本发明涉及裸藻培养技术领域，特别涉及一种提高裸藻生物量及脂肪酸含量培养基。
背景技术：
裸藻是一种非常有潜力的食品和营养添加剂，因为没有细胞壁，它所含的营养有着很高的可利用性。它不仅含有人体需要的丰富必需多不饱和脂肪酸PUFAs(预防心血管疾病)、蛋白质(提供多种必需氨基酸)和抗氧化成分，如β-胡萝卜素、维生素C、维生素E，还能积累大量的裸藻特有的副淀粉产物(Pm)(增强免疫力)。Pm是一种β-1,3-葡聚糖，可以增强生物免疫力，硫酸化的Pm还对艾滋病HIV病毒有抵抗效果，Pm纳入饮食后，可降低人体胆固醇。裸藻具有与人体被接近的脂肪酸组成以及相当高的生物活性物质如副淀粉，具有很好的市场前景。2013年10月30日，国家卫生计生委发布公告，批准包括裸藻在内的8种物质为新食品原料。微藻中有许多天然藻种具有在胁迫下积累相对较多的油脂能力，是当前生物能源的最佳来源之一。
胁迫诱导最常用的是各种必需大量营养元素比如氮，磷，硫等，大多数条件下油脂的产量能有20-50％的增加。但是此类胁迫的缺点在于需要更换培养基，增加了生产成本和劳动力成本。除此之外，氧胁迫与微生物油脂积累之间的正相关关系在产油酵母和一部分绿藻里有所少量发现和报道，比如添加氧化钛能够诱导小球藻一定量的脂肪酸积累(Kang NK,et al.,Korean J Chem Eng,2014,31:861-867)，添加纳米铁颗粒可以提高产油酵母的生物量及脂肪酸含量(Karolina et al.,Folia Microbiol.,2015,doi:10.1007/s12223-015-0442-7)。这种添加氧胁迫因子简单易行、成本较低，因此具有很好的应用前景。
裸藻规模化生产中有培养基和培养条件的优化，然而，利用纳米材料来促进细胞生长及脂肪酸的积累，在裸藻大规模培养及相应脂肪酸生产的过程中，相关应用未见发明及报道。
通常情况下，裸藻的培养方法有自养培养和异养培养两种。自养培养生长速度缓慢，不利于生物量的提高生物活性物质的积累；异养培养目前多采用富含蛋白多糖等营养物质的人工培养基，其中包含酵母膏、牛肉膏和蛋白胨等有机物质，虽然在该培养基中裸藻生长速度较快，但原料价格高昂，在开放或大规模培养过程中极易受到细菌、杂菌藻和原生动物等微生物污染，使得裸藻产量大大下降，严重的时候可能导致整批大规模培养的失败，难以实现工业化生产。如何同时提高裸藻的生物量与生物活性物质的含量，也就成了裸藻实现工业化生产的主要难题。
技术实现要素：
本发明针对裸藻培养中生长和油脂积累的矛盾，采用合理添加痕量的纳米铁材料，发明了一种配方简易、成本低廉的新型培养方法，从而达到保证低廉成本、生长速度以及提高油脂积累的理想裸藻大规模培养的目的。
本发明提供的一种提高裸藻生物量及脂肪酸含量的方法，包括步骤：1)取对数生长期的藻液，离心取上清；2)用传统培养基重悬藻细胞，离心，去上清，然后用传统培养基重悬藻细胞；3)用去离子水重悬纳米铁颗粒，加入到培养液中；4)25-30℃光照培养。
进一步地，本发明提供的一种提高裸藻生物量及脂肪酸含量的方法的步骤3)中纳米铁颗粒的颗粒的直径范围在25-50纳米。
进一步地，本发明提供的一种提高裸藻生物量及脂肪酸含量的方法的步骤3)中的合适浓度为5-80mg/L。
本发明应用商业化的纳米铁颗粒Nanofer 25,水相未被包被的、平均颗粒大小在25-50纳米左右的金属铁颗粒，新鲜悬浮颗粒可以直接应用。有效应用浓度范围在5-80mg/L。裸藻可以在异养或裸藻培养基中，在25-30℃条件下生长到平台前期(～1-5×106cells/mL)，当做种子液以1/10的接种比率转接到新鲜的培养液中，同时往培养液中添加相应浓度的纳米铁颗粒，继续培养使细胞生长到平台后期(～107cells/mL)，达到收获期。
该处理能提高5-15％的生物量，20-30％的脂肪酸积累，说明简单添加痕量的纳米铁不仅可以增加裸藻的生物量而且能刺激更多的脂肪酸积累。
与传统的、以往的技术方法相比，本发明提供的提高裸藻生物量及脂肪酸含量的方法可以使裸藻生长速度加快，更多的生物量积累，油脂和不饱和脂肪酸的含量都有显著性提高，起到大幅度降低生产成本和运行时间周期、以及提高活性物质的质量等等目的。
具体实施方式
实施例一：
微藻培养及痕量元素的添加：取生长至对数期的藻液，将其稀释成到OD750为0.5，以传统的裸藻培养基培养裸藻作为对照。
新鲜购买的纳米铁颗粒(产品型号Nanofer 25，平均颗粒直径为25-50纳米)，用去离子水重悬到合适浓度(本领域普通技术人员熟知的浓度)，在常温下可以保证2个月的稳定期。
往培养液中分别加入不同体积的纳米铁悬液(终浓度分别为1,3,5,8,13,17,50,120mg/L)；接种生长至对数期的藻细胞，培养温度为23±1℃，光照培养。
本实施例中采用的裸藻培养基的配方如下表1所示。
表1：裸藻培养基配方(按照重量份的成分)。
生物量测量：分别于第4、7、9天同一时间取10mL藻液于预先称重的15mL离心管中，8000rpm离心收集藻细胞，弃上清，置于-80℃保存。全部样品采集完毕后，管口用保鲜膜封好，扎若干小孔，置于冷冻干燥机中-45℃干燥24h。干燥完毕后，再次称重，计算裸藻生物量。干燥好的藻粉置于-80℃长期保存。
脂肪酸及其组分分析：称5-10mg冷冻干燥的藻粉于带盖玻璃离心管中，加入50μL C19:0内标工作液、1mL 2M NaOH-CH3OH溶液，在转速为100rpm的摇床上放置1h。之后于75℃水浴15min进行皂化，皂化完全后冷却，加入1mL4M HCl-CH3OH溶液，并用浓HCl调节pH＜2，再次于75℃水浴15min，使其充分甲酯化，冷却后加入1mL正己烷，涡旋震荡10s两次，使萃取完全。4000rpm离心2min促进分层，小心吸取上层清液至色谱小瓶中，完成后置于通风橱中。待溶剂挥发完全后，准备加入500μL二氯甲烷溶解得到的脂肪酸甲酯，并在凹液面处划线标记，-20℃保存，尽早上机检测。仪器运行参数同标准品。
脂肪酸组分与含量的分析：采用Agilent公司的GC-MS仪器，通过保留时间和特征离子对脂肪酸甲酯进行定性，用内标法通过计算峰面积对各脂肪酸甲酯组分进行定量。
气相色谱柱：实验采用的气相色谱柱为毛细管柱，型号为VF-23ms(Part No.:CP8827)，它属于聚硅氧烷类气相毛细管极性色谱柱，非常适合脂肪酸甲酯的分析。该色谱柱耐受的最高温度为260℃，本实验采用的规格为30.0m×320μm×0.25μm。运行参数：进样口温度为250℃；载气为高纯He(纯度高于99.999％)，恒压模式；进样体积为1μL，分流比为10:1；柱温箱升温程度如下：70℃保持4min，以25℃/min速率升温至195℃，再以3℃/min速率升温至205℃，然后以8℃/min速率升温至230℃，保持1min；传输线温度为250℃；溶剂延迟为3min；质谱检测模式为全扫描模式，质量数(m/z)检测范围为50-550；电离方式为EI(70eV)离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃。
样品的收集及处理：分别于第3、5、7天同一时间取10mL藻液于预先称重的15mL离心管中，8000rpm离心收集藻细胞，弃上清，置于-80℃保存。全部样品采集完毕后，管口用保鲜膜封好，扎若干小孔，置于冷冻干燥机中-45℃干燥24h。干燥完毕后，再次称重，计算裸藻生物量。干燥好的藻粉置于-80℃长期保存。
脂肪酸甲酯上机样品的制备：称5-10mg冷冻干燥的藻粉于带盖玻璃离心管中，加入50μL C19:0内标工作液、1mL2M NaOH-CH3OH溶液，在转速为100rpm的摇床上放置1h。之后于75℃水浴15min进行皂化，皂化完全后冷却，加入1mL 4M HCl-CH3OH溶液，并用浓HCl调节pH＜2，再次于75℃水浴15min，使其充分甲酯化，冷却后加入1mL正己烷，涡旋震荡10s两次，使萃取完全。4000rpm离心2min促进分层，小心吸取上层清液至色谱小瓶中，完成后置于通风橱中。待溶剂挥发完全后，准备加入500μL二氯甲烷溶解得到的脂肪酸甲酯，并在凹液面处划线标记，-20℃保存，尽早上机检测。后续根据标准样作为对照进行定性定量分析各种脂肪酸组分的质与量。
实施例二：
微藻培养及痕量元素的添加：取生长至对数期的藻液，将其稀释成到OD750为0.5，以传统的裸藻培养基培养裸藻作为对照。
新鲜购买的纳米铁颗粒(产品型号Nanofer 25，平均颗粒直径为25-50纳米)，用去离子水重悬到合适浓度(本领域普通技术人员熟知的浓度)，在常温下可以保证2个月的稳定期。
往培养液中分别加入不同体积的纳米铁悬液(终浓度分别为1,3,5,8,13,17,50,120mg/L)；接种生长至对数期的藻细胞，培养温度为23±1℃。
生物量测量：分别于第4、7、9天同一时间取10mL藻液于预先称重的15mL离心管中，8000rpm离心收集藻细胞，弃上清，置于-80℃保存。全部样品采集完毕后，管口用保鲜膜封好，扎若干小孔，置于冷冻干燥机中-45℃干燥24h。干燥完毕后，再次称重，计算裸藻生物量。干燥好的藻粉置于-80℃长期保存。
脂肪酸及其组分分析：称5-10mg冷冻干燥的藻粉于带盖玻璃离心管中，加入50μL C19:0内标工作液、1mL 2M NaOH-CH3OH溶液，在转速为100rpm的摇床上放置1h。之后于75℃水浴15min进行皂化，皂化完全后冷却，加入1mL4M HCl-CH3OH溶液，并用浓HCl调节pH＜2，再次于75℃水浴15min，使其充分甲酯化，冷却后加入1mL正己烷，涡旋震荡10s两次，使萃取完全。4000rpm离心2min促进分层，小心吸取上层清液至色谱小瓶中，完成后置于通风橱中。待溶剂挥发完全后，准备加入500μL二氯甲烷溶解得到的脂肪酸甲酯，并在凹液面处划线标记，-20℃保存，尽早上机检测。仪器运行参数同标准品。
脂肪酸组分与含量的分析：采用Agilent公司的GC-MS仪器，通过保留时间和特征离子对脂肪酸甲酯进行定性，用内标法通过计算峰面积对各脂肪酸甲酯组分进行定量。
气相色谱柱：实验采用的气相色谱柱为毛细管柱，型号为VF-23ms(Part No.:CP8827)，它属于聚硅氧烷类气相毛细管极性色谱柱，非常适合脂肪酸甲酯的分析。该色谱柱耐受的最高温度为260℃，本实验采用的规格为30.0m×320μm×0.25μm。运行参数：进样口温度为250℃；载气为高纯He(纯度高于99.999％)，恒压模式；进样体积为1μL，分流比为10:1；柱温箱升温程度如下：70℃保持4min，以25℃/min速率升温至195℃，再以3℃/min速率升温至205℃，然后以8℃/min速率升温至230℃，保持1min；传输线温度为250℃；溶剂延迟为3min；质谱检测模式为全扫描模式，质量数(m/z)检测范围为50-550；电离方式为EI(70eV)离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃。
样品的收集及处理：分别于第3、5、7天同一时间取10mL藻液于预先称重的15mL离心管中，8000rpm离心收集藻细胞，弃上清，置于-80℃保存。全部样品采集完毕后，管口用保鲜膜封好，扎若干小孔，置于冷冻干燥机中-45℃干燥24h。干燥完毕后，再次称重，计算裸藻生物量。干燥好的藻粉置于-80℃长期保存。
脂肪酸甲酯上机样品的制备：称5-10mg冷冻干燥的藻粉于带盖玻璃离心管中，加入50μL C19:0内标工作液、1mL2M NaOH-CH3OH溶液，在转速为100rpm的摇床上放置1h。之后于75℃水浴15min进行皂化，皂化完全后冷却，加入1mL 4M HCl-CH3OH溶液，并用浓HCl调节pH＜2，再次于75℃水浴15min，使其充分甲酯化，冷却后加入1mL正己烷，涡旋震荡10s两次，使萃取完全。4000rpm离心2min促进分层，小心吸取上层清液至色谱小瓶中，完成后置于通风橱中。待溶剂挥发完全后，准备加入500μL二氯甲烷溶解得到的脂肪酸甲酯，并在凹液面处划线标记，-20℃保存，尽早上机检测。后续根据标准样作为对照进行定性定量分析各种脂肪酸组分的质与量。
如表一和表二所示，实施例1生物量有一定程度的提高(比如添加痕量纳米铁元素生物量(3-7天生长培养的10.53-23.1g/L，)比对照生物量(3-7天生长培养的9.12-19.38g/L)),饱和脂肪酸的量有所显著下降(添加组3-7天生长培养的28.6-22.5ug/mg干重对比70.3-108.5ug/mg)，但是，具有高附加值的不饱和脂肪酸的量却显著的有了提升。比如，单不饱和脂肪酸的量从对照组的3-7天生长培养的4.3-8.3ug/mg到添加组的5.6-9.7ug/mg，多不饱和脂肪酸从对照组的3-7天生长培养的73.9-104.5ug/mg到添加组的26.7-44.9ug/mg，DHA含量则从对照组的3-7天生长培养的9.9-15.3ug/mg到添加组的73.9-104.5ug/mg。因此与传统的、以往的技术方法相比，本发明提供了一种培养裸藻的高效、简易添加衡量元素，从而可以使裸藻生长速度加快，更多的生物量积累，油脂和不饱和脂肪酸的含量都有显著性提高，起到大幅度降低生产成本和运行时间周期、以及提高活性物质的质量等等目的。
异养培养基配方，按照重量份的成分：
a)准确称量0.084g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O，溶于10mL去离子水，现用现配。
b)“Metals 60A”配方，按照重量份的成分：
c)Vitamin B1：准确称量0.1g Vitamin B1，溶于100mL去离子水，过滤除菌，存于4℃冰箱。
d)Vitamin B12：避光准确称量0.02g Vitamin B12，溶于1000mL去离子水，取得到的溶液1mL稀释至100mL，过滤除菌，存于4℃冰箱。
表1添加纳米金颗粒(8mg/L)之后在异养培养基中培养不同时间间隔(3,5,7天)生物量的比较,纳米铁-培养三天(nFe-3d)，对照组-培养后三天(CN-3d)
表2添加纳米金颗粒(8mg/L)之后异养培养基中培养不同时间间隔(3,5,7天)脂肪酸主要组分的比较,纳米铁-培养三天(nFe-3d)，对照组-培养后三天(CN-3d)，SFA，MUFA，PUFA分别是饱和脂肪酸，单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸；