本发明属于生物工程技术领域，具体涉及猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
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食蟹猴和猕猴被广泛应用于病理学、实验动物学和药理学研究，在研究过程中实验猴携带D型逆转录病毒(simian type D retrovirus,SRV)会严重干扰实验结果，同时SRV病毒具有高传染性以及高致病性。以往对SRV病毒的检测，主要采用病毒分离和血清学法，如酶连免疫法(Elisa)、免疫荧光法等。这些方法在特异性、灵敏度、早期诊断方面各有其局限性。在以往的血清学诊断中据相关文献报道SRV病毒的血清学检测阳性仅为1％～4％，因些研究寻找灵敏度更高的检测方法势在必行。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种快速、可靠、灵敏度高、特异性强的猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。
本发明的第一个目的是提供猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
SRV-F：5’-CTGGTCAGCCAATGACGGGTA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，SRV-R：5’-CGCCTGTCTTAGGTTGGAGTGA-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
SRV病毒的探针：5’-AGAGAGTGACATTTCTCACTAAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)；探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
所述的荧光报告基团优选为TET、HEX或FAM，所述的荧光淬灭基团优选为TAMRA或BHQ1。
本发明的第三个目的是提供含有上述的检测引物和/或检测探针的检测试剂盒。
优选，所述的检测试剂盒包括实时荧光定量PCR反应液、HotStart DNA聚合酶、上述的检测引物和检测探针。
本发明的第四个目的是提供非疾病的诊断和治疗目的的猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待检样品的基因组DNA作为模板；(2)使用上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及HotStart DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在实时荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录检测样品的PCR扩增Ct值；(4)根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有猴SRV病毒。
步骤(2)所述的扩增反应体系优选为：模板DNA 5μL，10×TaqMan缓冲液2μL，5mM MgCl2 1.5μL，2.5U/μL HotStart DNA聚合酶1μL，2.5mmol/L dNTPs 1μL，20μmol/L SRV病毒的探针0.25μL，20μmol/L SRV-F和SRV-R各0.25μL，超纯水8.75μL。
步骤(3)所述的实时荧光定量PCR反应，其反应程序优选为：95℃30s；95℃5s，61℃31s，50个循环。
结果判断标准：如果实时荧光定量PCR检测扩增曲线指数期明显，且Ct≤36则判断为阳性，如果Ct值在36～38之间判断为可疑，可以加大模板量进行重复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性；如果Ct值为0或大于38，则判断为阴性。
本发明根据SRV-1病毒、SRV-2病毒、SRV-3病毒以及SRV/D-T病毒基因保守序列设计检测引物和检测探针，建立了猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测方法。本发明相较于其它检测方法具有更高的灵敏度和特异性。可同时检测大量样品且成本低，适合于大规模的猴场SRV病毒检测。SRV病毒精确的检出率将为选取食蟹猴和猕猴进行科学研究提供可靠的背景资料，同时也有助于提前发现和隔离SRV病毒携带猴。
附图说明：
图1是样品的实时荧光PCR检测结果；横坐标表示循环数(Cycle，Ct)，纵坐标表示荧光值(△Rn)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：检测引物和检测探针的设计
使用Vector NTI Suite软件分析SRV-1病毒、SRV-2病毒、SRV-3病毒以及SRV/D-T病毒基因保守序列，然后用Primer Express软件设计猴SRV病毒的检测引物及检测探针。所设计的检测引物和检测探针如下所示：
上游引物(SRV-F)：5’-CTGGTCAGCCAATGACGGGTA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，下游引物(SRV-R)：5’-CGCCTGTCTTAGGTTGGAGTGA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；扩增的目的基因片段如SEQ ID NO.3所示。
SRV病毒的探针：5’-AGAGAGTGACATTTCTCACTAAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)，5’端带有荧光报告基团FAM，3’端带有荧光淬灭基团TAMRA。
实施例2：SRV前病毒DNA的提取
用5mL的无菌注射器从猴股静脉取血1mL，EDTA抗凝。使用通用基因组DNA提取试剂盒，按使用说明提取外周血基因组DNA。
实施例3：检测引物和检测探针特异性试验
实时荧光定量PCR反应体系20μL，包括：模板DNA 5μL，10×TaqMan缓冲液2μL，5mM MgCl2 1.5μL，2.5U/μL HotStart DNA聚合酶1μL，2.5mmol/L dNTPs 1μL，20μmol/LSRV病毒的探针0.25μL，20μmol/L SRV-F和SRV-R各0.25μL，灭菌过的超纯水8.75μL。反应程序为95℃30s；95℃5s，61℃31s，50个循环。
特异性试验：
分别取泡沫病毒、SIV、SRV-1、SRV-2、SRV-3和SRV/D-T阳性样品及正常食蟹猴外周血，提取基因组DNA。按照上述的实时荧光定量PCR反应体系进行实时荧光定量PCR扩增。结果显示：泡沫病毒和SIV阳性样品及正常食蟹猴外周血扩增结果为阴性，SRV-1、SRV-2、SRV-3和SRV/D-T阳性样品扩增结果为阳性。说明本发明的检测引物和检测探针具有高度的特异性。
实施例4：检测引物和检测探针灵敏性试验
按照实施例2的方法提取SRV前病毒的DNA，然后将DNA稀释至1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107拷贝数/μL，按照实施例3的实时荧光定量PCR方法进行扩增，确定其最低检测量为1×102拷贝数/μL。由此可见，本发明的检测引物和检测探针具有较高的灵敏度。
实施例5：猴SRV病毒的检测
对120只食蟹猴和80只猕猴进行检测，按照实施例2的方法提取外周血基因组DNA。按照实施例3的实时荧光定量PCR扩增反应体系和反应程序，设定实时荧光定量PCR仪至FAM荧光检测通道，进行实时荧光定量PCR扩增。其部分检测结果如图1所示，从图1可以看出，阳性对照和阳性样本扩增曲线指数期明显，且Ct值小于36，为阳性。参照上述的结果判断标准评价检测结果如表1所示。
表1.SRV病毒在食蟹猴和猕猴中的感染情况
检测出食蟹猴的SRV阳性数为5个，SRV感染率为4.2％，猕猴的SRV阳性数为9个，SRV感染率为11.3％。检测结果与病毒分离鉴定结果一致。
序列表
<110> 猴SRV病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
<120> 广东蓝岛生物技术有限公司
<160> 4
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctggtcagcc aatgacgggt a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcctgtctt aggttggagt ga 22
<210> 3
<211> 132
<212> DNA
<213> D型逆转录病毒
<400> 3
ctggtcagcc aatgacgggt aagagagtga catttctcac taacctaaga caggagggcc 60
gtcaaagcta ctgcctaatc caatgacggg taatagtgac aagaaatgta tcactccaac 120
ctaagacagg cg 132
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agagagtgac atttctcact aac 23