一种鉴别铁皮石斛的方法及其使用的PCR引物与流程

本发明涉及基于叶绿体DNA序列单核苷酸差异位点鉴别铁皮石斛的方法，具体涉及一种鉴别铁皮石斛的方法及其使用的PCR引物。
背景技术：
：铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)又名黑节草，是兰科(Orchidaceae)多年生附生草本植物，为我国名贵中药材，含多糖、生物碱、多种人体必需的微量元素和氨基酸，另外还有酮类、酯类、芪类、酚、醇等，具有益胃生津、滋阴清热的功效，主要分布于我国广西、云南、浙江、福建、安徽等地。铁皮石斛在民间被称为“救命仙草”、“寸金草”，治疗和养生效果显著，由于铁皮石斛非常名贵，由于人为过度采挖和生境破坏严重，加之铁皮石斛生境独特、繁殖困难，早在1987年，铁皮石斛就被列入《国家重点保护野生药材物种名录》，因濒危、珍稀、药用价值和附加值高，铁皮石斛的高效种植及产业开发发展态势强劲。据中国植物志记载，我国有石斛属植物76种(包括74个种,2个变种)，另据报道，石斛属植物中有药用价值的有50多种,但由于石斛属植物来源众多、产地各异，同名异物与同物异名情况十分严重，大多数石斛属植物在未开花时，或在加工成药材（干燥茎、枫斗等）时，其形态特征相似，非专业人士难以辨别；种植铁皮石斛的难度高，资金投入大，产量也比较低，且铁皮石斛市场需求量大，价格昂贵，导致刚节石斛、白平头、水草石斛、紫皮石斛、岩珠石斛等石斛属的伪劣产品充斥市场，严重影响了铁皮石斛产业的健康可持续发展。为控制铁皮石斛药材的质量，确保铁皮石斛产品的药效，寻找一种高效准确的铁皮石斛鉴别方法具有重要的意义。目前，铁皮石斛的鉴别方法主要有性状鉴别法、横切面显微鉴别法、薄层色谱法、指纹图谱结合柚皮素含量法、红外光谱法、分子标记法等。传统以性状、显微为主的鉴别由于受鉴别者的经验、个体差异等因素的影响，实际工作中较难把握和传授；指纹图谱结合柚皮素含量法、红外光谱法鉴别法易受铁皮石斛原料的产地、铁皮石斛生长的环境条件等影响，稳定性较差。技术实现要素：本发明提供一种鉴别铁皮石斛的方法及其使用的PCR引物，以解决上述问题。本发明采用如下技术方案：一种鉴别铁皮石斛的方法，包括以下步骤：Ⅰ.提取待测样品DNA；Ⅱ.加入引物，以所述待测样品DNA为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；所述引物包括鉴别其它石斛的特异性正向内引物以及鉴别铁皮石斛的特异性反向内引物，该其它石斛为石斛属中与铁皮石斛叶绿体ACCD基因序列单核苷酸差异位点处正义链碱基为T的除铁皮石斛外的任一石斛品种；其中：ⅰ.鉴别其它石斛的特异性正向内引物的核苷酸序列为：5´-GTCTCTATGGACCCCATT-3´；ⅱ.鉴别铁皮石斛的特异性反向内引物的核苷酸序列为：5´-CCTCCTCTGAATGAAAGTCT-3´；Ⅲ.以1%琼脂糖凝胶电泳检测10μL上述扩增产物获取鉴别结果。进一步地：上述步骤Ⅱ的上述引物还包括正向外引物以及反向外引物，正向外引物的核苷酸序列为：5´-TGACATTTACAGTGGTATCG-3´，反向外引物的核苷酸序列为：5´-CATACTACCTCCCATAAACTG-3´。上述步骤Ⅲ中的上述鉴别结果的判断为：若出现499bp大小的阳性对照的外引物条带及362bp大小的阳性条带，则表示该样品为铁皮石斛;若出现499bp大小的阳性对照的外引物条带及174bp大小的阳性条带，则表示该样品为其它石斛。上述步骤Ⅱ的上述PCR扩增中加入的上述模板体积为1μL；该PCR扩增中加入的四种上述引物的体积均为0.5μL，四种引物的浓度均为10μmol/L。上述PCR扩增中还加入2.5μL的10×TaqPlusBuffer、4μL的浓度为2.5mmol/L的dNTPMix以及0.25μL的浓度为2.5U/μL的TaqPlus，然后加入双蒸水至总体积为20μL。上述PCR扩增的反应流程为：a.94℃预变性4min，94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s；b.重复步骤a，完成35个循环；c.72℃延伸10min。一种用于鉴别铁皮石斛的PCR引物，包括鉴别其它石斛的特异性正向内引物以及鉴别铁皮石斛的特异性反向内引物，其中：ⅰ.鉴别其它石斛的特异性正向内引物的核苷酸序列为：5´-GTCTCTATGGACCCCATT-3´，该其它石斛为石斛属中与铁皮石斛叶绿体ACCD基因序列单核苷酸差异位点处正义链碱基为T的除铁皮石斛外的任一石斛品种；ⅱ.鉴别铁皮石斛的特异性反向内引物的核苷酸序列为：5´-CCTCCTCTGAATGAAAGTCT-3´。进一步地：一种用于鉴别铁皮石斛的PCR引物，还包括正向外引物以及反向外引物，正向外引物的核苷酸序列为：5´-TGACATTTACAGTGGTATCG-3´，反向外引物的核苷酸序列为：5´-CATACTACCTCCCATAAACTG-3´。由上述对本发明的描述可知，和现有技术相比，本发明具有如下优点：第一，本发明的方法鉴别结果准确，具有外引物条带的阳性对照，可避免出现假阴性结果导致错误鉴别，同时，本发明的引物设计时引入错配碱基,极大增强PCR扩增反应的特异性。第二，本发明的鉴别方法更加灵敏，只需少量样品就可完成鉴别。第三，本发明的鉴别方法简单，仅需一步PCR反应和常规琼脂糖凝胶电泳检测，就可获得鉴别结果。第四，本发明对待测样品的要求低，对铁皮石斛鲜品、干品、枫斗、粉末等，只要不破坏铁皮石斛叶绿体DNA的材料，均可鉴别。附图说明图1为本发明的鉴别方法的原理示意图。图2为本发明的鉴别方法实施结果示意图。具体实施方式下面参照附图说明本发明的具体实施方式。本具体实施方式中，待测样品为福建省三明市农科院采集自福建泰宁的野生铁皮石斛以及采集自福建沙县湖源乡的野生细茎石斛，以上材料经福建农林大学魏道智教授鉴定为铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）和细茎石斛（Dendrobiummoniliforme(L.)Sw.）的原植物。一种鉴别铁皮石斛的方法，包括以下步骤：一、提取待测样品DNA；采用改良CTAB小量法提取铁皮石斛和细茎石斛叶片总DNA。取幼嫩叶片0.1g，加液氮研磨至粉末状，转移至2mL离心管中；加800µL70℃预热的提取缓冲液，振荡混匀，于70℃水浴5～10min，期间不时轻摇；加入400µL氯仿，颠倒混匀3～5min；在4℃下12000×g离心5min，弃上清，用75%预冷的乙醇漂洗2次；晾干，加入50µLddH2O，常温下溶解；于-20℃保存备用。二、引物设计；根据铁皮石斛和其它石斛叶绿体ACCD基因的SNP位点处及SNP位点的上下游的保守区域内，分别设计特异性引物，引物由深圳华大基因科技服务有限公司进行合成，引物类型及序列见表1。表1引物类型和核苷酸序列引物类型引物名称引物序列（5'-3'）正向外引物ACCDSNP-F5´-TGACATTTACAGTGGTATCG-3´反向外引物ACCDSNP-R5´-CATACTACCTCCCATAAACTG-3´鉴别其它石斛的正向内引物SPSNPT1-F5´-GTCTCTATGGACCCCATT-3´鉴别铁皮石斛的反向内引物SPSNPA2-R5´-CCTCCTCTGAATGAAATTCT-3´鉴别其它石斛的正向内引物（含错配碱基）MSSNPT1-F5´-GTCTCTATGGACCCAATT-3´鉴别铁皮石斛的反向内引物（含错配碱基）MSSNPA2-R5´-CCTCCTCTGAATGAAAGTCT-3´三、PCR扩增；参考图1，以铁皮石斛和细茎石斛总DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：模板DNA1µL；4种不同引物（包括正向外引物、反向外引物、鉴别其它石斛的正向内引物、鉴别铁皮石斛的反向内引物）各0.5μL（10μmol/L）；10×TaqPlusBuffer2.5μL，dNTPMix4μL（2.5mmol/L）；TaqPlus0.25μL（2.5U/μL）；加ddH2O至总体积为20µL。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。四、琼脂糖凝胶电泳检测；参考图1、图2，取10μLPCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，可以看出采用本发明所用引物（5,6号通道对应的引物）时，铁皮石斛可以扩增出片段为499bp大小的外引物条带及362bp大小的特异性阳性条带，细茎石斛可以扩增出片段为499bp大小的外引物条带及174bp大小的特异性阳性条带（如图2所示），且条带较清晰明显，采用本发明的方法和引物的鉴别结果与实际结果相符合，因此采用本发明采用的鉴别铁皮石斛的方法和使用的PCR引物，可用于快速鉴别铁皮石斛。图2中T代表样品为铁皮石斛，X代表样品为细茎石斛；M为DNAMarkerDM2000；1，2号通道所用引物为ACCDSNP-F、ACCDSNP-R、SPSNPT1-F、SPSNPA2-R；3，4号通道所用引物为ACCDSNP-F、ACCDSNP-R、MSSNPT1-F、MSSNPA2-R；5，6号通道所用引物为ACCDSNP-F、ACCDSNP-R、SPSNPT1-F、MSSNPA2-R；7，8号通道所用引物为ACCDSNP-F、ACCDSNP-R、MSSNPT1-F、SPSNPA2-R。经研究，我们发现不同来源地的铁皮石斛叶绿体DNA的ACCD基因序列非常保守，铁皮石斛与9个石斛属植物包括金钗石斛（登录号KT591465.1）、霍山石斛（登录号KT591465.1）、细茎石斛（登录号KF361526.1）、肿节石斛（登录号KF361526.1）、梳唇石斛（登录号KR673323.1）、美花石斛（登录号KR673323.1）、紫瓣石斛（登录号KF361524.1）、兜唇石斛（登录号KF361568.1）、鼓槌石斛（登录号KF361568.1）的ACCD基因的核苷酸序列间存在一个特异性SNP位点，此位点铁皮石斛正义链碱基均为A(腺嘌呤)，其它石斛均为T(胸腺嘧啶)。针对此SNP位点及石斛属石斛ACCD基因保守序列，设计鉴别铁皮石斛和石斛属其它石斛的特异性引物，通过对特异性引物的碱基序列等的优化，本发明设计的引物保证了本发明所用方法的特异性、灵敏性，最大限度地降低了假阳性率及漏检率。上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。<110>三明市农业科学研究院<120>一种鉴别铁皮石斛的方法及其使用的PCR引物<160>4<170><210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物ACCDSNP-F<222><223><400>1tgacatttacagtggtatcg<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物ACCDSNP-R<222><223><400>2catactacctcccataaactg<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物SPSNPT1-F<222><223><400>3gtctctatggaccccatt<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物MSSNPA2-R<222><223><400>4cctcctctgaatgaaagtct当前第1页1 2 3