集柱下流出液体(洗脱下的杂蛋白)；用8m尿素和不同浓度(10mm，20mm，250mm)咪唑洗涤柱子，通过紫外光的od值变化，收集过柱后洗脱液即纯化的蛋白；洗脱液用pbs彻底透析；取纯化后蛋白样本进行sds-page电泳鉴定，结果如图1所示，重组蛋白在51kd左右位置可见目的条带。4.血液样本的搜集与制备(1)样本收集65个活动性结核病人和20个肺外结核新收治病人血清样本来自于武汉市医疗救治中心，根据临床诊断、x影像、痰菌培养等各种手段，确定为活动性肺结核病，存在有明显结核病灶或空洞，且排除了爱滋病、泌尿道疾病等并发症。42个潜伏性结核病人来自于华中农业大学学生志愿者，且经过ifn-γ释放法检测为阳性，但是没有临床症状。43个健康对照为大学生志愿者。所有志愿者均经过x射线胸透检测，均未见病灶或空洞。所有的健康对照者都免疫过卡介苗，且无临床症状，全血t-spot和ifn-γ检测结果均为阴性。结果见表7。表7病人和志愿者信息5.结核分枝杆菌融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509在鉴别诊断肺外结核患者，活动性肺结核，潜伏性肺结核中的验证该试验包括结核分枝杆菌融合基因rv0222-rv2657c-rv1509刺激肺外结核患者，活动性肺结核，潜伏性肺结核和健康对照组血清中igg抗体水平的差异表达验证检测结核分枝杆菌融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509的间接elisa操作步骤如下：1)将终浓度为500ng/ml的融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509包被elisa96孔板，4℃孵育过夜；2)洗5遍后，用5％脱脂奶封闭1h；3)洗5遍后，加入适当稀释(体积比1:100)后的各组血清样本37℃孵育30min；4)洗5遍后，加入1:10000hrp-羊抗人igg(h+l)抗体37℃孵育30min；5)洗5遍后，加入显色液室温孵育30min；6)洗5遍后，加入终止液，混匀后即刻测量od630。esat-6/cfp-10蛋白作为阳性对照，将od630tb/od630hc比值大于等于2判断为阳性。如图2和表8所示，结核分枝杆菌融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509检测肺外结核患者、活动性肺结核和潜伏性肺结核血清，相比于健康对照组血清，其血清igg抗体水平差异显著(p<0.05)，敏感性分别为50％，63.79％和34％。特异性为82.1％。商用tb-igg试剂盒敏感性分别为50.0％,62.5％and9.5％。特异性为90.6％相比，而商用tb-igg试剂盒无法区分潜伏性肺结核和健康人，本发明的融合基因rv0222-rv2657c-rv1509可以成功区分三组，并且在各分组人群中的敏感性都要高于相对于阳性对照，能后更好的区分肺外结核病人，活动性肺结核病人，潜伏性肺结核病人和健康人。表8结核分枝杆菌融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509检测肺外结核患者、活动性结核、潜伏性结核和健康对照者血清igg抗体的敏感性和特异性实施例2融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509间接elisa在制备结核病血清抗体检测试剂盒中的应用建立检测融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509的间接elisa。将终浓度为500ng/ml的融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509包被elisa96孔板，用5％脱脂奶4℃封闭过夜，后加入0.1ml的待测血清样本(1:100稀释)37℃孵育30min，以1:10000稀释后的hrp-羊抗人igg(h+l)(购自pierce公司)为二抗，tmb/h2o2为底物，hf终止反应，用酶标仪在波长630nm处检测光密度值(od630)。用上述纯化的融合蛋白作标准曲线，以健康阴性人血清平均值±2～3sd作为阈值，建立血清夹心elisa，进一步组装成试剂盒。试剂盒配制如下：(1)酶联板一块(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)；(2)融合蛋白rv0222-rv2657c-rv1509(冻干品)；(3)样品包被液(25mmol/l碳酸盐缓冲液ph9.6)，稀释液(tbst)和洗涤液((0.05％tween-20pbsph7.4)；(4)hrp-羊抗人igg(h+l)二抗(购自pierce公司)；(5)显色液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司))和终止液(0.25％hf(v/v))。主要参考文献1.robertm,horton.engineeringhybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymes:genesplicingbyoverlapextension.gene,1989,77(1):61-68。当前第1页12