1.抗除草剂海带孢子体的制备方法,具体步骤如下:
(1)选取生长中的海带雌配子体品系13号海带雌配子体细胞团,研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团,细胞密度在5×105-2×106个/mL,转化时用60mm的无菌培养皿,将雌配子体细胞均匀平铺滤纸片中部,形成直径2cm左右的圆形轰击圈;
(2)转化载体的来源和质粒DNA的提取,用生工生物小量DNA提取试剂盒提取质粒pBA002-Bar的DNA,用以基因枪轰击后的共培养和目标基因的转化;
(3)基因枪操作技术过程:挡网与材料间距3cm时轰击,轰击压力为1100psi;
(4)共培养与基因转化:向轰击后的品系13号的雌配子体细胞加入步骤(2)中提取的质粒pBA002-Bar的DNA,在11-13℃条件下共培养48小时;然后加入质量浓度为40mg/L的草丁膦,连续培养三周,筛选出转化的雌配子体细胞;
(5)抗除草剂海带孢子体的获得:将抗除草剂的雌配子体与同型非转化体雄配子体细胞进行共培养获得交杂孢子体细胞,经过连续11-13℃低温条件培养,获得抗除草剂的孢子体;
抗除草剂海带孢子体共培养和低温培养的营养液的组成:灭菌海水中添加NaNO3和KH2PO4,灭菌海水中NaNO3的终浓度为8-12mg/L,灭菌海水中KH2PO4的终浓度为0.8-1.1mg/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中选取生长中的海带雌配子体品系13号海带雌配子体细胞团,研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团,细胞密度在1×106个/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中向轰击后的品系13号的雌配子体细胞加入步骤(2)中提取的质粒pBA002-Bar的DNA,在12℃条件下共培养48小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中将抗除草剂的雌配子体与同型非转化体雄配子体细胞进行共培养获得交杂孢子体细胞,经过连续12℃低温条件培养。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中灭菌海水中NaNO3的终浓度为10mg/L,灭菌海水中KH2PO4的终浓度为1.0mg/L。
6.如权利要求1-5任一项所述制备方法制备的抗除草剂海带孢子体。
7.抗除草剂的海带幼小种苗的培育方法,具体步骤如下:
(1)将如权利6所述除草剂海带孢子体的幼胚置于培养液中进行培养;培养液的组成为:灭菌海水中添加NaNO3和KH2PO4,灭菌海水中NaNO3的终浓度为8-12mg/L,NaNO3与KH2PO4的质量比为10:0.8-1.1;培养条件为每两天更换一次培养液,11-12℃低温光照培养箱培养,光照强度为800Lux,培养8-10天,光照培养与暗培养的时间比例为14小时:10小时;
(2)对抗除草剂的海带幼小种苗进行培养,同时进行PCR检测,实施10mg/L、20mg/L、40mg/L梯度条件下的除草剂筛选,测试转化的幼小种苗对除草剂草丁膦的耐性,建立完整的海带抗除草剂孢子体细胞无性繁殖体系。
8.根据权利要求7所述的培育方法,其特征在于,所述步骤(1)中灭菌海水中NaNO3的终浓度为10mg/L。
9.根据权利要求7所述的培育方法,其特征在于,所述步骤(1)中NaNO3与KH2PO4的质量比为10:1。