利用Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因培育抗病转基因植物的制作方法

专利名称：利用Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因培育抗病转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因在培育抗 病转基因植物中的应用。
背景技术：
由于植物具有不能移动的性质，其在进化过程中发展出各种机制，以自身生化和 生理调节来适应和应对各种环境和胁迫。其中，无论在盐生植物还是甜土植物中，都保守 存在着液泡区隔化钠离子的能力；该过程包括通过液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白，将胞 质中的钠离子区隔化进入液泡，从而减少有毒的钠离子对胞质中各种酶的毒害(Blumwald E(2000)Sodium transport and salt tolerance in plants. Curr Opin Cell Biol. 12 431-434)。迄今为止，研究人员从许多物种中克隆了液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白基 因，例如已经从拟南芥(AtNHXl 和 AtNHX2) (Gaxiola RA, Rao R, Sherman A, Grisafi P, Alper SL, Fink GR(1999)The Arabidopsis thaiiana proton transporters, AtNhxland Avpl, can function in cation detoxification in yeast. P Natl Acad Sci USA 96:1480-1485)、小麦(TaNHXl 禾口 TaNHX2) (Brini F, Hanin Μ, Mezghani I， Berkowitz GA,Masmoudi K (2007)Overexpression of wheat Na+/H+ antiporter TNHXland ^-pyrophosphatase TVPlimprove salt—and drought-stress tolerance in Arabidopsis thaliaha plants. J Exp Bot. 58 :301_308)、/K稻(OsNHXl)(Fukuda A,Nakamura A,Tanaka Y (1999)Molecular cloning and expression of the Na./H+exchanger gene in Oryza sativa. BBA-GeneStruct Exp 1446 149-155)和大豆(GmNHXl)等物种中克隆出 NHXl 基 因(Li WYF，Wong FL, Tsai SN, Phang TH, Shao GH，Lam HM(2006) Tonoplast-Iocated GmCLCland GmNHXlfrom soybean enhance NaCl tolerance in transgenic bright yellow (BY)-2cells. Plant Cell and Environ 29:1122—1137)。在TAIRftittp://www, arabidopsis. org)网站上，我们对拟南芥的 AtNHXl 进行考 察，发现拟南芥的NHXl基因可以被非生物胁迫包括盐，渗透，氧化胁迫所诱导上调表达； 同时也可以被丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和灰霉病(Botrytis cinerea)等生 物胁迫诱导上调表达。这些证据说明NHXl积极响应生物胁迫和非生物胁迫反应。近年来， 对NHXl基因在提高植物抗盐性方面的功能研究已经开展得很深入。在拟南芥(Apse MP, Aharon GS，Snedden WA,Blumwald E (1999)Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+antiportor in Arabidopsis. Science 285 :1256-1258)、番前 (Zhang HX, BlumwaldE(2001)Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit. Nat Biotechnol 19 :765_768)和多年生黑麦草 (Wu YY, Chen QJ, Chen M，Chen J，Wang XC (2005) Salt-tolerant transgenic perennial ryegrass (Lolium perenne L.)obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated
3transformation of the vacuolar Na+Afantiporter gene. Plant Sci 169:65-73)中都已 经研究证明过表达液泡膜上的NHXl基因可以明显提高植株的抗盐性。同时，研究也证明 植物的NHXl基因具有调节细胞离子平衡和胞质pH的重要作用(SunJ，Chen S,Dai S, Wang R, Li N, Shen X, Zhou X，Lu C, Zheng X，Hu Ζ, Zhang Ζ, Song J, Xu Y(2008)NaCl-Induced Alternat ions of Cel lular and Tissue Ion Fluxes in Roots of Salt-Resistant and Salt-Sensitive Poplar Species. Plant Physiol 149:1141—1153)。尽管许多报道都证明植物中NHXl具有抗盐功能，但很少研究关注NHXl基因的其 他功能，特别是该基因在生物胁迫中所起的作用。

发明内容
本发明的目的在于提供Na+/H+逆向转运蛋白或其编码基因在培育抗病转基因植 物中的应用。本发明提供的Na+/H+逆向转运蛋白或其编码基因可以用来培育抗病转基因植物， 所述Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列如GeneBank号AAN08157所示。所述编码基因的核苷酸序列如Genbank号AY131235所示。所述抗病转基因植物为抗细菌性病害和/或真菌性病害的转基因植物。所述细菌性病害为野火病；所述真菌性病害为黑胫病。所述植物为烟草。本发明的Na+/H+逆向转运蛋白或其编码基因还可用来培育抗病和抗盐转基因植 物。所述Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列如Genbank号AAN08157所示；所述编码基 因的核苷酸序列如Genbank号AY131235所示。本发明的Na+/H+逆向转运蛋白或其编码基因还可用来培育抗氧化胁迫转基因植 物。本发明的Na+/H+逆向转运蛋白或其编码基因还可用来培育具系统获得性抗性的 转基因植物。本发明的实验证明，与野生型和转空载体植株相比，转SeNHXl基因烟草除了抗盐 性得到增强，其抗病性也得到提高，并且抗氧化酶活性更高，其系统获得性抗性的标志基因 O3R基因)的表达量更多。


图1为NaCl胁迫对种子萌发、地上部分干重和K+/Na+的影响图。图2为H2O2诱导烟草叶片细胞死亡检测图。图3为转SeNHXl基因烟草对野火病的抗性分析图。图4为转SeNHXl基因烟草对黑胫病的抗性分析图。图5为测定转基因TSll株系和空载体植株在接菌后0、12、24和36小时的抗氧化 反应图。图6为将转基因TSll株系和空载体株系中PRla(a)和Gnsl (b)基因在接菌后0， 6，12，18，24和36小时进行表达模式分析。
图7为转基因、野生型和空载体烟草在不同浓度水杨酸下萌发。其中，图1-图7中标准误差线上相同的字母表示在P < 0. 05情况下统计分析没
有显著性差异。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。实施例1.转基因烟草的抗性实验一、植物材料的获得1、获得野生型烟草、空载体烟草和转基因烟草植物材料野生型烟草品种‘威斯康辛38，(Nicotiana tabacum cv ‘Wisconsin 38，)(中国 农业科学院烟草研究所烟草种资资源库购买)，用WT表示。转基因烟草通过农杆菌叶盘法将Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因SeNHXl转化 野生型烟草‘威斯康辛 38，( “W38”)获得(Zhou SF, Chen XY, Zhang XG, Li YX(2008) Improved salt tolerance in tobacco plants by co-transformation of a betaine synthesis gene BADH and a vacuolar Na./H+antiporter gene SeNHX1. Biotechnol Lett 30 =369-376)。其中，SeNHXl基因是以下述引物1和2为引物，用盐角草的RNA合成的第一 链cDNA作为模板，PCR扩增出核苷酸序列如Genbank号为AY131235的第301-2200位的编 码基因，该编码基因编码氨基酸序列如Genbank号为AAN08157所示的蛋白。引物 1:5' -TCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC-3 ’；引物 2 5 ‘ -GGATCCTGCCTAACTGCCTCGGATT-3 ‘。扩增得到的SeNHXl基因插入含35S启动子的pBI 121的多克隆位点构建了 PBI121-35S: SeNHXl基因表达载体，测序确认无误后，将载体成功转化农杆菌LBA4404菌 株。随后，利用农杆菌介导的叶盘转化法，对“W38”的叶盘组织进行菌液侵染转化，侵染后 的叶盘放置于含有卡那霉素的分化培养基上培养。通过卡那霉素的筛选，将具有抗性的烟 草再生苗转移到温室培养，并对再生苗进行PCR检测，最终得到11株转化阳性苗，然后随机 从11株阳性苗中选取5株，进行Southern和Northern分析；并通过杂交结果，选择了 TO 代SeNHXl基因能够转录表达、并单拷贝插入基因组的T1、T11和Τ15株系。在进行Tl代转 基因烟草功能鉴定时，我们对这三个株系使用TS1、TS11和TS15编号以区别TO代烟草。空载体植株是转pBI121空表达载体的Tl代烟草植株，用pBI表示。2、植物材料的培养野生型种子消毒后播于MS培养基上，而SeNHXl转基因和空载体植株种子播在含 有150mg πιΓ1卡那霉素的MS培养基上进行筛选。两周之后，将有活力的野生型和存活的 卡那霉素抗性转基因萌发苗转移到温室，种植在含有蛭石、泥炭和腐殖质(1 1 1;体积 比)的塑料盆中。温室条件控制为温度白天为23-27°C，夜间为18-22°C ；每天光照16小 时；相对湿度50士 10%。苗期每周浇l/2Hoagland营养液一次。二、烟草的抗性实验
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1、抗盐性实验将野生型、由TO代转基因和空载体植株所结的种子播于含有200mmol/L (mM)NaCl 的MS培养基上进行萌发。同时，以不含NaCl的MS培养基上的种子萌发作为实验对照。植物培养如上所述。移苗后30天，每一周用含有200mM NaCl的l/^Hoagland营 养液进行浇灌。六周后，选择顶部完全展开的叶片来测定Na+和K+含量。另外，生物量减少 率的计算选用以下公式减少率(％ ) = [l-(NaCl处理后地上部分的干重/未处理地上部 ^>〒i)]X100%。卞艮ig (Alian A, Altman A, Heuer B(2000)Genotypic difference in salinity and water stress tolerance of fresh market tomato cultivars. Plant Sci 152 59-65)的方法利用火焰分光光度计(Corning Ltd, Essex, England)进行叶片Na+和 K+含量测定。抗盐性实验结果见图1，其中(a)是在200mM NaCl下种子萌发的结果；(b) 200mM NaCl处理6周后对转基因、野生型和空载体植株进行地上部分生物量的测定；(c) 200mM NaCl处理6周后，对转基因、野生型和空载体植株进行K+/Na+比分析。实验重复3次，萌发试验2周时，萌发结果如图Ia所示，转基因株系的种子比对照 表现出更高的萌发率。进一步实验显示，烟草幼苗在200mM NaCl下胁迫6周，野生型和空 载体植株比转基因株系的干重有更显著减少(图lb)。同时，在受盐胁迫情况下，转基因株 系表现出更高的K+/Na+比，例如野生型和空载体植株K+/Na+比为0. 7左右，而TSl株系的 K+/Na+比为0. 96，TSll为1. 01，TS15为0. 97 (图Ic)。所有这些结果表明转SeNHXl基因 烟草比野生型和空载体植株表现出更高的NaCl耐受性。2、H2O2诱导实验本实验所用植株与上述抗盐性实验中所用株系相同，选取从顶部往下充分展开的 第三片叶进行H2O2诱导的细胞死亡测定。叶片剪成IcmX Icm大小，先真空渗透10分钟，然 后分别在不同浓度的H202 (0、l、10和IOOmM)中浸泡4小时和8小时。另外，选取各个叶片 病斑附近的区域进行病害引起的细胞死亡分析。细胞死亡用伊文斯蓝法进行测定(Harding SA,Roberts DM(1998)Incompatible pathogen infection results in enhanced reactive oxygen and cell death responses in transgenic tobacco expressing a hyperactive mutant calmodulin. Planta 206 :253_258)。按照文献中所述用吸光率 A600/A680 来衡量， 死亡倍数统计由各个时期的吸光率与0小时的吸光率相比得到。结果见图2，其中(a)是叶片组织块在不同浓度的H2O2 (0，1，10和IOOmM)中浸泡4 小时的结果图；(b)是叶片组织块在不同浓度的H2O2 (0，1，10和IOOmM)中浸泡8小时的结 果图。实验重复5次，在IOmM和IOOmM H2O2处理4小时后，转基因植株比野生型和空载体 植株表现出更少的叶片细胞死亡(图2a)。相似的，在ImMUOmM和IOOmM H2O2中浸泡处理 8小时后，野生型和空载体植株比转基因植株表现出更多叶片细胞死亡(图2b)。这些结果 说明转SeNHXl基因烟草抗氧化胁迫能力提高了。3、野火病病菌侵染参考(GuoZJ,Chen XJ, Wu XL, Ling JQ, Xu P (2004) Overexpression of the AP2/ EREBP transcription factor 0PBP1 enhances disease resistance and salt tolerance in tobacco. Plant Mol Biol 55 :607_618)提供的方法，通过无头塑料注射器将含有 Bf (Pseudomonas syringae pv tabaci) ( _ 15 胃禾中 呆胃中 (American TypeCulture Collection, (ATCC)又称美国模式菌种收集中心)保藏号11527)的IOmMMgCl2 悬浮液(病菌终浓度是107CFU/ml)注射进转基因、野生型和空载体植株的离体叶片。其 中，以注射IOmM MgClpK溶液的叶片组织作为对照。侵染6天后，取侵染部位附近的叶片 组织进行细菌生长量测定。用MgCl2对叶盘组织进行研磨和稀释，并涂板于KB培养基(蛋 白胨20g Γ1，无水氯化镁1.4g Γ1，无水硫酸钾IOg Γ1，琼脂15g Γ1，甘油IOml Γ1)上。 (Bertoni G, Mills D(1987)A simple method to monitor growth of bacterial-populations in leaf tissue. Phytopathology 77 832-835) W^feiiifIlJ 定，结果用Iogltl (CFU cm"2)来表示。实验重复3次，结果如图3所示，在注射MgCl2的对照组中，转基因、野生型和空载 体植株都具有相似的菌斑数目；但在注射病菌的实验组中，我们可以清楚地看到野生型和 空载体植株比转基因株系呈现出更多的菌斑数目。结果说明，转SeNHXl基因烟草对野火病 的抗性增强了。4、黑胫病病菌侵染及分析1)黑胫病病菌侵染选取烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. hicotianae)O 号生理小种 (ATCC保藏号13611)，菌种用PDA固体培养基(土豆200g Γ1 ；蔗糖20g Γ1 ；琼脂15g Γ1 ； PH 6.5)培养并保存。黑胫病菌侵染叶片方法如文献(Guo ZJ, Chen XJ, Wu XL, Ling JQ, Xu P (2004)Overexpression of the AP2/EREBP transcription factor OPBP lenhances disease resistance and salt tolerance in tobacco. Plant Mol Biol55 :607_618)所 示，当病菌长满培养基平板的时候，用塑料取孔器从平板上取等面积的菌块用于接菌。选择 烟草顶部往下的第三片叶进行离体接种试验，并在叶脉两侧各用牙签对称扎2个孔。菌斑 块接种于叶脉右侧两个伤口，不接种的叶脉左侧作为实验对照。接种叶片培养在垫着湿润 滤纸的平板中，放于温度28士2°C，16小时光照，8小时黑暗的培养室内。2)植物感病情况对接菌后0，24，36和48小时的叶片进行拍照，然后测量病斑直径，每个数值都是 通过20个重复实验测得，并按照步骤2中H2O2诱导实验提供的方法进行细胞死亡分析，实 验重复5次。如图4a(hpi表示病菌接种后的小时数)所示，在所有侵染时间内，叶片的对照部 位(叶脉左侧无接种的伤口)都没有发病的迹象。如图4a和图4b所示，在接种黑胫病的 部位，野生型和空载体植株在接菌24小时后都出现了病斑；36小时后病斑扩散迅速；到48 小时时，病菌已经大面积的爆发，呈现大面积的组织坏死。然而，转基因烟草在接菌后的前 24小时，没有出现明显的病斑；同时，在接菌后36和48小时，转基因植株比野生型和空载 体植株表现出更缓慢的病程发展。细胞死亡倍数的结果如图4c所示，在接菌36小时以内，转基因烟草比野生型和空 载体植株表现出更少的细胞死亡。这些结果都说明转基因烟草对黑胫病的抗性增强了。3)黑胫病诱导的氧化伤害检测为了更深入阐述SeNHXl在植物抗病中的作用，选取TSll转基因株系和空载体植 株，来考察转SeNHXl基因烟草是否可以缓解由黑胫病病菌侵染而引起的氧化伤害。
DAB 染色首先对转基因TSll株系和空载体株系在不同接种时间点进行DAB染色，方法参 照 Hernandez JA, Rubio Μ, Olmos Ε, Ros-Barcelo A, Martinez-Gomez P (2004)Oxidative stress induced by long-term plum pox virus infection in peach(Prunus persica). Physiol Plantarum 122 :486_495的方法进行，染色图片见图5a(hpi表示病菌接种后的小 时数)，然后进行DAB染色斑的直径测量，DAB染色斑直径倍数(图5b)通过比染色前病斑 直径获得，实验重复5次。从图5a和图5b发现，在接菌后24和36小时，空载体植株比转基因株系在病菌 侵染部位附近呈现出更大面积的染色褐斑，说明在病菌侵染后，空载体植株产生了更多的 H2O2。CAT和POD酶活分析对转基因TSll和空载体株系CAT和POD酶活进行分析，酶液提取所有步骤都 在4°C条件下完成。过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的酶活性根据(Rao MV, Paliyath G, Ormrod DP(1996)Ultraviolet-B-and ozone-induced biochemical changes in antioxidant enzymes of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 110:125—136 禾口 Wang YS, Tian SP, Xu Y, Qin GZ, Yao HJ (2004) Changes in the activities of pro-and anti-oxidant enzymes in peach fruit inoculated with Cryptococcus laurentii or Penicillium expansum at Oor 20°C . Postharvest Biol Tec 34:21—28)的方法进行测 定。酶活比率通过比较O小时的酶活得到。实验重复5次。结果如图5c所示，转基因烟草CAT活性在所有侵染的时间内都比空载体植株的酶 活要高；同样，图5d显示出，比较于CAT活性，转基因植株的POD活性在接菌后12小时比对 照酶活也有显著提高。这些结果表明在受到病菌侵染后，转基因植株清除病害引起的氧化 伤害能力增强了。4)系统获得性抗性的标志基因的表达量分析许多研究普遍认为PR-I (PRla)和PR_2 (Gnsl)是系统获得性抗性(SAR)的标志基 因(Yasuda M(2007)Regulation mechanisms of systemic acquired resistance induced by plant activators. J Pestic Sci 32 :281_282)。PRla和Gnsl (GenBank序列号为 X06361 和EU867448)分别编码病程相关蛋白I3Rla和β _1，3_葡聚糖酶。本发明也对空载体和TSii株系进行接菌后ra基因表达量的考察。接种黑胫病后 0，6，12，18，24和36小时，对转基因TSll株系和空载体株系各选择5片叶片，进行RT-PCR 分析。对病斑周围的组织块进行RNA的提取，并混合组成一个RNA池。用Promega的MLV 反转录酶和相应操作步骤进行反转录。PCR反应使用I3Rla和Gnsl特异引物(PRla上游 5，TTG CCT TCA TTT CTT CTT GTC TC 3，，下游5’ CCT CCA TTG TTA CAC TGA ACC CT 3，； Gnsl 上游:5，GCC CTG TCA CTGGCA CAT CTT ACC T 3，，下游:5，GTT GTT CTC ATC AAA CAT GGC AAA T 3’)，并进行24，28和32三个不同循环数的扩增重复。Actin基因在烟草中的 表达量作为内参用于配平。实验重复3次，结果如图6所示，图中的相对表达量是通过与O小时的表达量比较 得到；Hpi，表示病菌接种后的小时数。在接菌后第24小时，转基因烟草比空载体植株有更 高的I3Rla基因表达；类似地，在接菌后第36小时之前，转基因株系中Gnsl基因的表达量比
8对照基因表达量都有显著提高。这些结果说明，转基因植株I3R基因(raia和Gnsl)在植株 受到病菌侵染后呈现更高的表达量，暗示了 SeNHXl可能通过参与SAR途径来调节I3R基因 表达。5)机理研究将转基因、野生型和空载体TO代种子播于含有不同浓度的SA(水杨酸)的MS平 板上，统计种子萌发情况。实验重复3次，结果如图7所示，(a)是萌发照片，(b)是萌发率的统计图。在不含 SA或者低浓度SA (0. OlmM)的MS平板上，转基因和对照都表现出相似的萌发率(图7a和 图7b)。在0. 1和0.5mM SA浓度下，大部分野生型和空载体植株种子都不能正常萌发，而 TSll株系表现出90%和80%的萌发率(图7b)。相似的，如图7b所示，在0. 1和0. 5mM SA 浓度下，TSl和TS15株系也比野生型和空载体植株表现出更高的种子萌发率。这些结果说 明，转基因烟草在高浓度水杨酸下具有更高的种子萌发率。已有研究表明，H2O2作为次级信号分子参与诱导ra基因的表达和起始SAR反 应(Kvaratskhelia M, George SJ, Thorneley RN(1997)Salicylic acid is a reducing substrate and notan effective inhibitor of ascorbate peroxidase. J Biol Chem 272:20998-21001)。同时，许多证据也显示，抗氧化酶活性的提高(为消除H202)与I3R 基因表达增强，同时发生在SA诱导的SAR反应中(Ananieva EA, Christov KN, Popova LP(2004)Exogenous treatment with Salicylic acid leads to increased antioxidant capacity in leaves of barley plants exposed to Paraquat. J Plant Physiol 161 319-328)。如图6显示，转基因植株在受到病菌侵染后，两个SAR标志基因都比对照有更 高的表达量。现在也发现转基因植株与野生型和空载体植株对水杨酸有不同程度的响应 (图7)。此外，本文研究结果显示，转基因植株受病菌侵染后CAT和POD活性的增加、H2O2 浓度的减少与I3R基因表达增强相偶联，这与前人报道的SAR反应结果一致(Chan Z，Wang Q，Xu X，Meng X，Qin G，B Li，S Tian(2008)Functions of defense-related proteins and dehydrogenases in resistance response induced by salicylic acid in sweet cherry fruits at different maturity stages. Proteomics 8:4791-4807 禾口 Xu XB, Tian SP(2008)Salicylic acid alleviated pathogen-induced oxidative stress in harvested sweet cherry fruit. Postharvest Biol Tec 49 :379_385)。这些结论表明， SeNHXl可能参与了 SAR反应途径，从而表现其在植物中的抗病功能。
权利要求
Na+/H+逆向转运蛋白或其编码基因在培育抗病转基因植物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列 如 Genbank 号 AAN08157 所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如 Genbank 号 AY131235 所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于所述抗病转基因植物为抗细菌性 病害和/或真菌性病害的转基因植物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述细菌性病害为野火病；所述真菌性病 害为黑胫病。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于所述植物为烟草。
7.Na+/H+逆向转运蛋白或其编码基因在培育抗病和抗盐转基因植物中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列 如Genbank号AAN08157所示；所述编码基因的核苷酸序列如Genbank号AY131235所示。
9.Na+/H+逆向转运蛋白或其编码基因在培育抗氧化胁迫转基因植物中的应用。
10.Na+AT逆向转运蛋白或其编码基因在培育具系统获得性抗性的转基因植物中的应
全文摘要
本发明公开了一种Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因在培育抗病转基因植物中的应用。所述Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列如Genbank号AAN08157所示；所述编码基因的核苷酸序列如Genbank号AY131235所示。Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因可以用来提高植物抗病性和抗盐性。Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因还可以用来提高植物抗氧化胁迫能力和提高植物系统获得性抗性。
文档编号C12N15/82GK101906433SQ20091008654
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月5日 优先权日2009年6月5日
发明者李银心, 陈显扬 申请人:中国科学院植物研究所