本发明涉及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的鉴定方法，尤其涉及应用PNA-FISH法鉴定金黄色葡萄球菌的方法及试剂盒和PNA探针。
背景技术：
化妆品的微生物污染是影响化妆品质量和危害人体健康的重要因素。化脓性细菌污染可引起皮肤和眼部的感染，当人体抵抗力低时，某些非病原菌或条件致病菌也会引起感染。微生物的有毒代谢产物可使人中毒。即使污染的微生物被杀灭，其残存的菌酶也会引起产品变质，变质时分解的某些组分可对皮肤产生刺激作用。此外，由于化妆品停留在人体皮肤、毛发、粘膜、眉眼部和口唇等部位时间较长，所含微生物特别是致病菌，可从与人体接触的部位进人体内，引起感染，有时甚至是致命性的。《化妆品卫生规范》(2007年版)中规定每克或每毫升产品中不得检出金黄色葡萄球菌，从而避免消费者因使用化妆品而造成皮肤化脓性感染等伤害。
肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA模拟物，其骨架结构单元为(2-氨乙基)甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接与主骨架的氨基N上，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，与DNA-DNA或RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA亲和性，在无错配的情况下其结合具有高稳定性，且杂交速度快，具有良好的细胞穿透性，是核酸探针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术(FISH)，与传统生化鉴定比较，PNA-FISH法可节约大量时间，若不计增菌时间，一般耗时不超过4个小时。与PCR等方法比较，PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性较低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步骤。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种金黄色葡萄球菌的肽核酸原位荧光杂交鉴定PNA探针，本发明的第二个目的是提供采用上述的PNA探针的鉴定方法，本发明的第三个目的是提供采用上述的PNA探针的试剂盒。本发明设计了具金黄色葡萄球菌特异性的PNA探针，并结合FISH检测技术，实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种金黄色葡萄球菌的肽核酸原位荧光杂交鉴定PNA探针，该PNA探针的核苷酸序列如下：GGATCCGCGCTGCAT T-FAM。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种金黄色葡萄球菌的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法，该方法包括以下的步骤：
1)离心收集对数生长期的细菌，PBS调整细菌浓度至OD600＝1.0，取10μl菌液于98％酒精清洗过的玻片上涂匀，火焰固定，将玻片于80％的酒精中浸泡15min，风干；
2)取25μl含500pmole/ml权利要求1所述的PNA探针的杂交缓冲液滴加于玻片上，55℃作用1.5h，杂交后玻片于55℃预热的洗涤缓冲液中洗涤2次，每次10分钟，取2-5μl菌液涂片，风干后荧光显微镜观察荧光亮度及细菌的形态。
作为优选，所述的PNA探针的杂交缓冲液pH7.5含有以下的组分：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，30％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.2％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HC。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种金黄色葡萄球菌的肽核酸原位荧光杂交鉴定试剂盒，该试剂盒包括含有所述的PNA探针的杂交缓冲液。
PNA探针的杂交缓冲液pH7.5含有以下的组分：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，30％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.2％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HC。
本发明由于采用了上述的技术方案，由于PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性、及其良好的细胞穿透性，使本发明的检测方法具有快速，准确、灵敏的特性。同时结合原位荧光杂交技术使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。PNA-FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过4个小时；PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去繁琐DNA提取的步骤。
具体实施方式
1.PNA探针的设计
在NCBI网站上(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/)获得了若干金黄色葡萄球菌和葡萄球菌属的16S rRNA序列，用MegAlign软件(version 5.0；DNASTAR,Madison,WI)的ClustalV算法进行排序。在排序后的在变异区域设计了金黄色葡萄球菌特异性探针SA-16S-1。探针序列见表1。
为了验证探针的灵敏度和特异性，用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和ProbeCheck(http://www.microbial-ecology.net/probecheck)对探针进行了验证。BLAST搜索发现，所设计的探针具有很高的特异性。只有极少数非目标葡萄球菌与探针SA-16S-1有重合区域，如Staphylococcus equorum，Staphylococcus phage，但以上非目标细菌极罕见，因此一般不会导致假阳性结果。又将PNA探针与大亚基(23S/28S)数据库匹配检测，发现没有序列与之匹配，不会发生混淆。
经过BLAST和ProbeCheck验证，所设计的探针SA-16S-1理论上具有很高的灵敏度和特异性。与阳性对照探针BacUin一起被用于后续检测。
表1 PNA探针序列
a BacUin为阳性对照探针；引用自Perry-O'Keefe,H.,Stender,H.,Broomer,A.,Oliveira,K.,Coull,J.,Hyldig-Nielsen,J.J.,2001.Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection,identification and enumeration of specific micro-organisms.J Appl Microbiol 90(2):180-189.探针合成和标记由韩国Panagene完成.
2.固相PNA荧光原位杂交
离心(2000g，5min)收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至OD600＝0.5-2.0,取10μl菌液于98％酒精清洗过的玻片上涂匀，火焰固定，将玻片于80％的酒精中浸泡15分钟，风干；25μl含500pmole/mlPNA的杂交缓冲液(pH7.5，10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，30％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.2％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HCl)滴加于玻片上，55℃作用1-1.5小时，杂交后玻片于55℃预热的洗涤缓冲液(pH10，5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)TritonX-100)中洗涤2次，每次10分钟，取2～5μl菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。
试验例1PNA-FISH敏感度验证
选取了12株金黄色葡萄球菌标准菌株和分离株进行了灵敏度验证试验方法如上所述。每次试验(包括以下实例2和3)都同步进行阳性对照和阴性对照试验，阳性对照试验，用探针BacUin替代其他探针，而阴性对照试验中，用空白替代其他探针。
结果显示，所有实验的金黄色葡萄球菌菌株都与阳性对照探针BacUin和探针SA-16S-1呈杂交阳性(见表2)。上述结果和预设结果一致，探针SA-16S-1能检测到自己的目标菌株，有较高的敏感度。
表2 PNA探针灵敏度验证
a无菌株描述.
试验例2PNA-FISH特异性验证
选取14株具有代表性的革兰氏阴性细菌和阳性细菌菌株，分别为2株鼠伤寒沙门氏菌；表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、宋氏志贺氏菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、粪肠球菌各1株。试验方法如上所述。结果显示只有阳性对照探针BacUin与所有细菌都能结合，而探针SA-16S-1不能与这些非目标菌株结合(表3)。与预期结果一致，SA-16S-1有很好的特异性。
表3 PNA探针特异性验证
a无菌株描述。