一种分离液泡和观察液泡膜上蛋白分布和运动的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分离液泡和观察液泡膜上蛋白分布和运动的方法。

背景技术：

以往的科学研究只是在大量分子的综合平均效应上进行科学探索，而单分子技术打破这一群体平均化的限制，逐一地对单个分子进行追踪。利用单分子技术，人们可以实时地监测并分析分子间相互作用的过程、构象变化以及生化反应的动力学参数。单分子技术的运用在生物学、化学、医学以及纳米材料等科学领域都具有重要意义，提供了一种全新的手段以助于研究一些亟待解决的前沿问题。

细胞内很多至关重要的生命活动过程都是在细胞膜表面完成的，例如信号转导、蛋白质转运等。在生物学研究中，单分子显微成像技术显得尤其重要。全内反射荧光技术是当今最灵敏的单分子显微成像和检测方法之一，可以仅激发深度在100nm～300nm薄层范围内的荧光基团，探测单个荧光分子而不受其它层面的荧光信号的干扰，与其它光学切片成像技术相比其在Z轴上的分辨率独具优势。基于这个想法，科学家们发明了基于全内反射的荧光显微镜—全内反射荧光显微镜(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM)。已有的研究报道，可利用TIRFM观察植物细胞膜上蛋白质的运动，但尚未将该技术扩展到观察植物细胞器膜上蛋白质的运动，原因在于观察植物细胞器存在提取困难、固定困难等种种问题。

液泡是植物细胞所特有的细胞器，体积约占成熟植物细胞的90％，并具有单层液泡膜将其与细胞质分开。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何分离液泡和观察液泡。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种观察植物液泡的方法。

本发明提供的观察植物液泡的方法，包括如下步骤：取植物组织，分离获得液泡，然后将所述液泡置于经多聚赖氨酸处理的装置上进行观察。

上述观察植物液泡的方法中，所述观察采用TIRFM显微镜进行。

上述观察植物液泡的方法中，所述“多聚赖氨酸处理”可为将所述装置置于浓度为0.01mg/mL以上的多聚赖氨酸水溶液中浸泡15min以上。

上述观察植物液泡的方法中，所述“多聚赖氨酸处理”具体可为将所述装置置于浓度为0.01mg/mL的多聚赖氨酸水溶液中浸泡15min。

所述装置可为载玻片。

上述观察植物液泡的方法中，所述“多聚赖氨酸处理”在置于所述多聚赖氨酸水溶液中浸泡之前，还可依次经过如下处理：酸液浸4h、水(如自来水)中浸泡2h和去离子水润洗。所述酸液可由浓HCl和70％(体积百分比)乙醇水溶液按照体积比1：100混合而成。所述去离子水润洗次数为2次，每次润洗10-15s。

上述观察植物液泡的方法中，所述“分离获得液泡”的方法，依次可包括如下步骤：

(1)取植物组织，用酶解液进行处理，获得原生质体；所述酶解液中可含有0.3-0.5M甘露醇、15-25mM MES、8-12mM KCl、10-30U/mL纤维素酶、10-100U/mL离析酶、8-12mM CaCl₂、0.0005-0.0015g/mLBSA和0.5-0.9μL/mLβ-巯基乙醇；

(2)裂解所述原生质体，获得液泡。

所述步骤(1)中，所述酶解液和所述植物组织的配比可为10-15mL：1g。

所述步骤(1)中，所述酶解液和所述植物组织的配比具体可为10mL：1g。

所述酶解液具体可为含有0.4M甘露醇、20mM MES、10mM KCl、15U/mL纤维素酶、50U/mL离析酶、10mM CaCl₂、0.001g/mLBSA和0.7μL/mLβ-巯基乙醇的水溶液，pH值为5.7-5.9。

所述步骤(1)中，所述植物组织可为z1)或z2)或z3)或z4)或z5)：z1)植物的叶片；z2)拟南芥的叶片；z3)拟南芥的莲座片；z4)表达HIR1-EGFP蛋白的拟南芥的叶片；z5)表达HIR1-EGFP蛋白的拟南芥的莲座片。

所述步骤(1)中还可包括如下步骤：进行所述处理前，对所述植物组织进行表面消毒。所述表面消毒的具体方法可为：用70-75％乙醇水溶液冲洗所述植物组织2-3次，每次冲洗10-15s。

所述步骤(1)中，所述处理的参数可为a1)或a2)：a1)避光、25-29℃、3-4h；a2)避光、25-29℃振荡3-4h。所述a2)中，所述振荡的参数可为摇速40-70rpm(如40rpm、50rpm、60rpm或70rpm)，旋转半径可为40-60mm(如40mm、50mm或60mm)。

所述步骤(1)中，所述处理的参数具体可为27℃振荡4h，振荡的参数具体可为摇速70rpm，旋转半径50mm。

所述步骤(1)中还可包括如下步骤a：完成所述处理后，收集原生质体。

所述步骤a中，所述收集原生质体的方法可为：过滤，收集滤液，然后将所述滤液进行离心并收集沉淀甲，所述沉淀甲中含有原生质体。

所述步骤a中，收集原生质体的方法中的离心可为4-6℃离心15-20min，离心参数可为60-100g、brake1-4。所述步骤a中，收集原生质体的方法中的离心具体可为4℃离心20min，离心参数具体可为80g、brake1。

所述过滤可使用筛子(如目数为150孔)、尼龙网或医用纱布进行。所述过滤具体可使用孔径为100μm的尼龙网进行。

所述步骤(1)中还可包括如下步骤b：完成步骤a后，取沉淀甲，使用洗涤液洗涤，然后离心并收集沉淀乙，所述沉淀乙中含有原生质体；所述洗涤液中含有0.3-0.5M甘露醇和15-25mM MES。

所述洗涤液具体可为含0.4M甘露醇和20mM MES的水溶液。

所述步骤b中，洗涤的方法中的离心可为4-6℃离心15-20min，离心参数可为60-100g、brake1-4。所述步骤b中，洗涤的方法中的离心具体可为4℃离心20min，离心参数具体可为80g、brake1。

所述步骤(2)中还可包括如下步骤c：完成所述裂解后，离心并收集上清液，所述上清液中含有液泡。

所述步骤c中，裂解后的离心可为4-6℃离心1-10min，离心参数可为60-150g、brake1－4。所述步骤c中，裂解后的离心具体可为4℃离心5min，离心参数具体可为100g、brake1。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种从植物组织中分离液泡的方法。

本发明所提供的从植物组织中分离液泡的方法，依次可包括如下步骤：

(A)取植物组织，用酶解液进行处理，获得原生质体；所述酶解液中可含有0.3-0.5M甘露醇、15-25mM MES、8-12mM KCl、10-30U/mL纤维素酶、10-100U/mL离析酶、8-12mM CaCl₂、0.0005-0.0015g/mLBSA和0.5-0.9μL/mLβ-巯基乙醇；

(B)裂解所述原生质体，获得液泡。

所述步骤(A)中，所述酶解液和所述植物组织的配比可为10-15mL：1g。

所述步骤(A)中，所述酶解液和所述植物组织的配比具体可为10mL：1g。

所述酶解液具体可为含有0.4M甘露醇、20mM MES、10mM KCl、15U/mL纤维素酶、50U/mL离析酶、10mM CaCl₂、0.001g/mLBSA和0.7μL/mLβ-巯基乙醇的水溶液，pH值为5.7-5.9。

所述步骤(A)中，所述植物组织可为z1)或z2)或z3)或z4)或z5)：z1)植物的叶片；z2)拟南芥的叶片；z3)拟南芥的莲座片；z4)表达HIR1-EGFP蛋白的拟南芥的叶片；z5)表达HIR1-EGFP蛋白的拟南芥的莲座片。

所述步骤(A)中还可包括如下步骤：进行所述处理前，对所述植物组织进行表面消毒。所述表面消毒的具体方法可为：用70-75％乙醇水溶液冲洗所述植物组织2-3次，每次冲洗10-15s。

所述步骤(A)中，所述处理的参数可为a1)或a2)：a1)避光、25-29℃、3-4h；a2)避光、25-29℃振荡3-4h。所述a2)中，所述振荡的参数可为摇速40-70rpm(如40rpm、50rpm、60rpm或70rpm)，旋转半径可为40-60mm(如40mm、50mm或60mm)。

所述步骤(A)中，所述处理的参数具体可为27℃振荡4h，振荡的参数具体可为摇速70rpm，旋转半径50mm。

所述步骤(A)中还可包括如下步骤d：完成所述处理后，收集原生质体。

所述步骤d中，所述收集原生质体的方法可为：过滤，收集滤液，然后将所述滤液进行离心并收集沉淀甲，所述沉淀甲中含有原生质体。

所述步骤d中，收集原生质体的方法中的离心可为4-6℃离心15-20min，离心参数可为60-100g、brake1-4。所述步骤a中，收集原生质体的方法中的离心具体可为4℃离心20min，离心参数具体可为80g、brake1。

所述过滤可使用筛子(如目数为150孔)、尼龙网或医用纱布进行。所述过滤具体可使用孔径为100μm的尼龙网进行。

所述步骤(A)中还可包括如下步骤e：完成步骤d后，取沉淀甲，洗涤。

所述步骤e中，所述洗涤的方法可为：取所述沉淀甲，使用洗涤液洗涤，然后离心并收集沉淀乙，所述沉淀乙中含有原生质体；所述洗涤液中含有0.3-0.5M甘露醇和15-25mM MES。

所述洗涤液具体可为含0.4M甘露醇和20mM MES的水溶液。

所述步骤e中，洗涤的方法中的离心可为4-6℃离心15-20min，离心参数可为60-100g、brake1-4。所述步骤e中，洗涤的方法中的离心具体可为4℃离心20min，离心参数具体可为80g、brake1。

所述步骤(B)中还可包括如下步骤f：完成所述裂解后，离心并收集上清液，所述上清液中含有液泡。

所述步骤f中，裂解后的离心可为4-6℃离心1-10min，离心参数可为60-150g、brake1－4。所述步骤f中，裂解后的离心具体可为4℃离心5min，离心参数具体可为100g、brake1。

上述任一所述分离液泡的方法和上述任一所述观察植物液泡的方法在观察液泡膜上蛋白质的运动、观察液泡膜上蛋白质的分布、观察液泡膜上蛋白质的胞吞途径或判断待测蛋白是否在液泡膜上表达中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述蛋白质具体可为HIR1-EGFP蛋白。所述HIR1-EGFP蛋白可由表达HIR1-EGFP蛋白的转基因拟南芥表达。所述表达HIR1-EGFP蛋白的转基因拟南芥记载在如下文献中：Natalie Luhtala RP.Structure-Function Analysis of Rny1 in tRNA Cleavage and Growth Inhibition[J].Plos One，2012，7(7)：362-364。

上文中，所述植物组织的质量以湿重计。

上文中，所述离心时使用的离心机可为Eppendorf公司产品，型号可为Centrifuge5810R。

上文中，所述纤维素酶可为纤维素酶R-10。所述纤维素酶R-10具体可为北京科创汇达生物科技有限公司产品。纤维素酶R-10的比活力可为1000U/g。纤维素酶R-10酶活力定义可为：纤维素酶R-10在25℃条件下，每分钟催化1μmol纤维素转化为多糖所需要的酶量为1U。

上文中，所述离析酶可为离析酶R-10。所述离析酶R-10具体可为北京科创汇达生物科技有限公司产品。离析酶R-10的比活力可为10000U/g。离析酶R-10酶活力定义可为：离析酶R-10在25℃条件下，每分钟催化1μmol果胶转化为多糖所需要的酶量为1U。

实验证明，采用本发明所提供的方法可清晰的观察液泡膜上蛋白质的运动和观察液泡膜上蛋白质的分布，可见，采用本发明所提供的方法分离的液泡是具有生理活性的液泡，其液泡膜上蛋白质也是具有生理活性的。因此，本发明所提供的方法在液泡的分离及观察中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1的实验结果。

图2为实施例2的实验结果。

图3为实施例3的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

酶解液：将含甘露醇、MES和KCl的水溶液、纤维素酶R-10和离析酶R-10混合均匀，55℃水浴10min，冷却至室温后，再加入CaCl₂、BSA和β-巯基乙醇，用0.22μm除菌过滤器过滤灭菌，调节pH值至5.7，得到酶解液；酶解液中，甘露醇、MES、KCl、纤维素酶R-10、离析酶R-10、CaCl₂、BSA和β-巯基乙醇浓度依次为0.4M、20mM、10mM、0.015g/mL(15U/mL)、0.005g/mL(50U/mL)、10mM、0.001g/mL和0.7μL/mL；其中纤维素酶R-10和离析酶R-10均为北京科创汇达生物科技有限公司产品。

纤维素酶R-10的比活力为1000U/g。

纤维素酶R-10酶活力定义为：纤维素酶R-10在25℃条件下，每分钟催化1μmol纤维素转化为多糖所需要的酶量为1U。

离析酶R-10的比活力为10000U/g。

离析酶R-10酶活力定义为：离析酶R-10在25℃条件下，每分钟催化1μmol果胶转化为多糖所需要的酶量为1U。

洗涤液：含0.4M甘露醇和20mM MES的水溶液。

裂解液(参考如下文献：Maretzki A，Thom M.Vacuoles:Isolation，Purification，and Uses[M].Plant Protoplasts and Genetic Engineering II.Springer Berlin Heidelberg，1989：459-479.)：向去离子水中加入1.822g甘露醇、0.15gTris和1mL浓度为0.5M的EDTA水溶液，然后用去离子水定容至50mL，用1mol/L HCl调节调节pH值至7.5。

载玻片的规格为25.4×76.2mm，约1mm－1.2mm厚。

VA-TIRFM专用盖玻片为BRAND公司产品，产品目录号为Cat.No.4708 20；规格为24×60mm。

酸液：由浓HCl和70％(体积百分比)乙醇水溶液按照体积比1：100混合而成。

下述实施例中的拟南芥为表达HIR1-EGFP蛋白的转基因拟南芥(记载在如下文献中：Natalie Luhtala RP.Structure-Function Analysis of Rny1 in tRNA Cleavage and Growth Inhibition[J].Plos One，2012，7(7)：362-364)。表达HIR1-EGFP蛋白的拟南芥具有GFP荧光分子标签，绿色荧光蛋白GFP的激发光一般在480nm左右。

中性红溶液：向去离子水中加入0.1g中性红、200μL 1％(体积百分比)乙酸水溶液和50μL氯仿，然后用去离子水定容至100mL。

下述实施例中离心时使用的离心机为Eppendorf公司产品，型号为Centrifuge 5810R。

下述实施例中Tirfm显微镜的配置具体如下：成像系统：Olympus公司的IX-83型倒置显微镜，数值孔径NA1.45的100倍油镜，荧光信号的采集有2台Andor公司的电子倍增电荷耦合器(Electron-Multiplying CCD)相机和控制软件MetaMorph采集。Andor相机的像素大小是87×87nm。显微镜配备有4个波长的激光器，分别是405nm、488nm、561nm、647nm。

实施例1、拟南芥莲座片液泡的分离和荧光显微镜检测

1、取生长至4周的拟南芥幼苗的莲座片(宽约1cm)，用70％(体积百分比)的乙醇水溶液冲洗叶片表面3次，每次15s。

2、完成步骤1后，取莲座片，用刀片去除叶前缘和叶柄，将其切成1mm的宽长条(总质量约1g)并置于玻璃培养皿；然后加入10mL酶解液，用锡纸避光(避光的目的有两个，一是去除细胞壁后的原生质体，长时间暴露易受光损伤，二是保证原生质体不进行光反应)，27℃振荡(摇速为70rpm，旋转半径为50mm)4h。

3、完成步骤2后，用尼龙网(孔径为100μm)过滤，获得滤液。

4、完成步骤3后，取滤液，4℃离心(离心参数为80g，brake＝1)20min，收集沉淀甲(沉淀甲即为原生质体)。

5、完成步骤4后，取沉淀甲，加入30mL洗涤液重悬，然后4℃离心(离心参数为80g，brake＝1)20min，收集沉淀乙(沉淀乙即为纯化的原生质体)。

6、完成步骤5后，取纯化的原生质体，加入15mL裂解液，先用100mm×0.2mm长针头轻柔吹打，再用吸管轻柔吹打2min，得到液泡初提液。

7、完成步骤6后，取液泡初提液，4℃离心(离心参数为100g，brake＝1)5min，收集上清液(上清液即为液泡纯化液)。

液泡纯化液中含有拟南芥莲座片液泡。

取液泡纯化液，采用Leica DM 2500荧光显微镜观察(选择40X物镜；调节参数为：曝光时间15.8s，增益3.7倍、饱和度1.44、伽马1.7；选择蓝光激发波长450-490nm)。结果表明(见图1)，可以利用Leica DM 2500荧光显微镜观察到液泡膜上有微弱荧光，可见，拟南芥莲座片液泡，其液泡膜上HIR1-EGFP蛋白的具有生理活性。

实施例2、液泡膜上HIR1-EGFP蛋白的TIRFM显微镜观察

1、取载玻片，先置于酸液中浸泡4h，然后在自来水浸泡2h，再用去离子水润洗2次(每次润洗15s)，最后置于浓度为0.01mg/mL的多聚赖氨酸水溶液中浸泡15min。

2、完成步骤1后，取载玻片，置于超净工作台中紫外照射风干，获得多聚赖氨酸处理后的载玻片。

3、完成步骤2后，取步骤一中7获得液泡纯化液，滴加至多聚赖氨酸处理后的载玻片，用透明胶布粘贴玻片两边(避免粘附剂处理的玻片和盖玻片互相粘附，以致压碎液泡)，然后覆盖VA-TIRFM专用盖玻片，置于TIRFM显微镜下(设定“Acquisition Channel”为“PM1394Cam01-Monochrome 16-bit”。选择488nm激光器，波长为530nm，设定激光强度为20％)，选择曝光时间200ms、频率10Hz、光学增益300倍，通过EMCCD记录并采集连续图像。

结果表明(见图2)，在TIRFM显微镜下可观察到液泡膜上HIR1-EGFP蛋白的快速运动。

实施例3、拟南芥莲座叶液泡的分离过程

1、同实施例1步骤1。

2、同实施例1步骤2。

3、同实施例1步骤3。

4、同实施例1步骤4。

5、同实施例1步骤5。

6、完成步骤5后，取纯化的原生质体，加入15mL裂解液和75μL中性红溶液，先用100mm×0.2mm长针头轻柔吹打，再用吸管轻柔吹打2min，然后在光学显微镜下进行观察。

结果表明(图3中A)，在光学显微镜下可观察到原生质体释放液泡的过程，即叶绿体向质膜一侧迁移，留下相对应质膜的另一侧无叶绿体存在，然后液泡从质膜的缺口中缓慢释出,在释放过程中会暂时被拉长变形,一但完全脱出后又恢复为球状。

7、完成步骤6后，4℃离心(离心参数为100g，brake＝1)5min，收集上清液并在光学显微镜下进行观察。

结果表明(图3中B)，经离心除去膜碎片和未裂解的原生质体，最终可见纯化的液泡。

上述结果表明，实施例1中分离的拟南芥莲座片液泡是具有生理活性的液泡。