政府权利本发明是在政府支持下根据美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的合同号hhsn272200800056c完成的。政府在本发明中享有一定的权利。本发明涉及应用于疫苗接种和基因治疗的药物领域和基因递送领域。更具体地，本发明涉及用于表达两种转基因的具有双向启动子的重组腺病毒和重组腺病毒载体。技术背景重组人腺病毒和动物腺病毒被广泛地应用于基因治疗和疫苗接种中。对于这些应用，腺病毒载体被用作待引入宿主细胞中的感兴趣的一种或多种基因的载体。例如，腺病毒载体可用于表达编码所需抗原以引发免疫应答的基因或其部分。第一代腺病毒载体通常只包括一种转基因。针对这些第一代载体发表了许多策略。已发表的策略报告了各种不同的腺病毒载体的用途，并且显示了转基因表达盒可以被放置在腺病毒的不同区域(例如在e1区域、e3区域中、或在e4和右itr之间)。然而，对于用作疫苗，通常需要多于一种抗原或来自若干不同菌株的相同抗原来实现保护和广泛覆盖。因此，在某些情况下，期望的是由一种腺病毒载体表达至少两种抗原。已经描述了在一种腺病毒载体中编码两种抗原的不同方法。在最早的两种抗原方法中，将一种抗原表达盒放置在e1区域中，并将第二种抗原表达盒放置在e3区域中(例如(vogels等人，2007))。在不同的两种抗原方法中，将一种抗原表达盒放置于e1中并将第二种抗原表达盒放置在e4和右itr之间(例如(holman等人，2007；pham等人，2009；schepp-berglind等人，2007))。在又另外的两种抗原方法中，使用两种不同的启动子序列将两种抗原表达盒以头对尾的方式放置于e1区域中，以试图通过重组来防止遗传不稳定性(例如(belousova等人，2006；harro等人，2009))。已经公开了针对不同的病毒载体(例如慢病毒载体)的多种其他两种抗原方法。实例包括使用双向启动子或使用正链(positive-stranded)rna病毒(例如衍生自emcv)的内部核糖体进入位点(ires)以产生被翻译成两种蛋白质的单一转录物(例如(amendola，venneri，biffi，vigna，和naldini，2005；na和fan，2010))。其他实例包括利用宿主细胞剪接机制或使用衍生自正链rna病毒(如口蹄疫2a序列)或来自其他病毒的等效物的“切割”肽，来产生被切割成两种蛋白质的多蛋白。根据已发表的报告，所有这些策略都可以同样有用和成功。当在一种腺病毒载体中编码两种抗原时，应保持单价载体的几个特征，以使多价载体既可产生又可用于疫苗目的。重要特征包括升级(upscaling)期间的遗传稳定性、载体的大规模生产力、两种抗原的高水平表达和两种抗原的免疫原性。然而，对于大多数已发表的策略，尚未对载体的遗传稳定性和其他特征进行系统分析。本文所述的实验结果显示了，现有技术中所述的用单个重组腺病毒表达两种抗原的方法导致了：a)重组腺病毒升级过程中的遗传稳定性降低(可通过辅助细胞系中的连续传代进行模拟)；b)重组腺病毒的生产力降低(降低将载体升级(upscale)至大的经纯化的批次的可能性)；c)抗原的表达减少；和/或d)一种或多种抗原的免疫原性降低(在小鼠模型中)。这些是明显的缺点，其不支持如现有技术所述地大规模使用重组腺病毒来表达两种抗原。因此，仍然需要提供遗传稳定的重组腺病毒，并以保持两种抗原的免疫原性的方式表达两种抗原。发明概述本发明提供了制备和使用重组腺病毒(rad)和rad载体的方法。rad和rad载体包含两种转基因，其中第一转基因在一个方向上可操作地连接至双向小鼠巨细胞病毒(mcmv)启动子，并且第二转基因在另一个方向上可操作地连接至双向mcmv启动子。本发明的rad在遗传上是稳定的，其中通过pcr分析直到第13代(p13)没有检测到缺失带(deletionband)，从而提供与仅具有单个转基因的rad相当的遗传稳定性。此外，基于转基因表达的facs分析以及有关t细胞和b细胞应答的经表达的抗原的免疫原性的elispot和elisa分析，两种转基因都被有效地表达。因此，确定了具有双向启动子的本发明的rad适用于基因治疗和疫苗应用。本文所附独立权利要求和从属权利要求分别限定了一般和优选实施例，为了简洁起见，将其通过引用并入本文。从下面结合附图的详细描述中，本发明的不同方面的其他优选实施例、特征和优点将变得明显。在一个实施例中，本发明提供了如下重组腺病毒，该重组腺病毒包含在一个方向上可操作地连接至第一转基因并且在相反方向上可操作地连接至第二转基因的双向小鼠cmv(mcmv)启动子。在另一个实施例中，本发明还提供了生产包含第一和第二转基因的重组腺病毒的方法，所述方法包括：制备如下构建体，该构建体包含在一个方向上可操作地连接至第一转基因并且在相反方向上可操作地连接至第二转基因的双向mcmv启动子，并将所述构建体并入重组腺病毒的基因组中。在某些实施例中，重组腺病毒还包含位于该启动子3'和第一转基因5'的内含子以及位于该启动子3'和第二转基因5'的内含子。在某些实施例中，重组腺病毒在e1区域具有缺失，并且在某些实施例中，在该e1区域中包含双向mcmv启动子以及第一和第二转基因，以及任选地内含子。在某些实施例中，所述第一和第二转基因是不同的，并且它们中的至少一种编码抗原。在某些实施例中，两种转基因编码不同的抗原。在某些实施例中，所述腺病毒是人腺病毒血清型35或人腺病毒血清型26。在另一个实施例中，本发明还提供了在细胞中表达至少两种转基因的方法，所述方法包括向细胞提供根据本发明的重组腺病毒载体。在另一个实施例中，本发明还提供了用于诱导针对至少两种抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明的重组腺病毒载体。在另一个实施例中，本发明还提供了包含根据本发明的重组腺病毒的基因组的重组dna分子。在另一个实施例中，本发明还提供包含根据本发明的重组腺病毒和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在某些实施例中，所述药物组合物是疫苗。附图简要说明图1：编码单一转基因的单价rad的设计和测试。(a)具有针对e1区域中的单一基因的表达盒和ψ包装信号的rad的基因设计示意图。(b)用pcr分析在per.包装细胞中传代的病毒的小规模遗传稳定性测试的示意图。传代p13是指超过商业规模3代，这取决于该工艺的细节。(c)显示了针对如下4种不同病毒的e1同一性pcr分析结果：rad35.e1.ebov、rad35.e1.sebov、rad35.e1.marv和rad26.e1.ebov。数字1-5表示来自在per.细胞中传代至p13的五个不同噬斑(病毒种群)的dna。p+是显示pcr带的预期大小的阳性质粒对照，并且p-是显示不具有抗原的表达盒的大小的阴性质粒对照。h2o是pcr的水对照并且m是分子量标记。图2：二价e1-e3rad的设计和测试。(a)rad的遗传设计示意图，所述rad具有第一表达盒(基因1在左侧itr下游的e1区域中)和第二表达盒(基因2在e3区域中)。如(a)中所示，rad35载体在e3区域中具有反向取向。(b)显示了rad35二价载体，rad35.e1.ebov-e3.sebov的第5代(p5)、第10代(p10)和第15代(p15)的e1和e3转基因区域的pcr分析结果。数字1-5表示来自在per.细胞中传代的五个不同噬斑(病毒种群)的dna。p+是显示pcr带的预期大小的阳性质粒对照，并且p-是显示不具有抗原的表达盒的大小的阴性质粒对照。h2o是pcr的水对照并且m是分子量标记。星号表示存在于阳性对照和不同经测试的噬斑二者中的非特异性pcr带。箭头表示缺失带，代表从完全或部分缺失抗原或表达盒的病毒基因组扩增的pcr产物。图3：在e1中具有双顺反子表达盒的二价rad的设计和测试。(a)对编码基因1和基因2(分别包含egfp和荧光素酶、荧光素酶和egfp、或marv和sebov)的rad二价载体使用f2a方法的双顺反子载体示意图。两种抗原，基因1和基因2，均在一个mrna上的e1区域中被编码，并且由hcmv驱动表达。f2a(弗林蛋白酶-2a)部分编码弗林蛋白酶识别位点和衍生自小核糖核酸病毒口蹄疫病毒(fmdv)的2a肽，导致基因1和基因2编码的蛋白质产物的分离。f2a部分的氨基酸序列如前所述((defelipe，luke，brown，和ryan，2010；donnelly等人，2001))。(b)显示了在第13代(p13)具有e1-f2a设计的不同二价rad35的转基因区域的pcr分析结果。数字1-5表示来自在per.细胞中传代至p13的五个不同噬斑(病毒种群)的dna。p+是显示pcr带的预期大小的阳性质粒对照，并且h2o是pcr的水对照，以及m是分子量标记。星号表示存在于阳性对照和不同经测试的噬斑二者中的非特异性pcr带。箭头表示缺失带，代表从完全或部分缺失抗原或表达盒的病毒基因组扩增的pcr产物。(c)显示了蛋白质印迹法，其用于比较在e1中具有双顺反子表达盒的二价rad35载体以及表达相同蛋白质的一价载体的marv和sebov蛋白的表达。以1000、2500和5000vp/细胞用rad35.marv-f2a-sebov、rad35.e1.marv或rad35.e1.sebov感染a549细胞，在48hpi进行收获，并使用marv和sebov特异性一级抗体测试裂解物的marv和sebov蛋白的表达。(d)显示了用facs染色用于分析marv和sebov蛋白的表面表达结果的线形图，以比较二价rad35.marv-f2a-sebov与单价载体的混合物rad35.e1.marv+rad35.e1.sebov。以111、333和1000vp/细胞用rad35.marv-f2a-sebov或rad35.e1.marv+rad35.e1.sebov的混合物感染a549细胞。在48hpi分析表达，并将％阳性细胞比对vp/细胞进行绘图。(e)显示了来自elispot测定的结果，所述测定用以评估用二价rad35.marv-f2a-sebov或单价载体的混合物rad35.e1.marv+rad35.e1.sebov免疫后第8周的小鼠免疫原性。rad35.空是阴性对照。将elispot数据绘制成点形成单位(sfu)/106脾细胞，并且对应于具有不同载体的sebov和marv特异性t细胞应答。(f)显示了elisa测定结果，所述测定用以测量针对以二价rad35.marv-f2a-sebov或单价载体(rad35.e1.marv和rad35.e1.sebov)的混合物(marv+sebov)进行表达的marv和sebov糖蛋白的抗体应答(体液应答、b细胞应答)。rad35.空是阴性对照。elisa数据以对数标尺表示为elisa单位(eu)/ml。对于elispot和elisa测定(e和f)二者，用1x109vp的rad35.e1.marv-mcmv-sebov或者1x109vp的rad35.e1.marv和1x109vp的rad35.e1.sebov对10只balb/c小鼠的组进行肌内(im)接种。为了解释接受总共2x109vp的单个插入组合的组中可能出现的佐剂效应，将1x109vp的ad35.空白载体与rad35.e1.marv-mcmv-sebov共注射。作为阴性对照，两组小鼠(每组五只)共接收2x109vp的ad35.空白。在接种疫苗之前，也将小鼠放血以产生初始对照血清(数据未显示)。图4：具有e1-e1设计的二价rad35载体的设计和测试。(a)使用e1-e1方法的二价载体的原理图设计：e1区域包含两个完整的以头对尾构型的表达盒，其中基因1的表达由人cmv启动子驱动，并且基因2的表达由mcag启动子驱动，选择所述mcag启动子是由于其异源序列和与人cmv启动子相当的效力。具有基因1和基因2的两个表达盒分别含有异源聚腺苷酸化信号pa1和pa2。(b)显示了rad35.e1.mcag.luc-hcmv.egfp和rad35.e1.mcag.marv-hcmv.sebov的转基因区域的pcr分析结果。数字1-5表示来自在per.细胞中传代至p13的五个不同噬斑(病毒种群)的dna。p+是显示pcr带的预期大小的阳性质粒对照，并且p-是显示不具有抗原的表达盒的大小的阴性质粒对照。h2o是pcr的水对照并且m是分子量标记。星号表示pcr背景带并且箭头表示缺失带。(c)显示了蛋白质印迹法，其用于比较用二价rad35.e1.mcag-marv.hcmv-sebov和单价载体rad35.e1.marv或rad35.e1.sebov的表达。以1000、2500和5000vp/细胞用rad35.e1.mcag-marv.hcmv-sebov、rad35.e1.marv或rad35.e1.sebov感染a549细胞，在48hpi进行收获，并使用marv和sebov特异性一级抗体测试裂解物的marv和sebov蛋白的表达。(d)显示了用facs染色用于分析marv和sebov蛋白的表面表达结果的线形图，以比较来自二价rad35.e1.mcag-marv.hcmv-sebov和单价载体的混合物rad35.e1.marv+rad35.e1.sebov的表达。以111、333和1000vp/细胞用rad35.marv-f2a-sebov或rad35.e1.marv+rad35.e1.sebov的混合物感染a549细胞。在48hpi对经感染细胞表面的marv和sebov的存在进行了分析，并将％阳性细胞比对vp/细胞进行绘图。(e)显示了来自elispot测定的结果，所述测定用以评估用二价rad35.e1.mcag-marv.hcmv-sebov或单价载体的混合物rad35.e1.marv+rad35.e1.sebov免疫后第8周的小鼠免疫原性。ad35.空白是阴性对照。将elispot数据绘制成点形成单位(sfu)/106脾细胞，并且对应于具有不同载体的sebov和marv特异性t细胞应答。(f)显示了elisa测定结果，所述测定用以测量针对以二价rad35.e1.mcag-marv.hcmv-sebov或单价载体的混合物(rad35.e1.marv+rad35.e1.sebov)进行表达的marv和sebov糖蛋白的抗体应答(体液应答)。ad35.空白载体是阴性对照。elisa数据以对数标尺表示为elisa单位(eu)/ml。对于elispot和elisa测定(e和f)二者，用1x109vp的rad35.e1.marv-mcmv-sebov或者1x109vp的rad35.e1.marv和1x109vp的rad35.e1.sebov对10只balb/c小鼠的组进行肌内(im)接种。为了解释接受总共2x109vp的单个插入组合的组中可能出现的佐剂效应，将1x109vp的ad35.空白载体与rad35.e1.marv-mcmv-sebov共注射。作为阴性对照，两组小鼠(每组五只)共接收2x109vp的ad35.空白。在接种疫苗之前，也将小鼠放血以产生初始对照血清(数据未显示)。图5：具有三种不同的双向启动子，pbidir1、pbidir2和pbidir3的表达egfp和萤火虫荧光素酶(luc)的二价e1rad35载体的设计和测试。(a)e1中双向表达盒的原理图设计：e1区域包含由双向启动子pbidir1、pbidir2或pbidir3之一驱动的表达盒。在所述表达盒中，将基因1置于反向取向的5'侧并将基因2置于正向取向的3'侧。(b)显示了hek293细胞中荧光素酶和egfp表达水平的条形图，所述hek293细胞被具有三种不同的双向启动子变体(包括在基因1和基因2位置交换的luc和egfp)的radapt35载体瞬时转染。还包括了作为对照的来自单价载体(单独(padapt35.egfp或adapt35.luc)或组合(padapt35.egfp+adapt35.luc)使用时)的荧光素酶和egfp的表达水平。egfp的表达水平显示为平均荧光强度(mfi)并且荧光素酶的表达水平显示为相对光单位(rlu)。(c)显示了a549细胞中荧光素酶或egfp表达水平的条形图，所述a549细胞被具有所选择的pbidir3双向启动子(具有luc和egfp并且在基因1和基因2位置处进行交换)的e1rad35载体感染。还包括了作为对照的来自不具有转基因的空白rad35载体(rad35.空白)和单独使用的单价载体(rad35.egfp或rad35.luc)的荧光素酶和egfp的表达水平。用1000vp/细胞感染a549细胞，并在48hpi测定表达。egfp的表达水平显示为平均荧光强度(mfi)并且荧光素酶的表达水平显示为相对光单位(rlu)。(d)具有侧翼为两个内含子(5'侧的内含子2和3'侧的内含子1)的mcmvie1/ie2的pbidir3双向启动子的示意图。图6：具有针对不同功能性片段的注释的mcmvie1/ie2双向启动子序列的序列。用堆叠在序列上的箭头表示如下方向和具体的功能性片段：mcmvie1/ie2衍生的启动子序列、两个方向上的mie2和mie1增强子、tata框和侧翼为人apoe1衍生的内含子序列和嵌合体内含子序列的转录起始位点(tss)。图7：具有e1双向设计的二价rad35载体的设计和测试。(a)rad35e1双向二价载体的原理图设计：e1区域包含双向表达盒，其中在双向小鼠cmv启动子的控制下用异源聚腺苷酸化信号pa1和pa2表达两种抗原。(b)显示了三个不同rad35.e1双向载体(rad35.e1.egfp-mcmv-luc、rad35.e1.luc-mcmv-egfp和rad35.e1.marv-mcmv-sebov)的转基因区域的pcr分析结果。数字1-5表示来自在per.细胞中传代至p13的五个不同噬斑(病毒种群)的dna。p+是显示pcr带的预期大小的阳性质粒对照，并且p-是显示不具有抗原的表达盒的大小的阴性质粒对照。h2o是pcr的水对照并且m是分子量标记。对于rad35e1双向二价载体，在来自在per.细胞中传代至p13的五个不同噬斑(病毒种群)的病毒dna中没有检测到缺失带。(c)显示了蛋白质印迹法，其用于比较用二价rad35.e1.marv-mcmv-sebov以及单价载体rad35.e1.sebov和rad35.e1.marv的marv和sebov表达。以1000、2500和5000vp/细胞用所指示的载体感染a549细胞，在48hpi进行收获，并使用marv和sebov特异性一级抗体测试裂解物的marv和sebov蛋白的表达。(d)显示了用facs染色用于分析marv和sebov蛋白的表面表达结果的线形图，以比较来自二价rad35.e1.marv-mcmv-sebov和单价载体的混合物(rad35.e1.marv和rad35.e1.sebov)的表达。以111、333和1000vp/细胞用所指示的载体感染a549细胞。通过facs染色在48hpi对经感染细胞表面的marv和sebov的存在进行了分析并显示阳性细胞％。(e)显示了来自elispot测定的结果，所述测定用以评估用二价rad35.e1.marv-mcmv-sebov或两种单价载体(rad35.e1.marv和rad35.e1.sebov)的混合物免疫后第8周的小鼠免疫原性。ad35.空白是阴性对照。将elispot数据绘制成点形成单位(sfu)/106脾细胞，并且对应于具有不同载体的sebov和marv特异性t细胞应答。(f)显示了elisa测定结果，所述测定用以测量针对用二价rad35.e1.marv-mcmv-sebov或两种单价载体(rad35.e1.marv和rad35.e1.sebov)的混合物对小鼠进行免疫后的第8周的marv和sebov糖蛋白的抗体应答(体液应答)。ad35.空白是阴性对照。elisa数据以对数标尺表示为elisa单位(eu)/ml。对于elispot和elisa测定(e和f)二者，用1x109vp的rad35.e1.marv-mcmv-sebov或者1x109vp的rad35.e1.marv和1x109vp的rad35.e1.sebov对10只balb/c小鼠的组进行肌内(im)接种。为了解释接受总共2x109vp的单个插入组合的组中可能出现的佐剂效应，将1x109vp的ad35.空白载体与rad35.e1.marv-mcmv-sebov共注射。作为阴性对照，两组小鼠(每组五只)共接收2x109vp的ad35.空白。在接种疫苗之前，也将小鼠放血以产生初始对照血清(数据未显示)。图8：具有e1双向设计的二价rad26载体的设计和测试。(a)使用e1双向方法的二价rad26载体的原理图设计。(b)显示了二价rad26.e1.marv-mcmv-sebov的转基因区域的pcr分析结果。数字1-5表示来自在per.细胞中传代至p13的五个不同噬斑(病毒种群)的dna。p+是显示pcr带的预期大小的阳性质粒对照，并且p-是显示不具有抗原的表达盒的大小的阴性质粒对照。h2o是pcr的水对照并且m是分子量标记。(c)显示了蛋白质印迹法，其用于比较来自二价rad26.e1.marv-mcmv-sebov和单价载体(rad26.e1.sebov和rad26.e1.marv)的marv和sebov表达。以10000、25000和50000vp/细胞用所指示的载体感染a549细胞，在48hpi进行收获，并使用marv和sebov特异性一级抗体测试裂解物的marv和sebov蛋白的表达。(d)显示了用facs染色用于分析marv和sebov蛋白的表面表达结果的线形图，以比较来自二价rad26.e1.marv-mcmv-sebov和单价载体(rad26.e1.marv和rad35.e1.sebov)的混合物的表达。以100000、20000和800vp/细胞用所指示的载体感染a549细胞。通过facs染色在48hpi对经感染细胞表面的marv和sebov的存在进行了分析。显示阳性细胞的％。(e)显示了来自elispot测定的结果，所述测定用以评估用二价rad26.e1.marv-mcmv-sebov或两种单价载体(rad26.e1.marv和rad26.e1.sebov)的混合物免疫后第8周的小鼠免疫原性。rad26.空白是阴性对照。将elispot数据绘制成点形成单位(sfu)/106脾细胞，并且对应于具有不同载体的sebov和marv特异性t细胞应答。(f)显示了elisa测定结果，所述测定用以测量针对用二价rad26.e1.marv-mcmv-sebov或两种单价载体(rad26.e1.marv和rad26.e1.sebov)的混合物对小鼠进行免疫后的第8周的marv和sebov糖蛋白的抗体应答(体液应答)。rad26.空白是阴性对照。elisa数据以对数标尺表示为elisa单位(eu)/ml。对于elispot和elisa测定(e和f)二者，用1x109vp的rad26.e1.marv-mcmv-sebov或者1x109vp的rad26.e1.marv和1x109vp的rad26.e1.sebov对12只balb/c小鼠的组进行肌内(im)接种。为了解释接受总共2x109vp的单个插入组合的组中可能出现的佐剂效应，将1x109vp的rad26.空白载体与rad26.e1.marv-mcmv-sebov共注射。作为阴性对照，两组小鼠(每组四只)共接收2x109vp的rad26.空白。在接种疫苗之前，将小鼠放血以产生初始对照血清(数据未显示)。发明详述本文所述的是实验结果，表明了与具有表达相同抗原的单个转基因的rad相比，现有技术中所述的用于表达来自一种重组腺病毒(rad)的两种转基因的方法导致rad遗传不稳定性和/或转基因表达降低。在测试了用于解决这些问题的几种不同的新策略后，使用具有置于双向小鼠巨细胞病毒(mcmv)启动子控制下的两种转基因的rad载体鉴定新颖的解决方案。本发明的rad优于现有技术中已经描述的二价rad。具有双向mcmv的二价rad在遗传上是稳定的，其中通过pcr分析直到第13代(p13)没有检测到缺失带(deletionband)，从而提供与仅具有单个转基因的rad相当的遗传稳定性。此外，基于转基因表达的蛋白质印迹法和facs分析以及有关t细胞和b细胞应答的经表达的抗原的免疫原性的elispot和elisa分析，两种转基因都被有效地表达。因此，确定了具有双向启动子的本发明的rad适用于基因治疗和疫苗应用。因此，本发明涉及rad和rad载体、制备和使用rad和rad载体的方法，其中所述rad和rad载体包含双向mcmv启动子和两种转基因，其中第一转基因在一个方向上可操作地连接至所述双向mcmv启动子，并且第二转基因在另一方向上可操作地连接至所述双向mcmv启动子。本发明的rad可以大量或分批生产。rad的“批次”是在单个生产容器中在一次生产运行中生产的组合物，或者可以指存在于单个容器(例如生物反应器、袋、烧瓶、瓶、多剂量小瓶、单剂量小瓶、注射器等)中的组合物中的多个rad颗粒。根据本发明的一批rad或包含根据本发明的rad的组合物优选包含至少107个rad颗粒，并且在某些实施例中包含至少108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018或更多个rad颗粒，多达1020个rad颗粒(例如在单一生产运行中在大规模生物反应器中生产的)。除了rad之外，批次或组合物还可以包含或不包含相关组分。如本文所使用的用于重组腺病毒的术语“重组”意指已被人工修饰的腺病毒，而不是野生型腺病毒，例如重组腺病毒包括一种或多种异源基因或者其部分，以及双向mcmv启动子。如本领域惯例，本文中的序列以5'至3'方向提供。“腺病毒衣壳蛋白”是指在腺病毒的衣壳上的蛋白质，该腺病毒衣壳蛋白参与确定特定的腺病毒的血清型和/或趋向性。腺病毒衣壳蛋白通常包括纤维、五邻体和/或六邻体蛋白。根据本发明的(或“基于”)某种血清型的rad通常包含特定血清型的纤维、五邻体和/或六邻体蛋白，并且优选包含该特定血清型的纤维、五邻体和六邻体蛋白。这些蛋白质通常由rad的基因组编码。某种血清型的rad可以任选地包含和/或编码来自其他腺病毒血清型的其他蛋白质。通过至少依次从野生型衍生，rad“基于”本文使用的腺病毒。这可以通过使用野生型基因组或其部分作为起始材料的分子克隆来实现。也可以使用野生型腺病毒基因组的已知序列来通过dna合成重新产生(部分)基因组，这可以通过在dna合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因艺术公司(geneart)、基斯奎思公司(genscripts)、英杰公司(invitrogen)、欧陆公司(eurofins))使用常规程序执行。因此，作为非限制性实例，包含ad35的六邻体、五邻体和纤维的rad被认为是基于ad35等的rad。将本发明的载体称为rad载体。rad载体的制备在本领域中是熟知的。在某些实施例中，根据本发明的rad载体在腺病毒基因组的e1区域(例如，e1a区域和/或e1b区域)的至少一个必需基因功能上是有缺陷的，e1区域属于病毒复制必需的腺病毒基因组。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在非必须e3区域的至少部分中是有缺陷的。在某些实施例中，该载体在e1区域的至少一个必需基因功能中以及在非必须e3区域的至少部分中是有缺陷的。腺病毒载体可以是“多重缺陷的”，意味着腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或更多个区域的每一个中的一个或多个必需基因功能上是有缺陷的。例如，上述e1缺陷型或e1-/e3-缺陷型腺病毒载体可以进一步在e4区域的至少一种必需基因和/或e2区域(例如，e2a区域和/或e2b区域)的至少一种必需基因上是有缺陷的。腺病毒载体、其构建方法和其繁殖方法是本领域所熟知的，并且被描述于以下文献中：例如，美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191、6,113,913和8,932,607，以及virology[病毒学](thomasshenk，“adenoviridaeandtheirreplication[腺病毒及其复制]”，m.s.horwitz，“adenoviruses[腺病毒]”，分别为第67和68章)，b.n.fields等人(编辑)，第3版，雷文出版社有限公司(ravenpress,ltd.)，纽约(1996)，以及本文提及的其他参考文献。通常，腺病毒载体的构建涉及使用标准分子生物学技术，例如描述于以下文献中的那些：例如sambrook等人，molecularcloning,alaboratorymanual[分子克隆，实验室手册]，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)；watson等人，recombinantdna[重组dna]，第二版，scientificamericanbooks[科学美国人书籍](1992)；以及ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology[现行分子生物学方案]，威利世界科学出版社，纽约(1995)，以及本文提及的其他参考文献。根据本发明的腺病毒属于腺病毒科，并且优选地是属于哺乳动物腺病毒(mastadenovirus)属的一种。它可以是人腺病毒，但还可以是感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3，badv3)、犬腺病毒(例如cadv2)、猪腺病毒(例如padv3或padv5)、或猿猴腺病毒(其包括猴腺病毒和猿腺病毒，如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，腺病毒是人腺病毒(hadv或adhu；在本发明中，如果提及腺病毒但是没有指示物种的情况下，即指人腺病毒，例如简短符号“ad5”表示与hadv5(人腺病毒血清型5)相同)或猿猴腺病毒(如黑猩猩或大猩猩腺病毒(chad、adch或sadv))。已使用人腺病毒进行大多数高级研究，并且根据本发明的某些方面，人腺病毒是优选的。在某些优选实施例中，根据本发明的重组腺病毒是基于人腺病毒。在优选的实施例中，该重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。根据本发明的特别优选的实施例，腺病毒是人腺病毒血清型26、35。这些血清型的优点是在人群中的低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价。rad26载体的制备描述于以下文献中：例如wo2007/104792以及(abbink等人，2007)。ad26的示例性基因组序列发现于基因库登录号ef153474中和wo2007/104792的seqidno:1中。rad35载体的制备描述于以下文献中：例如美国专利号7,270,811、wo00/70071以及(vogels等人，2003)。ad35的示例性基因组序列发现于genbank登录号ac_000019中和wo00/70071的图6中。猿猴腺病毒在人群中通常也具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价，并且已经报道了使用黑猩猩腺病毒载体的大量作品(例如us6083716；wo2005/071093；wo2010/086189；wo2010085984；(bangari和mittal，2006；cohen等人，2002；farina等人，2001；kobinger等人，2006；lasaro和ertl，2009；tatsis等人，2007)。因此，在其他优选的实施例中，根据本发明的重组腺病毒基于猿猴腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些实施例中，重组腺病毒基于猿猴腺病毒类型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或sa7p。上面提到的大多数人和非人腺病毒的序列是已知的，并且对于其他的腺病毒序列，可以使用常规程序获得。根据本发明的重组腺病毒可以是具有复制能力的或复制缺陷的。在某些实施例中，该腺病毒是复制缺陷的，例如，因为它在基因组的e1区域中包含缺失。与野生型腺病毒相比，“e1区域中的缺失”是指在该区域中的缺失，并且指在e1a、e1b55k或e1b21k编码区域中至少之一中的缺失，优选e1a、e1b55k和e1b21k编码区域的缺失。正如本领域技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必需区域的情况下，由这些区域编码的功能必须由菌株反式提供，优选的是由生产细胞提供，即，当e1、e2和/或e4区域的部分或全部从腺病毒中缺失时，这些必须存在于生产细胞中，例如整合到其基因组中，或以所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。这些腺病毒还可以具有在e3区域中的缺失，该缺失对于复制是非必要的，并且因此不必补充此种缺失。可以使用的生产细胞(有时在本领域中以及在本文中也被称为“包装细胞”或“补充细胞”)可以是任何生产细胞，其中可以繁殖所希望的腺病毒。例如，在生产细胞中完成重组腺病毒载体的繁殖，该生产细胞补充了腺病毒中的缺陷。此类生产细胞优选在其基因组中至少具有腺病毒e1序列，并且从而能够补充在e1区域中具有缺失的重组腺病毒。可以使用任何补充e1的生产细胞，如由e1永生化的人类网膜细胞，例如911或per.c6细胞(参见美国专利5,994,128)、e1转化的羊水细胞(参见欧洲专利1230354)、e1转化的a549细胞(参见例如wo98/39411，美国专利5,891,690)、gh329：海拉细胞(gao，engdahl，和wilson，2000)、293等。在某些实施例中，这些生产细胞是，例如，hek293细胞、或per.c6细胞、或911细胞、或it293sf细胞等。对于不是衍生自亚组c或e腺病毒的e1缺陷型腺病毒，优选地是将非亚组c或e腺病毒的e4-orf6编码序列与亚组c的腺病毒(例如ad5)的e4-orf6进行交换。这允许在表达ad5的e1基因的熟知的补充细胞系中此类腺病毒的繁殖，例如像293细胞或per.c6细胞(参见例如(havenga等人，2006)；wo03/104467，通过引用以其全文并入本文)。在替代性实施例中，不需要将异源(例如ad5的)e4orf6区域置于腺病毒载体中，但是需要e1缺陷型非亚组c或e载体在表达e1和相容的e4orf6二者的细胞系(例如，表达来自ad5的e1和e4orf6二者的293-orf6细胞系)中繁殖(参见例如(brough，lizonova，hsu，kulesa，和kovesdi，1996)，该文献描述了293-orf6细胞的产生；(abrahamsen等人，1997；nan等人，2003)每个描述了使用这种细胞系产生e1缺失的非亚组c腺病毒载体)。或者，可以使用从待繁殖的血清型表达e1的补充细胞(参见例如wo00/70071，wo02/40665)。对于在e1区域具有缺失的亚型b腺病毒(如ad35)，优选地是将e1b55k开放阅读框的3'末端保留在腺病毒中，例如pix开放阅读框直接上游的166bp或包含所述166bp的片段，例如pix起始密码子直接上游的243bp的片段(在5'端由ad35基因组中的bsu36i限制性位点标记)，因为pix基因的启动子部分驻留在该区域，这增加了腺病毒的稳定性(参见例如(havenga等人，2006)；wo2004/001032，通过引用并入本文)。本发明的腺病毒中的“异源核酸”(本文中也称为“转基因”)不是天然存在于该腺病毒中的核酸。例如，通过标准分子生物学技术将其引入腺病毒中。在某些实施例中，它可以编码感兴趣的蛋白质或其部分。例如，可以将它克隆至腺病毒载体的缺失的e1或e3区域。在本发明的优选实施例中，将具有在双向mcmv启动子控制下的两个转基因的表达盒置于腺病毒基因组的e1区中。一般地，转基因可操作地连接至表达控制序列。这可以例如通过将编码一种或多种转基因的核酸置于启动子的控制下来完成。许多启动子可用于表达一种或多种转基因，并且是本领域技术人员已知的。如本文所使用的，术语“启动子”或“启动子区域”或“启动子元件”可互换使用，并且是指控制与其有效地连接的核酸序列的转录的核酸序列片段，通常但不限于dna。启动子区域包括足以用于rna聚合酶识别、结合和转录启动的特异性序列。此外，启动子区域可以任选地包括调节rna聚合酶的这种识别、结合和转录启动活性的序列。这些序列可以是顺式作用的或可能对反式作用因子有应答。取决于调节的性质，启动子可能是组成型或调节型。本发明使用双向小鼠cmv启动子(mcmv)以双向方式指导两种不同转基因的转录。还可以添加其他调节序列。术语“调节序列”与“调节元件”在本文中可互换地使用，并且是指核酸片段，典型地但不限于dna，该核酸片段调节与其有效地连接的核酸序列的转录，并且因此作为转录调节子。调节序列通常包含作为转录结合结构域的核酸序列，所述转录结合结构域被转录蛋白和/或转录因子、增强子或阻遏物等的核酸结合结构域识别。例如，调节序列可以包括一个或多个四环素操纵子操纵基因序列(teto)，使得在四环素操纵子阻遏蛋白(tetr)存在下表达被抑制。在不存在四环素下，该tetr蛋白能够结合至teto位点并且阻遏可操作地连接至teto位点的基因的转录。然而，在四环素的存在下，tetr蛋白质中构象变化阻止其结合至操纵基因序列，允许发生可操作连接的基因的转录。在某些实施例中，本发明的rad可以任选地包括与双向小鼠cmv启动子有效地连接的teto，使得在表达tetr蛋白的生产细胞系中产生的rad中一种或多种转基因的表达被抑制。随后，如果将rad引入受试者或不表达tetr蛋白的细胞中，那么将不能抑制表达(参见例如，国际专利申请wo07/073513)。在某些其他实施例中，本发明的rad可以任选地包括cumate基因开关系统，其中表达的调节是通过将阻遏物(cymr)结合至操纵基因位点(cuo)、置于启动子下游进行介导的(参见例如(mullick等人，2006))。如本文所使用的，术语“阻遏物”是指具有抑制、干扰、延迟和/或阻遏重组表达载体的异源蛋白产物的产生的能力的实体(例如，蛋白或其他分子)。例如，通过干扰表达载体中(如在表达盒中)处于适当位置的结合位点。阻遏物的实例包括tetr、cymr、乳糖阻遏物、trp阻遏物、半乳糖阻遏物、λ阻遏物、以及其他本领域中已知的适当的阻遏物。本发明的重组腺病毒包含在一个方向上可操作地连接至第一转基因并且在相反方向上可操作地连接至第二转基因的双向小鼠cmv(mcmv)启动子。双向mcmv启动子已经在欧洲专利号ep1601776中进行了详细描述，并且包括在一个方向上的mcmv即时早期1启动子(ie1)和相反方向上的mcmv即时早期2启动子(ie2)。它还可以包含增强子，例如天然的或其他增强子。双向mcmv启动子的天然增强子包含主要即时早期1(mie1)增强子和mie2增强子。还可以将增强子交换为不是天然存在于mcmvie区域中和/或置于其他位置的其他增强子。优选地，第一方向上的启动子的增强子序列和另一个方向上的启动子不重叠。如本领域技术人员所理解的，启动子处于双向结构中，这意味着两个启动子(即ie1和ie2启动子，一起构成mcmvie双向启动子)都以相反的方向驱动表达，并从两个启动子的中心向外移动到腺病毒基因组的末端。因此，双向启动子将驱动第一转基因朝向腺病毒基因组第一末端和驱动第二转基因朝向腺病毒基因组的另一末端的表达。图5、图7和图8中提供了本发明的rad和rad载体构建体的示意图。图6中提供了代表性双向mcmv启动子的已注释的序列。为包含内含子(seqidno:1)的mcmv双向启动子序列和不含内含子(seqidno:2)的mcmv启动子提供代表性序列。本领域技术人员将意识到mcmvie1和ie2启动子是活性启动子序列(参见例如欧洲专利号ep1601776)，并且可以在所提供的序列中产生突变，并且可以通过常规方法测试所述突变的启动子活性。通常，与所指示的启动子序列具有至少90％同一性的序列(在内含子序列存在的情况下不包括内含子序列)将仍然具有功能活性，并且因此将被认为是双向mcmv启动子。因此，本发明的双向mcmv启动子优选与所指示的启动子序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性(在内含子序列存在的情况下，内含子序列之外)。在某些实施例中，双向mcmv启动子与本文所公开的序列100％相同。术语“可操作地连接(operablylinked)”或“有效地连接(operativelylinked)”在本文中可互换使用，并且是指核酸序列与核苷酸的调节序列(例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列)的功能关系并且表明两个或更多个dna片段结合在一起，使得它们为了预期的目的而一致起作用。例如，核酸序列(通常为dna)与调节序列或启动子区域的有效连接是指dna与调节序列或启动子之间的物理和功能关系，使得通过特异性识别、结合和转录该dna的rna聚合酶从调节序列或启动子启动这种dna的转录。为了优化表达和/或体外转录，可能需要修饰其所表达的细胞类型中核酸或dna表达的调节序列。对这种修饰的期望或需要可以根据经验确定。双向启动子的mcmvie1部分提供比双向启动子的mcmvie2部分更强的表达(如对荧光素酶的测试，约10倍表达水平差异)，并且因此可以将期望具有最高表达的转基因置于双向启动子的mcmvie1部分的控制之下。然而，在表达由双向启动子的任一部分控制的情况下，转基因被有力地表达。如本文所使用的，“被有效表达”或“有效的表达”是指通过不同蛋白质检测技术如蛋白质印迹法或facs分析所测量的表达与来自在hcmv启动子控制下表达单个抗原的单价rad的表达相当或甚至更好。例如，通过facs分析来自本发明的双向mcmv启动子的两种抗原所测定的表达水平优选为来自具有hcmv启动子的单价rad的抗原表达水平的至少60％、70％、80％、90％或95％。在某些实施例中，来自双向mcmv的两种抗原的表达水平是来自具有hcmv启动子的单价rad的抗原表达水平的100％。此外，从rad在hcmv启动子的控制下表达单个抗原可知，该表达足以产生显著的t细胞和b细胞免疫应答。因此，预期由本发明的mcmv双向启动子表达的两种转基因的有效表达对两种转基因产生显著的t细胞和b细胞免疫应答。例如，如果两种转基因在被施用于受试者时编码抗原以引发免疫应答，则有效的表达将产生针对两种抗原的可测量的免疫应答并且该免疫应答优选地与由具有在hcmv启动子控制下表达单个抗原的单个转基因的rad产生的免疫应答相同或更好。术语“编码序列”、“序列编码”或“编码”在本文中可互换使用，并且是指核酸序列，所述核酸序列当被可操作地连接到适当的调节序列上时，将在体外或体内被转录(dna)和翻译(mrna)成多肽。聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素polya信号(us5,122,458)可以存在于这些转基因后面。优选地，每个转基因具有polya信号，并且优选地，第一转基因的polya信号不同于第二转基因的polya信号。在一个实施例中，第一polya信号是sv40polya信号，并且第二polya信号是牛生长激素polya信号。在优选的实施例中，包含内含子的序列位于启动子的下游(3')和第一转基因的上游(5')处，并且包含内含子的另外的序列位于启动子的下游和第二转基因的上游。这些内含子可以相同或不同。如本文所使用的内含子具有本领域已知的正常功能和结构，并且是核酸中的多核苷酸序列，所述核酸不编码蛋白质合成的信息，并且在翻译信使rna之前通过称为剪接的方法被除去。内含子包含剪接供体位点(内含子的5'端，通常是gu序列)和剪接受体位点(内含子的3'末端，通常是ga序列)。图5d中提供了包含内含子的根据本发明的构建体的结构的示意图。提供了包含内含子的mcmv双向启动子序列的代表性序列，如seqidno:1。提供了不包含内含子的mcmv双向启动子序列的代表性序列，如seqidno:2。根据本发明可以使用任何内含子，并且优选地使用相对较短的内含子，以便在病毒载体中不占用太多的空间，这样为重组腺病毒中的转基因保留更多的空间。优选地，在双向启动子的一侧使用第一内含子并且在双向启动子的另一侧使用第二不同的内含子，即每种转基因之前有不同的内含子序列。在某些实施例中，第一内含子是嵌合体内含子，例如具有seqidno:3。在某些实施例中，另外的内含子是人apoa1内含子，例如，具有seqidno:4。本领域技术人员知道许多不同的内含子是可获得的并且可以使用。已知内含子增加了(特别是体内)蛋白质表达。因此，内含子存在的本发明的实施例的优点是转基因的高表达，其对免疫原性或基因治疗非常有用。本文所述实验中的示例性参数之一是免疫原性，其与疫苗应用中的抗原相关。然而，技术人员将立即清楚，转基因表达水平也可能与免疫应答不是其主要目标的转基因(例如，用于基因治疗目的的转基因)相关。因此，可以用期望从单一重组腺病毒载体表达的转基因的任何组合来实践本发明。因此，该转基因的同一性不适合本发明，其适用于包含任何转基因的腺病毒。合适的转基因是本领域技术人员公知的，并且例如可以包括转基因开放阅读框，例如编码具有疗效的多肽的开放阅读框(例如用于基因治疗目的)，或当rad载体用于疫苗接种目的时期望对其产生免疫应答的多肽。特别优选的异源核酸是编码期望对其产生免疫应答的抗原决定簇的感兴趣的基因。这种抗原决定簇也通常称为抗原。当对受试者施用重组腺病毒时，将针对一种或多种抗原产生免疫应答。任何期望的抗原都可以由腺病毒载体编码。在根据本发明的典型实施例中，抗原是来自可能引起疾病或病症的生物体的肽、多肽或蛋白质。因此，在进一步优选的实施例中，所述感兴趣的异源核酸编码免疫原性(或抗原性)决定簇。更优选地，所述免疫原性决定簇是来自细菌、病毒、酵母或寄生虫的抗原。这些生物体引起的疾病通常被称为“传染病”(并且因此不限于会“感染”的生物体，而且还包括进入宿主并引起疾病的那些)。所谓的“自体抗原”，例如肿瘤抗原也构成了现有技术的一部分，并且可以由根据本发明的重组腺病毒中的异源核酸编码。可作为抗原决定簇(或抗原)的非限制性实例是引起疟疾的生物体(如恶性疟原虫)、引起结核病的生物体(如结核分枝杆菌)、酵母或病毒。在其他优选实施例中，可以根据本发明的组合物使用来自如下病毒的抗原：例如黄病毒(例如西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒)、埃博拉病毒、人类免疫缺陷病毒(hiv)和马尔堡病毒。在一个实施例中，所述抗原是来自恶性疟原虫的cs蛋白或其免疫原性部分(例如编码cs的腺病毒载体，参见例如(havenga等人，2006；ophorst等人，2006)；wo2004/055187，以上各项均通过引用以其全文并入本文)。在另一个实施例中，抗原决定簇是一种抗原的蛋白质，或来自结核分枝杆菌的几种抗原的融合蛋白，例如ag85a、ag85b和/或tb10.4蛋白或其一种或多种免疫原性部分(参见这种结核病疫苗病毒的构建和生产，例如wo2006/053871，其通过引用并入本文)。在另一个实施例中，所述抗原决定簇是病毒糖蛋白或其免疫原性部分，例如来自线状病毒(例如埃博拉病毒或马尔堡病毒)的gp(例如(geisbert等人，2011；sullivan等人，2006；sullivan等人，2003))。在另外的实施例中，所述免疫原性决定簇来自hiv蛋白，如gag、pol、env、nef或其变体(关于基于hiv疫苗的腺病毒的实例，参见例如wo2009/026183、wo2010/096561、wo2006/120034、wo02/22080、wo01/02607)。在其他实施例中，所述抗原决定簇是来自流感病毒的ha、na、m或np蛋白或这些中的任何的免疫原性部分(例如(hu等人，2011；zhou等人，2010)；由(vemula和mittal审阅，2010))。在其他实施例中，抗原决定簇是来自麻疹病毒的ha蛋白或其免疫原性部分(例如wo2004/037294)。在其他实施例中，抗原决定簇是狂犬病病毒糖蛋白(例如(zhou，cun，li，xiang，和ertl，2006))。在另外的实施例中，抗原来自呼吸道合胞病毒(rsv)，例如rsvf蛋白(参见例如wo2013/139911和wo2013/139916)、或rsvg蛋白、或两者、或其他rsv蛋白。在其他实施例中，抗原来自另一种病毒，如人乳头瘤病毒或其他病毒等。重组腺病毒可以编码来自相同生物体的两种不同的抗原。重组腺病毒还可以编码来自不同生物体的抗原的组合，例如，来自第一生物体的第一抗原和来自第二生物体的第二抗原。也可以将抗原和例如佐剂编码到相同的腺病毒中，例如，抗原和toll样受体(tlr)激动剂，例如tlr3激动剂，例如dsrna或其模拟物等(例如wo2007/100908)。在某些实施例中，重组腺病毒编码各自在双向mcmv启动子的控制下的两种不同的抗原。在其他实施例中，重组腺病毒编码各自在双向mcmv启动子的控制下的抗原和免疫调节子。在某些实施例中，除了在双向mcmv启动子控制下的第一和第二转基因外，其他异源序列或转基因可存在于重组腺病毒中。本发明还提供了用于生产遗传上稳定的重组腺病毒(其包含当该腺病毒感染靶细胞时各自被有效地表达的第一和第二转基因)的方法，所述方法包括：制备如下构建体，该构建体包含在一个方向上可操作地连接至第一转基因并且在相反方向上可操作地连接至第二转基因的双向mcmv启动子，并将所述构建体并入重组腺病毒的基因组中。这种构建体的制备包括使用如本领域技术人员已知的并且在重组腺病毒
技术领域：
：中通常进行的标准分子克隆方法(参见例如(holterman等人，2004；lemckert等人，2006；vogels等人，2003)；sambrook，fritsch和maniatis，molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]，第二版，1989；currentprotocolsinmolecularbiology[现行分子生物学方案]，ausubelfm等人编辑，1987；methodsinenzymology[酶学方法]系列(学术出版社有限公司)；pcr2:apracticalapproach[pcr2：实践方法]，macphersonmj，hamsbd，taylorgr编辑，1995)，并且在本文中举例说明。双向mcmv启动子具有如上所述的特征，并且可以通过常规方法获得(参见例如欧洲专利号ep1601776)。为方便起见，技术人员可以通过克隆到更小的片段中来操纵腺病毒基因组，例如基因组左边部分的第一部分直到e1区域，以便于操纵和引入质粒形式的转基因以及与第一部分重组时可以产生完整的腺病毒基因组的基因组的其余部分的第二、较大的部分(参见例如wo99/55132)。不同于通过用于表达现有技术中提供的两种转基因的各种替代性方法制备的腺病毒，本发明的rad具有表达两种转基因并保持遗传稳定性的优点。因此，双向mcmv启动子解决了表达两个转基因的腺病毒的遗传不稳定性的问题。为了测量遗传稳定性，rad被拯救并在合适的细胞系(例如辅助细胞系per.)中传代。在某些传代数量下分离病毒dna，并且可以通过以下中的一个或多个分析rad基因组的完整性：pcr分析缺失带存在或不存在、限制性消化rad基因组以确定限制性片段上差异的存在或不存在、和/或对rad基因组或rad基因组的pcr产物进行测序以确定rad序列中突变的存在或不存在。关于本发明的rad，“遗传稳定”是指核苷酸序列不从用于产生rad的质粒转化到后来rad的生产阶段，使得表达两种转基因的rad具有与具有单个转基因(hcmv启动子后面)的相当的rad相同的遗传稳定性，其适合于大规模批量生产。例如，与rad或起始材料的更早期传代数相比，使用侧翼于表达盒的引物的pcr分析不显示缺失片段(带)和/或测序e1、e3和e4区域的pcr产物确认了核苷酸序列不改变。与其他测试方法(如测试单次产生的病毒批次的消化)相比，本研究彻底评估了遗传稳定性。通过以下方式增加测定的灵敏度：分离若干病毒种群(噬斑)并进行扩展传代(extendedpassaging)。扩展传代，结合使用侧翼于表达盒的引物的pcr分析，可以检测使用其他方法可能会被忽略的rad群体中的一小部分缺失突变体。此外，进行测序分析以排除点突变(例如在转基因的开放阅读框中引入终止密码子)的发生。更具体地，由于病毒突变总是呈现为概率事件，所以一个噬斑可能是稳定的，而另一个噬斑可能呈现为缺失带。因此，为了正确评估遗传稳定性，需要测试几种病毒种群(噬斑)。在发生突变的情况下，载体比亲本载体能够更有效地复制，这可能导致突变体形式的产生，这通常仅在本研究中所描述的扩展传代后才能观察到。优选地，本发明的rad的遗传稳定性在所使用的测试系统中可以持续至少多达10代，并且甚至更优选地至少多达13代，使得在大规模生产活动中该病毒足够稳定。根据本发明的方法产生的重组腺病毒可以根据以上针对重组腺病毒所述的实施例进行制备。本发明还提供了在细胞中表达至少两种转基因的方法，所述方法包括向细胞提供根据本发明的重组腺病毒。向细胞提供重组腺病毒可以通过向受试者施用腺病毒，或通过体外或离体引入(例如感染)腺病毒至细胞中来进行。在某些实施例中，本发明提供了用于(例如，通过向受试者施用重组腺病毒)在细胞中表达至少两种转基因的重组腺病毒载体。本发明还提供了用于诱导针对至少两种抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明的重组腺病毒。本发明还提供了根据本发明的、用于诱导针对至少两种抗原的免疫应答的重组腺病毒。本发明还提供了包含本发明的重组腺病毒的基因组的重组dna分子。本领域技术人员将意识到，这也可以是至少两种不同的重组dna分子的组合，所述两种dna分子可以一起形成本发明的单个重组dna分子。这样的分子可用于操纵基因组并产生新颖的重组腺病毒。基因组编码腺病毒复制和在容许细胞中包装所需的蛋白质。针对用于本公开中的数值的术语“约”是指±10％的值。培养生产细胞以增加细胞和病毒数量和/或病毒滴度。进行细胞培养以使其能够代谢、和/或生长和/或分裂和/或产生根据本发明的感兴趣的病毒。这可以通过诸如本领域技术人员公知的方法来实现，并且包括但不限于(例如在合适的培养基中)为细胞提供营养物。合适的培养基是本领域技术人员熟知的，并且通常可以从大量的商业来源获得，或者根据标准方案定制。可以使用分批、分批补料、连续系统等在培养皿、滚瓶或生物反应器中进行培养。培养细胞的合适条件是已知的(参见例如tissueculture[组织培养]，文学出版社，kruse和paterson编辑(1973)，以及r.i.freshney，cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique[动物细胞培养：基本技术手册]，第四版(威利利斯公司，2000，isbn0-471-34889-9))。通常，腺病毒将在培养基中暴露于合适的生产细胞，允许摄取病毒。通常，最佳搅拌速度为约50rpm至300rpm之间，通常为约100rpm-200rpm，例如约150rpm，典型的do为20％-60％，例如40％，最佳ph在6.7和7.7之间，最佳温度在30℃和39℃之间，例如34℃-37℃，并且最佳moi在5和1000之间，例如约50-300。通常，腺病毒自发感染生产细胞，并促使生产细胞与rad颗粒接触，足以感染这些细胞。通常，向培养基中添加腺病毒种子原料以引发感染，并且随后腺病毒在生产细胞中繁殖。这对于本领域技术人员来说都是常规的。在感染腺病毒后，病毒在细胞内复制，并且从而被扩增，该过程在本文中被称为腺病毒的繁殖。腺病毒感染最终会导致被感染细胞的溶解。因此，腺病毒的溶解特性允许两种不同的病毒生产模式。第一种模式是在细胞溶解(使用外部因素来溶解细胞)之前收获病毒。第二种模式是在细胞被产生的病毒(几乎)完全溶解后收获病毒上清液(参见例如美国专利6,485,958，其描述了通过外部因素在不溶解宿主细胞情况下收获腺病毒)。优选地使用外部因素来以保持活性的方式溶解细胞以收获腺病毒。可用于活性细胞裂解的方法是本领域技术人员已知的，并且已描述于例如wo98/22588(第28-35页)中。在这方面有用的方法是例如冻融、固体剪切、高渗和/或低渗溶解、液体剪切、超声处理、高压挤出、洗涤剂溶解、上述组合等。在本发明的一个实施例中，使用至少一种洗涤剂溶解细胞。使用洗涤剂用于溶解的优点在于它是一种简单的方法，并且易于扩展。可以使用的洗涤剂及其使用方式是本领域技术人员通常已知的。例如在wo98/22588(第29-33页)中讨论了若干实例。洗涤剂可以包括阴离子、阳离子、两性离子和非离子洗涤剂。洗涤剂的浓度可以变化，例如在约0.1％-5％(w/w)的范围内。在一个实施例中，所用的洗涤剂是tritonx-100。核酸酶可用于去除污染物(即主要来自生产细胞，核酸)。适用于本发明的示例性核酸酶包括或本领域中通常使用的任何其他脱氧核糖核酸酶和/或核糖核酸酶。在优选的实施例中，核酸酶是其通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键来快速水解核酸，从而降低细胞溶解产物的粘度。可以从德国默克集团(merckkgaa)(代码w214950)商购获得。使用了核酸酶的浓度优选在1-100单位/ml的范围内。可替代地，或除了核酸酶处理之外，还可以使用选择性沉淀剂(例如多巴胺溴化物)在腺病毒纯化期间选择性沉淀宿主细胞dna，使其远离腺病毒制剂(参见例如us7,326,555；(goerke，to，lee，sagar，和konz，2005)；wo2011/045378；wo2011/045381)。用于从生产细胞的培养物中收获腺病毒的方法已经广泛描述于wo2005/080556中。在某些实施例中，进一步纯化收获的腺病毒。腺病毒的纯化可以在几个步骤中进行，所述步骤包括澄清、超滤、渗滤或用如通过引用并入本文的例如wo05/080556中所述的色谱分离。澄清可以通过过滤步骤进行，从细胞溶解产物中除去细胞碎片和其他杂质。使用超滤来浓缩病毒溶液。使用超滤器的渗滤或缓冲液交换是用于除去和交换盐、糖等的一种方式。本领域技术人员知道如何找到针对每个纯化步骤的最佳条件。还有wo98/22588(其全部内容通过引用并入本文)描述了用于生产和纯化腺病毒载体的方法。这些方法包括让宿主细胞生长、用腺病毒感染宿主细胞、收获和溶解宿主细胞、浓缩粗溶解产物、更换粗溶解产物的缓冲液、用核酸酶处理溶解产物、以及使用色谱法进一步纯化病毒。优选地，纯化采用至少一个例如wo98/22588(第61-70页)中所讨论的层析步骤。已经描述了用于进一步纯化腺病毒的许多方法，其中色谱步骤包括在所述方法中。本领域技术人员将了解这些方法，并且可以改变采用色谱步骤的确切方式以优化所述方法。例如可以通过阴离子交换层析步骤纯化腺病毒，参见例如wo2005/080556。已经描述了许多其他腺病毒纯化的方法，并且在技术人员的可及范围内。生产和纯化腺病毒的其他方法披露在例如wo00/32754、wo04/020971、us5,837,520、us6,261,823和wo2006/108707中，所有这些都通过引用并入本文。针对向人类施用，本发明可以使用包括rad和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该载体或赋形剂以所采用的剂量和浓度不会在它们所施用的受试者中引起任何不必要或不良的影响。这些药学上可接受的载体和赋形剂是本领域公知的(参见remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿药物科学]，第18版，a.r.gennaro编辑，马克出版公司[1990]；pharmaceuticalformulationdevelopmentofpeptidesandproteins[肽和蛋白质的制药配方开发]，s.frokjaer和l.hovgaard编辑，taylor和francis[2000]；以及handbookofpharmaceuticalexcipients[药用辅料手册]，第3版，a.kibbe编辑，英国医药出版社[2000])。尽管还可以运用冻干制品，但该纯化的rad优选地是作为无菌溶液进行配制和施用。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液接着冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的ph值一般在ph3.0到9.5的范围内，例如ph5.0到7.5。该rad通常是在具有合适缓冲液的溶液中，并且该rad的溶液还可以包含盐。任选地，稳定剂(如白蛋白)可以存在。在某些实施例中，添加清洁剂。在某些实施例中，rad可以被配制为可注射制剂。这些配制品包含有效量的rad(为无菌液体溶液、液体悬浮液或冻干形式)并任选地包含稳定剂或赋形剂。也可以雾化腺病毒疫苗用于鼻内给药(参见例如wo2009/117134)。例如，腺病毒可以存储于缓冲液中，所述缓冲液还可以用于腺病毒世界标准(hoganson等人，2002)：20mmtrisph8，25mmnacl，2.5％甘油。适用于向人类给予的另一种有用的配制品缓冲液是20mmtris、2mmmgcl2、25mmnacl、蔗糖10％w/v、聚山梨酯-800.02％w/v。适用于重组腺病毒的另一种配制品缓冲液包括10mm-25mm柠檬酸盐缓冲液ph5.9-6.2，4％-6％(w/w)羟丙基-β-环糊精(hbcd)、70mm-100mmnacl、0.018％-0.035％(w/w)聚山梨酯-80、以及任选地包括0.3％-0.45％(w/w)乙醇。显然，可以使用许多其他缓冲液，并且已知适合用于储存和药物施用经纯化的(腺)病毒制剂的配制品的几个实例，包括可以在以下文献中发现的：欧洲专利号0853660，美国专利6,225,289和国际专利申请wo99/41416、wo99/12568、wo00/29024、wo01/66137、wo03/049763、wo03/078592、wo03/061708。在某些实施例中，包括腺病毒的组合物进一步包含一种或多种佐剂。佐剂是本领域已知的，以进一步增加对所用抗原决定簇的免疫应答，并且包含腺病毒和合适佐剂的药物组合物例如在wo2007/110409中公开，其通过引用并入本文。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，用佐剂来增强对本发明腺病毒载体的免疫应答。合适的助剂的实例包括铝盐,如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如mf59(参见例如wo90/14837)；皂苷配制品，例如像qs21和免疫刺激复合物(iscoms)(参见例如us5,057,540、wo90/03184、wo96/11711、wo2004/004762、wo2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质a(mpl)、3-o-脱酰基mpl(3dmpl)、含cpg基序的寡核苷酸、adp-核糖基化细菌毒素或其突变体(例如大肠杆菌热不稳定肠毒素lt、霍乱毒素ct等)。也可以例如通过使用编码c4结合蛋白(c4bp)的寡聚化结构域与感兴趣的抗原的融合的异源核酸(ogun，dumon-seignovert，marchand，holder，和hill，2008)，或编码toll样受体(tlr)激动剂(例如tlr3激动剂，如dsrna(参见例如wo2007/100908)等)的异源核酸，使用载体编码的佐剂。根据本发明的这种rad可以例如编码在双向启动子的一侧上的感兴趣的抗原以及在双向启动子的另一侧上的tlr3激动剂。这种rad特别适用于通过粘膜途径给药，例如，口服给药(参见例如wo2007/100908)。在某些实施例中，本发明的组合物包含作为佐剂的铝，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为0.05mg-5mg，例如每剂量铝含量为0.075mg-1.0mg。在其他实施例中，这些组合物不包括佐剂。在某些实施例中，根据本发明的药物组合物可以是疫苗。可以将腺病毒组合物施用于受试者，例如人类受试者。在一次给药期间向受试者提供的腺病毒的总剂量可以如技术从业人员已知的有所改变，并且通常是在1x107病毒颗粒(vp)和1x1012vp之间，优选地是在1x108vp和1x1011vp之间，例如在3x108vp和5x1010vp之间，例如在109vp和3x1010vp之间。可以使用标准给药途径进行腺病毒组合物的施用。非限制性实施例包括不经肠给药，如通过注射，如皮内、肌内等，或者皮下或经皮、或粘膜给药，例如鼻内、经口等。在一个实施例中，通过肌内注射施用组合物，例如向手臂的三角肌、或大腿的股外侧肌。本领域的技术人员已知施用组合物(如疫苗)以诱发对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答的不同的可能性。如本文中涉及的受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、或非人类灵长类动物或人类。优选地，该受试者为人类受试者。还可以提供一种或多种腺病毒疫苗的一次或多次加强施用。如果执行加强疫苗接种，那么典型地，此类加强疫苗接种将在该组合物第一次施用于受试者(在这些情况下这被称为“初次疫苗接种”)后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的一个时刻施用于相同的受试者。在可替代性加强方案中，还可以向受试者施用不同的载体，例如一种或多种不同血清型的腺病毒，或其他载体，例如mva、或dna、或蛋白，作为初次或增强疫苗接种。在括号中的不同出版物(可以包括专利、公开申请、技术文章和学术文章)在整个说明书中被引用，并且在说明书结尾处可以找到每个出版物的完整引用。这些引用的出版物中的每一篇通过引用以其全部内容结合于本文中。通过参考以下实例进一步说明本发明的其他实施例、特征和优点。这些实例不以任何方式限制本发明。它们仅仅用以阐明本发明。实例无需进一步描述，据信本领域中的一般技术人员可使用先前描述及以下说明性实例制造且利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实例具体指出了本发明的某些实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本披露的其余部分。[比较]实例1：单价、无复制能力的rad35和rad26载体的制备和表征产生含有线状病毒糖蛋白的e1衔接子质粒将针对马尔堡病毒安哥拉(marv)(登录号q1pd50)、埃博拉病毒扎伊尔菌株马英嘉(ebov)(具有t544i突变的登录号aan37507.1)和埃博拉病毒苏丹古鲁(sebov)(具有g2的登录号yp_138523)的线状病毒糖蛋白编码基因进行基因优化以用于人类表达，并使用限制性位点hindiii和xbai将其克隆到padapt35或padapt26质粒(vogels等人，2007；abbink等人，2007)中。kozak序列(5’gccacc3’)直接包含于atg起始密码子的前面，并且将两个终止密码子(5’tgataa3’)添加至编码序列的末端。如本文所述，重组腺病毒和载体通常被称为rad或rad载体，并且更具体地称为rad35或rad26。细胞培养：将per.细胞(fallaux等人，1998)保持在含有补充有10mmmgcl2的10％胎牛血清(fbs)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(dmem)中。腺病毒生成、感染和传代。所有腺病毒均通过同源重组在per.细胞中产生并如前所述地被生产(对于rad35：(havenga等人，2006)；对于rad26：(abbink等人，2007))。简言之，根据制造商(美国生命技术公司(lifetechnologies))提供的说明书使用脂质体转染，用编码质粒的rad载体转染per.细胞。为了拯救携带线状病毒糖蛋白转基因表达盒的rad35载体，使用padapt35质粒和pwe/ad35.pix-ritr.de3.5orf6粘粒，而对于rad26载体，使用padapt质粒和pwe.ad26.de3.5orf6粘粒。在达到完全的细胞病变效应(cpe)后一天收获细胞，冻融，在3,000rpm下离心5min，并且存储在-20℃下。接下来，将病毒进行噬斑纯化并且在培养于多孔24组织培养板的单孔中的per.中进行扩增。在使用t25组织培养瓶培养的per.中进一步进行扩增。腺病毒载体在per.细胞中的遗传稳定性检测。进行疫苗载体的遗传稳定性测试以确保生产过程中的遗传稳定性，其涉及如图1b中所示的per.细胞中的几次传代。如上所述地实现了重组疫苗载体的产生、噬斑纯化和扩大至t25形式。简言之，通过在e1补充细胞系per.中进行质粒转染产生重组病毒并进行噬斑纯化。选择5种噬斑用于从多孔24(mw24)升级至t25烧瓶(rad35p3/rad26p4)。随后，以t25形式感染新的per.细胞直到病毒传代至13代(rad35p13/rad26p13)。使用预定感染体积进行病毒的繁殖，该感染体积在感染后2天将产生完全细胞病变效应，回顾性地确定了rad35的比例(病毒颗粒/细胞)为50并且rad26为900。从p13材料中分离病毒dna，并通过pcr分析测试完整转基因表达盒的存在。疫苗载体在per.细胞中繁殖至第13代。繁殖是以感染后两天给予完全cpe的方式进行的。在完全cpe后2天收获rad35病毒，而在完全cpe后一天收获rad26病毒。在第2代、第5代、第10代和第13代分离病毒dna，并且通过使用侧翼于转基因表达盒的引物的pcr分析来测试不存在缺失。不存在缺失突变体由以下参数定义：pcr产物的带大小对应于阳性对照(用于病毒拯救的质粒的pcr产物)，在预期的pcr产物之下没有另外的带(除非另外的带显示为非特异性pcr产物，因为它们也存在于阳性对照中)，批准的测定：pcrh2o对照中没有带。为了进一步确认遗传稳定性，对表达盒和一些噬斑的侧翼区域的pcr产物进行测序。已知使用如图1a中所示的遗传设计的单价rad.e1或单插入载体在大规模制造中具有遗传稳定性，所述大规模制造涉及用于在生产细胞系(例如per.细胞)中升级的若干繁殖步骤。为了模拟大规模生产临床试验或商业规模材料所需的这些繁殖步骤，通过在per.细胞中转染来产生腺病毒载体，并通过噬斑纯化来分离病毒克隆。每种病毒选择五个噬斑，并将病毒种群在接种于t25烧瓶中的per.细胞中连续传代。相比于仅测试一个批次的遗传稳定性，平行地连续传代五个噬斑至p13，可以更有效地评估rad基因组的稳定性。鉴于多种原因，评估rad载体的基因组稳定性的这种特定方法更有价值。第一个原因是与仅评估一个rad克隆相比，观察rad基因组的几个克隆的附加决议。通过将若干rad克隆连续传代直至或甚至超过p13来进一步增加测定的效力，所述效力不能与仅观察“一个”批次的遗传稳定性相比较。然后主要是因为如下事实：在某些情况下批次可以以“低”传代数产生。最后但同等重要的是，通过使用侧翼于e1表达盒的引物的pcr分析已传代的rad基因组增加了测定的灵敏度，并可以检测出rad群体中的小缺失突变体，这些可能被病毒dna的限制性酶消化所忽略。证实了rad35.e1.ebov、rad35.e1.sebov、rad35.e1.marv和rad26.e1.ebov在第13代(p13)都是稳定的，通过pcr分析没有测定出缺失带(图1c)。应该注意的是，对于所有的4种病毒，实际测试了10个噬斑，但在图1c中针对每种病毒只显示了5个噬斑。将单价rad35.e1和rad26.e1载体的遗传稳定性结果用作二价腺病毒载体的遗传稳定性检测的基准。[比较]实例2：使用e1-e3策略来制备和表征rad35和rad26二价载体作为产生二价腺病毒载体的已发表的策略的第一个实例，如图2中所示地测试e1-e3策略。图2a显示了针对rad35和rad26载体二者所产生的病毒载体的遗传设计，其中一个表达盒被放置在e1区域中，并且另外的表达盒被放置在e3区域中。如图2a所示，以反向取向产生rad35e3盒。e1和e3两个盒都含有相同的人cmv启动子，但具有异源的聚腺苷酸化信号(vogels等人，2007)。作为第一病毒载体，通过在per.细胞中进行转染来制备编码衍生自埃博拉病毒扎伊尔(ebov)和埃博拉病毒苏丹古鲁(sebov)的线状病毒糖蛋白的rad35.e1.ebov-e3.sebov，进行噬斑纯化，并且在第5代(p5)、第10代(p10)和第15代(p15)，针对每种病毒选择5个噬斑进行遗传稳定性测试。图2b显示了在p5、p10和p15进行的多次同一性pcr的结果。在p10的5个噬斑中的3个中，在e1/e3同一性pcr中检测到缺失带。在p15，所有经测试的噬斑的大多数病毒群体显示出e3中表达盒的部分缺失。为了测试所用抗原或特异性抗原组合的抗原的效果，拯救了若干其他e1-e3二价腺病毒载体并测试其遗传稳定性。表1显示，所有列出的e1-e3二价腺病毒载体都可以被拯救，然而基于pcr分析，所有经测试的载体在遗传上均不稳定。总共有六个rad35.e1-e3修饰的载体被成功拯救，然而，如通过e3同一性pcr所测试的，所有的都显示出遗传不稳定性。相比之下，含有e1和e3中的线状病毒糖蛋白或者线状病毒糖蛋白和egfp的两种经测试的rad26e1.e3修饰的载体在繁殖效率方面受到严重损害，并且因此难以扩展。当用同一性pcr测试时，两种载体都显示出遗传不稳定性。观察到表达两种线状病毒糖蛋白的二价载体和表达一种线状病毒糖蛋白和egfp的二价载体的这种遗传不稳定性。因此，观察到的遗传不稳定性不能归因于毒性诱导的选择压力。结论是，尽管较早的文献报道表明它们适合于大规模生产，但是如图2所示的rad26和rad35中的e1-e3-反向二价策略不适于大规模生产二价腺病毒载体。可能的解释是，较早的文献报道是基于有限的测试，并且遗传稳定性没有如这里所述地进行严格和系统地分析。特别地，应当注意，如在本研究中所使用的在使用侧翼于表达盒的引物扩展传代后为测量遗传稳定性而进行pcr分析，增加了测定的灵敏度，并可以检测出使用其他方法(如rad基因组的限制性消化)可能被忽略的rad群体中的小缺失突变体。最近报道的在rad5中使用异源启动子的e1-e3反向策略在这些载体的可拯救性方面描述了相似的结果(small等人，2014)。它们的结果表明，在顺时针5'-3'方向插入具有异源启动子的表达盒无法拯救。然而，以逆时针3'-5'方向插入的相同表达盒产生可以在hek293细胞中被拯救的载体。一些载体的遗传稳定性也通过在hek293细胞上第一次和第十次传代后对病毒基因组进行的限制性酶消化和凝胶电泳来显示。[比较]实例3：具有e1中的双顺反子表达盒的二价rad35载体的制备和表征测试e1-f2a策略(图3a中所示)作为产生二价腺病毒载体的第二策略。为此，将两种基因克隆在人cmv启动子下游的e1区域中，由弗林蛋白质识别位点和衍生自口蹄疫病毒的自切割2a肽分离，导致正在被核糖体跳过(ribosome-skipping)分离的mrna转录物的转录(donnelly等人，2001；szymczak等人，2004)。在per.中产生三种不同的病毒rad35.e1.egfp-f2a-luc、rad35.e1.luc-f2a-egfp和rad35.e1.marv-f2a-sebov并繁殖其至第13代。在per.c6细胞中繁殖三种不同病毒的5个噬斑，并通过pcr分析测试其遗传稳定性。第10代的病毒显示在遗传上是稳定的(数据未显示)，但是在第13代(p13)，rad35.e1.marv-f2a-sebov的噬斑中的2个显示非常微弱的缺失带(图3b)。在高度过度曝光的琼脂凝胶照片中更清楚地看到了这些缺失带，证实了这些病毒种群的一部分通过p13部分缺失了二价表达盒。与先前测试的e1-e3二价策略相比，e1-f2a病毒载体在遗传上更稳定，其一直到第10代都没有缺失带，并且可以有效繁殖。因此，为了允许进一步评估具有双顺反子e1-f2a设计的病毒，特别是评估两种转基因的表达水平和免疫原性，使用产生的ad35.e1.marv-f2a-sebov病毒的t25材料接种t175组织培养瓶。使用3ml至5ml的t175粗溶解产物来接种含有70％融汇层的per.细胞的20×t175三层组织培养瓶。然后使用两步cscl纯化方法纯化病毒，并将纯化的病毒以等分试样储存在-85℃。此外，使用tav序列，衍生自thoseaassigna病毒并表达egfp和荧光素酶的2a序列，产生病毒载体rad35.e1.egfp-tav-luc、rad35.e1.luc-tav-egfp。通过蛋白质印迹法进行的表达分析显示了与针对f2a构建体所观察到的相似的表达上的降低。遗传稳定性测试也显示出与f2a构建体相当的结果。没有继续使用这种方法。对于基因治疗和疫苗应用二者，编码的转基因的有效表达是先决条件，例如，为了使疫苗具有足够的免疫原性，需要充分表达转基因(抗原)以刺激t细胞和/或b细胞应答。由于如图1中所示的单插入疫苗载体在几种动物模型和人类中具有高免疫原性，因此将这些单插入载体用作体外测定中有效表达的基准。以每细胞1000个、2500个和5000个病毒颗粒(vp/细胞)用cscl纯化的疫苗载体感染a549细胞。通过蛋白质印迹法使用转基因特异性一级抗体分析转基因表达。图3c显示了与rad35.marv或rad35.sebov的相同vp/细胞相比，rad35.e1.marv-f2a-sebov载体驱动的两种已编码的转基因的转基因表达降低。由于线状病毒糖蛋白(gp)、marv和sebov是表面跨膜蛋白，正确的翻译后修饰和运输被认为对于免疫原性是重要的。因此，在facs细胞表面表达测定中测试rad感染的细胞的细胞表面上的表达。为此，用表达marv和sebov二者的二价rad35.e1.marv-f2a-sebov感染a549细胞并且用两种单价载体rad35.marv和rad35.sebov的混合物作为基准对照。用增量的病毒(111、333和1000vp/细胞)感染细胞，感染后48小时(48hpi)进行收获，并使用针对各自gp产生的小鼠血清对细胞表面上的gp进行染色。使用抗小鼠apc-偶联的二级抗原来促进通过facs对细胞进行检测。计数apc阳性细胞的百分比。图3d中显示的结果表明，虽然保持了正确的gp加工和运输，然而，与rad35.marv和rad35.sebov的混合物相比，facs分析还证实了rad35.e1.marv-f2a-sebov的两种转基因的表达降低。为了分析通过二价rad35.e1.marv-f2a-sebov针对编码的转基因诱导的免疫应答，使用两种单价载体rad35.marv和rad35.sebov的混合物作为基准对照，用纯化的疫苗载体免疫小鼠。在这项研究中，动物分布在实验组(每组10只小鼠)中。每个载体肌内注射单次剂量1x109载体颗粒(vp)。为了补偿已注射2个单插入载体(因此每只动物接受2x109vp)的小鼠中可能出现的佐剂效应，给已注射rad35.e1.marv-f2a-sebov的动物再给药1x109vp的ad35.空白载体(因此对于所有小鼠，每个动物共接受2x109vp)。针对细胞和体液免疫反应的读数是免疫后8周的elispot和elisa。使用elispot测定来确定脾脏中gp蛋白特异性ifnγ分泌性t细胞的相对数量，并且基本上(做了一些改编)如(radosevic等人，2010)中所述进行。简而言之，针对elispot中的刺激，每种线状病毒抗体使用三种不同的15-mer肽库：包含与埃博拉病毒或马尔堡线状病毒糖蛋白类似的肽的共识库、含有来自特定糖蛋白的n末端半部分的剩余肽的库1以及具有含有来自特异性线状病毒糖蛋白c末端部分的剩余肽的肽的库2。设计的重叠肽与由rad载体编码的糖蛋白完全匹配。计算每106个细胞的点形成单位(sfu)的数目。为了测定gp特异性抗体滴度，使用sebov或marv糖蛋白特异性小鼠抗体elisa。将elisamaxisorp板(nunc)在4℃下用10μg/ml的l-pbs(pbs中凝集素)(ph7.4，吉博科公司(gibco))涂覆过夜(on)。随后使用封闭缓冲液将板在室温(rt)下封闭2小时，并用含有hek293上清液的在pbs中稀释的sebov和marv进行涂覆。用洗涤缓冲液洗涤后，将稀释的参考标准血清和测试血清(一式两份)添加到具有样品缓冲液的平板上，并在室温下孵育1小时。一起取初始小鼠血清作为阴性对照。用洗涤缓冲液再次洗涤平板，用在样品缓冲液中稀释的抗小鼠igg-hrp涂覆，在室温下孵育1小时，并根据制造商的建议使用opd(西格玛公司(sigma))溶液进行显色。在用1mh2so4停止酶反应后，使用elisa板读数仪在492nm处测量od。所有的分析使用gen5软件进行。用以下纳入和排除标准，以elisa单位/毫升(eu/ml)报告测试样品中的血清浓度：每个样品中复制品之间od值的变化>20％样品被排除，初始血清的平均od应低于0.5以及最后每个血清样品中至少两次稀释应高于od0.5以获得正确的eu/ml。图3e显示了与基线对照相比，rad35.e1.marv-f2a-sebov(各自单价载体的混合)诱导的细胞免疫应答。虽然通过elispot检测到在免疫后8周对marv的细胞免疫应答，但在sebovelispot中没有检测到细胞免疫应答。图3f显示了通过elisa测量的体液免疫应答。与由rad35.marv和rad35.sebov的混合物诱导的体液免疫应答相比，由rad35.e1.marv-f2a-sebov诱导的体液免疫应答降低。从图3所示的实验，可以产生具有二价marv-f2a-sebov转基因的rad35载体，并且其一直到第10代仍然可以是遗传上稳定的，但是对于其中一个构建体，到较高的传代数(p13)时注意到有一些缺失带。此外，与单价载体rad35.marv和rad35.sebov的混合物相比，二价rad35.marv-f2a-sebov诱导的转基因表达和免疫原性都显著降低。因此，确定了e1-f2a二价策略不如单价载体的混合，而且不是用于基因治疗或疫苗应用的最佳选择。[比较]实例4：具有在e1中以头对尾构型的两个表达盒的rad35二价载体的制备和表征作为产生二价rad载体的第三种策略，测试了是否可以在e1区域中以头对尾的构型插入两种表达盒。图4a中示出了该设计的示意图。两种基因在由异源启动子mcag(基因1)和hcmv(基因2)驱动的e1区域中被克隆。产生不同的载体，即rad35.mcag.luc-hcmv.egfp和rad35.mcag.marv-hcmv.sebov，并通过在per.中繁殖至第13代来测试表达盒的遗传稳定性。测试每种载体的五个噬斑。如图4b(泳道2)中pcr带所示，发现了rad35.mcag.luc-hcmv.egfp的一个噬斑不稳定。相比之下，rad35.mcag.marv-hcmv.sebov在两个经测试的噬斑中都没有显示出这样的缺失带。通过蛋白质印迹法测试由异源启动子驱动的e1中具有头对尾转基因构型的rad的转基因表达，并将所述表达与上述基准单一插入载体(如图4c所示)进行比较。用1000、2500和5000(vp/细胞)转导a549细胞，并通过使用抗原特异性一级抗体的蛋白质印迹法分析转基因产生。虽然与基准单价载体相比，来自二价rad的marv转基因表达水平相当，但是观察到了sebov表达水平略有降低。作为对糖蛋白转基因的正确加工和呈递的另外的对照，用各自的抗原特异性抗体进行通过对载体rad35.mcag.marv-hcmv.sebov转导的a549细胞(111、333和1000vp/细胞)进行facs(阳性细胞的％)的表面染色。与单插入基准对照rad35.sebov和rad35.marv的直接比较显示较高水平的表面相关marv并且通过rad35.mcag.marv-hcmv.sebov载体产生较低水平的表面相关sebov(图4d)。进一步测试rad35.mcag.marv-hcmv.sebov在小鼠中的免疫原性。用单一剂量(1x109)的经纯化的疫苗载体对每组10只小鼠进行肌内免疫，并直接与两种单价载体rad35.marv和rad35.sebov的混合比较。免疫后8周通过elispot和elisa分析体液和细胞免疫应答(图4e-f)。在经检测的marv抗体滴度上，经rad35.mcag.marv-hcmv.sebov免疫的小鼠高于对照动物。相比之下，与对照动物相比，在经rad35.mcag.marv-hcmv.sebov免疫的小鼠中sebov特异性抗体水平降低。此外，与用各自的单价载体的混合物免疫的对照动物相比，由rad35.mcag.marv-hcmv.sebov诱导的针对marv和sebov抗原二者的t细胞应答降低。因此，确定了由异源启动子驱动的e1中的二价头对尾构型不如单价载体的混合物，并且这种二价头对尾构型对于用于基因治疗或疫苗应用不是最佳的。实例5：携带小鼠cmvie1/ie2双向启动子的腺病毒载体的制备和表征。最后，设计了产生多价rad的第四个选项，其中可以在e1区域中插入两种已选择的基因。与先前所讨论的设计相反，这些抗原由双向启动子(pbidir或bidir)驱动，并被置于启动子5'侧的反向取向和3'侧的正向取向上。由于目的是找到表达相似水平的两种经编码的转基因的双向启动子(在这里表示为平衡的转基因表达)，测试了几种不同的双向启动子设计的转基因表达的效力和平衡(图5)。通过瞬时转染hek293细胞中的padapt35质粒以及对荧光素酶(luc)和egfp表达水平的分析，测试了表示为bidir1-3的前三种不同的双向启动子的效力和平衡。pbidir1、pbidir2和pbidir3的设计是不相关的，并被生成以鉴定有效的双向启动子。虽然pbidir3基于天然存在的双向小鼠cmv启动子，pbidir1和pbidir2是使用以仅具有一个增强子序列存在的头对头构型的本领域已知的无处不在的强启动子的合成的双向启动子设计(amendola等人，naturebiotechnology[自然生物技术]2005)。将报告基因egfp和luc置于启动子5'或3'侧(如图5a所示)，并对各自的报告基因表达进行比较。在hek293细胞(瞬时转染)和a549细胞(病毒感染)中测量针对每个启动子和报告基因组合记录的相对egfp平均荧光强度(mfi)和荧光素酶相对光单位(rlu)。在luminoskantmascent微孔板发光计中，在0.1％dtt(1m)存在下，在细胞裂解物中测量荧光素酶活性。通过在pbs/1％fbs(非病毒材料)或cellfix(病毒材料)中胰蛋白酶消化、离心和再悬浮细胞沉淀，在流式细胞仪(facs)中测量egfp荧光。hek293细胞中的瞬时报告基因表达说明了bidir3启动子是最有效和平衡的启动子。当与bidir1和bidir2启动子直接相比时，发现了bidir3启动子的最平衡的luc和egfp表达。在效力方面，在记录的报告基因表达水平上，bidir1和bidir2启动子均优于bidir3启动子(图5b)。为了证实在hek293细胞中用瞬时转染获得的结果，产生了rad35.egfp-bidir3-luc和rad35.luc-bidir3-egfp腺病毒载体，并在用1000vp/细胞感染的a549细胞中测试报告基因的表达(图5c)。不考虑相对于启动子的位置，bidir3双插入载体与各自的单一插入对照之间的直接的报告egfp和萤火虫荧光素酶表达比较，显示egfp水平相当。换句话说，当荧光素酶基因位于启动子3'侧而不是5'侧时，荧光素酶表达较高。然而，针对bidir3双插入载体记录的报告基因表达水平超过了针对单个插入载体对照记录的水平，表明bidir3为更有效的启动子(图5c)。因此，确定了，在两种转基因，egfp和luc的表达水平上，具有双向小鼠cmv启动子的rad优于先前报道的二价rad。此外，来自具有bidir3双向启动子的rad的两种转基因的表达也优于所测试的基准单价载体。因此，确定了，鉴于转基因的表达水平，具有bidir3双向启动子的rad将适用于基因治疗或疫苗应用。图6中显示了mcmvie1/ie2启动子的代表性设计，序列和相应的注释用堆叠箭头表示。mcmvie1/ie2核心序列包含驱动两个方向上的表达的两个mie1和mie2增强子序列。此外，该序列包含两个tata框和两侧为各自的人apoe1和嵌合体内含子序列的两个转录起始位点(tss)(参见图5d和6)。提供了包含内含子(bidir3)的mcmv双向启动子序列的代表性序列作为seqidno:1，并且提供了除内含子之外的mcmv双向启动子序列的代表性序列作为seqidno:2。实例6：用mcmv双向表达盒来制备和表征rad35二价载体已选择的mcmv双向启动子示意性地表示在图7a中，该图描述了已插入的基因的方向和在rad35载体基因组中的位置。测试不同的rad35载体的在per.细胞中直到p13的遗传稳定性、抗原表达水平(总体和表面表达)和小鼠免疫原性(图7)。还评估了不同的rad载体在per.细胞中的拯救性(rescueability)和在p13的遗传稳定性。数据总结于表2中。通过将per.中的五个噬斑传代至p13，评估每个载体的遗传稳定性。发现所有载体在p13是遗传稳定的，没有缺失带(图7b)。图7b中的数据是三个载体，rad35.egfp-mcmv-luc、rad35.luc-mcmv-egfp和rad35.marv-mcmv-sebov的代表集，其中在第13代(p13)分离病毒dna，并使用e1表达盒侧翼的引物进行pcr。随后评价rad35.marv-mcmv-sebov的表达水平，以获得使用抗marv和抗sebov抗体的总体表达(蛋白质印迹法，图7c)和表面表达(facs，图7d)二者。为了评估sebov和marv的总体表达水平，用1000、2500和5000vp/细胞感染a549，并与单一插入载体rad35.e1marv或rad35.sebov直接进行比较。没有观察到rad35.marv-mcmv-sebov和rad35.e1.marv之间在marv的总体蛋白水平上的明显差异。相反，针对表达自rad35.marv-mcmv-sebov的sebov所检测到的蛋白质水平超过了单个插入对照rad35.e1.sebov(图7c)。通过用111、333和1000vp/细胞的rad35.marv-mcmv-sebov或者rad35.e1marv+rad35.e1sebov的混合物感染a549细胞，并在感染后48小时(48hpi)分析facs中的marv或sebov阳性细胞(％)来测试细胞表面上的抗原marv和sebov表达。与单价载体的对照混合物相比，facs中的抗marv染色和抗sebov染色都显示出更高的具有rad35.marv-mcmv-sebov的阳性细胞百分比(图7d)。接下来，通过观察经诱导的marv和sebov特异性t细胞应答和b细胞应答(分别为图7e和f)，将rad35.marv-mcmv-sebov(2x109vp)的免疫原性与各自的单一插入对照的混合物，rad35.e1.marv+rad35.e1.sebov(2x109vp)直接进行比较。图7e中的elispot结果代表在免疫后8周的小鼠脾细胞中每106(sfu/106)的点形成单位中的marv和sebov阳性t细胞级分。在sebov诱导的t细胞应答上，用rad35.marv-mcmv-sebov免疫的小鼠组高于用单个插入载体的混合物，rad35.marv+rad35.sebov免疫的小鼠组(图7e)。在marv诱导的t细胞应答上，用双插入ad35.marva-mcmv-sebov免疫的小鼠组不比用rad35.marv+rad35.sebov混合物免疫的小鼠组低(图7e)。在elisa中测量相应的sebov和marv特异性b细胞应答，并以elisa单位/ml(eu/ml)表示。与rad35.marv+rad35.sebov的单一插入混合物相比，用双插入rad35.marv-mcmv-sebov免疫的小鼠组的marv和sebov特异性b细胞应答都更高(图7f)。因此，根据以上所示针对rad35.marv-mcmv-sebov的结果，确定了具有表达marv和sebov的双向小鼠cmv启动子的rad35在遗传稳定性、两种转基因表达水平和免疫原性方面优于先前报道的二价rad。此外，确定了具有双向小鼠cmv启动子的rad35提供了两种转基因的足够表达水平以产生对两种抗原的显著的t细胞和b细胞免疫应答。因此，确定了，鉴于遗传稳定性、转基因的表达水平和已表达的抗原的免疫原性，具有双向小鼠cmv启动子的rad35将适用于基因治疗和疫苗应用。实例7：使用mcmv双向表达盒来制备和表征rad26二价载体在rad26中广泛测试了含有marv和sebov抗原(marv.mcmv.sebov)的二价双向启动子表达盒的遗传稳定性、两种抗原的表达水平(总体和表面)以及针对已编码的抗原的小鼠中的免疫原性。rad26的整体设计遵循了rad35的设计，其中表达盒位于e1区域中并且每个抗原由中心放置的双向mcmv启动子控制(图8a)。对于遗传稳定性测试，在per.中，将rad26.marv.mcmv.sebov传代至第13代(p13)。在p13分离病毒dna，并通过使用双向转基因表达盒侧翼的引物，通过pcr分析e1中的潜在缺失(图8b)。在经测试的噬斑中没有检测到缺失带，表明rad26.marv.mcmv.sebov具有良好的遗传稳定性曲线。此外，对p13噬斑的pcr产物进行测序并且该测序证实了不存在突变和终止密码子。因此，基于pcr分析和测序，rad26.e1.marv-mcmv-sebov在遗传上是稳定的。通过用10000、25000和50000vp/细胞感染a549细胞，在48hpi裂解细胞，并在蛋白质印迹法中用抗marv或抗sebov抗体进行染色，来评估在rad26.e1.marv.mcmv.sebov中编码的marv和sebov抗原的总体蛋白表达水平(图8c)。将来自双插入载体的蛋白质表达与单一插入载体rad26.e1.sebov和rad26.e1.marv直接进行比较。与rad26.e1.marv相比，用抗marv染色显示在用双插入载体rad26.e1.marv.mcmv.sebov感染的细胞中marv的表达降低。在另一方面，当与单一插入对照rad26.e1.marv相比时，在用rad26.e1.marv.mcmv.sebov感染的细胞中检测到增加量的sebov(图8c)。通过用100000、20000、4000和800vp/细胞感染a549细胞，在感染后48小时(48hpi)用抗marv或抗sebov染色，并通过facs分析marv或sebov百分比(％)阳性细胞来评估marv和sebov抗原的表面表达(图4d)。在rad26.e1.marv.mcmv.sebov感染的a549细胞的facs分析中未检测到在a549裂解物中所观察到的marv表达上的差异。在这里，与针对总体蛋白质表达而使用蛋白质印迹法所发现的相反，在用rad26.e1.marv.mcmv.sebov和rad26.e1marv感染的细胞表面上检测到相等量的marv(图8d)。此外，在用rad26.e1.marv.mcmv.sebov和rad26.e1.sebov感染的细胞中表面表达的sebov的量之间没有观察到差异。细胞表面的sebov表达的facs结果与蛋白质印迹法中的总体蛋白染色一致(图8c和8d)。通过比较二价载体和单个插入载体的混合物的能力以分别用elispot和elisa测定诱导marv和sebov特异性t细胞和b细胞应答来评价rad26.e1.marv.mcmv.sebov的免疫原性效力。对于两种测定，用1x109vp的rad26.e1.marv-mcmv-sebov或者1x109vp的rad26.e1.marv和1x109vp的rad26.e1.sebov的混合对每组中12只小鼠进行肌内(im)免疫。为了解释接受总共2x109vp的单个插入组合的组中可能出现的佐剂效应，将1x109vp的rad26.空白载体与rad26.e1.marv-mcmv-sebov共注射。作为阴性对照，两组小鼠(每组五只)共接收2x109vp的rad26.空白。在接种疫苗之前，也将小鼠放血以产生初始对照血清(数据未显示)。elispot和elisa测定结果分别如图8e和8f所示。如通过elispot在点形成单位/106脾细胞(sfu/106)中测量的，marv和sebov特异性t细胞应答显示了双插入载体和单插入载体的混合物之间的一些差异，但差异仅在低于2x109vp的剂量下才显著。在用较低剂量的混合物(2x109vp的rad26.e1.sebov+rad26.e1.mar)免疫的小鼠组中，与相同剂量的rad26.e1.marv.mcmv.sebov相比，(p<0.01)marv和(p<0.05)sebov特异性t细胞应答显著更高。然而，在用高于2x1010vp剂量的载体免疫的小鼠中，没有观察到marv或sebov特异性t细胞应答上的这些差异。此外，双插入载体为两种抗原提供了有效的t细胞应答(图8e)。基于elisa数据，与单插入载体的混合物相比，双插入载体的b细胞应答上也有一些差异，但是差异仅在marv中观察到。对于sebov，在用任一剂量的不同载体免疫的小鼠中，sebov抗体水平上没有显著差异(图8f)。对于marv特异性b细胞应答，与相同剂量的双插入物rad26.e1.marv.mcmv.sebov比较，用任一剂量的含有单插入物的混合物(rad26.e1.sebov+rad26.e1.marv)免疫的小鼠具有显著更高的(p<0.01)igg水平(elisa单位/ml(eu/ml))(图8f)。然而，再次，elisa显示双插入载体提供了有效的b细胞应答。因此，根据用于转基因表面表达的facs分析和用于测量免疫原性的elispot和elisa测定的数据，确定双插入载体rad26.e1.marv.mcmv.sebov以提供对marv和sebov两种抗原的有效表达以及有效的t细胞和b细胞免疫应答。与单插入载体的混合物相比，针对具有双插入载体的抗原检测到一些差异，但是rad26.e1.marv.mcmv.sebov提供了两种转基因的高水平的表面表达，并诱导了有效的t细胞和b细胞应答。此外，基于pcr分析和测序，rad26.e1.marv-mcmv-sebov在遗传上是稳定的。因此，确定了，鉴于遗传稳定性、转基因表达和已表达的抗原的免疫原性，如具有双向小鼠cmv启动子的rad35，具有双向小鼠cmv启动子的rad26将适用于基因治疗和疫苗应用。结论如上所述，测试了大量的mcmv双向启动子载体、含有不同的线状病毒糖蛋白的rad35和rad26以及报告基因(egfp和萤光素酶)在per.细胞中的遗传稳定性、转基因蛋白表达(总体和表面)以及抗原对于t细胞和b细胞两种应答的免疫原性。考虑到测试的载体数量(每种载体测试5个或更多个噬斑)以及用pcr分析e1表达盒的遗传稳定性的敏感性，确定具有双向mcmv启动子的本发明的rad是遗传稳定的，其在p13没有缺失带。此外，基于转基因表达的elisa分析以及有关t细胞和b细胞应答的对已表达的抗原的免疫原性的elispot和elisa分析，确定具有双向启动子的本发明的rad适用于基因治疗和疫苗应用。因此，与本领域先前所描述的二价rad载体相比，具有mcmv双向启动子的本发明的rad提供了显著的改进。表1：使用图2a所述的e1-e3设计进行的拯救尝试、拯救结果以及rad35和rad26载体的基因组稳定性。结果表明，具有在e1中编码的一种抗原和在e3中编码的一种抗原的二价rad是遗传不稳定的并且难以扩展。表2：携带具有不同转基因的mcmv双向表达盒的rad载体的拯救尝试、拯救结果和基因组稳定性。参考文献美国专利文献：us5057540a(10/15/1991).“saponinadjuvant”.kensil,charlottea.；marciani,dantej.us5122458a(6/16/1992).“useofabghgdnapolyadenylationsignalinexpressionofnon-bghpolypeptidesinhighereukaryoticcells”.post,leonarde.；palermo,danielp.；thomsen,darrellr.；rottman,fritzm.；goodwin,edwardc.；woychik,richardp.us5559099a(9/24/1996).“pentonbaseproteinandmethodsofusingsame”.wickham,thomasj.；kovesdi,imre；brough,douglase.；mcvey,duncanl.；brader,josepht.us5837511a(11/17/1998).“non-groupcadenoviralvectors”.falckpedersen,eriks.；crystal,ronaldg.；mastrangeli,andrea；abrahamson,karilus5837520a(11/17/1998).“methodofpurificationofviralvectors”.shabram,paulw.；huyghe,bernardg.；liu,xiaodong；shepard,h.michaelus5846782a(12/8/1998).“targetingadenoviruswithuseofconstrainedpeptidemotifs”.wickham,thomasj.；roelvink,petrusw.；kovesdi,imreus5851806a(12/22/1998).“complementaryadenoviralsystemsandcelllines”.kovesdi,imre；brough,douglase.；mcvey,duncanl.；bruder,josepht.；lizonova,alenaus5891690a(4/6/1999).“adenoviruse1-complementingcelllines”.massie,bernardus5965541a(10/12/1999).“vectorsandmethodsforgenetransfertocells”.wickham,thomasj.；kovesdi,imre；brough,douglase.us5981225a(11/9/1999).“genetransfervector,recombinantadenovirusparticlescontainingthesame,methodforproducingthesameandmethodofuseofthesame”.kochanek,stefan；schiedner,gudrunus5994106a(11/30/1999).“stocksofrecombinant,replication-deficientadenovirusfreeofreplication-competentadenovirus”.kovesdi,imre；brough,douglase.；mcvey,duncanl.；bruder,josepht.；lizonova,alenaus5994128a(11/30/1999).“packagingsystemsforhumanrecombinantadenovirustobeusedingenetherapy”.fallaux,fritsjacobus；hoeben,robertcornelis；vandereb,alexjan；bout,abraham；valerio,domenicous6020191a(2/1/2000).“adenoviralvectorscapableoffacilitatingincreasedpersistenceoftransgeneexpression”.scaria,abraham；gregory,richardj.；wadsworth,samuelc.us6040174a(3/21/2000).“defectiveadenovirusesandcorrespondingcomplementationlines”.imler,jeanluc；mehtali,majid；pavirani,andreaus6083716a(7/4/2000).“chimpanzeeadenovirusvectors”.wilson,jamesm.；farina,stevenf.；fisher,krishnaj.us6113913a(9/5/2000).“recombinantadenovirus”.brough,douglase.；kovesdi,imreus6225289b1(5/1/2001).“methodsandcompositionsforpreservingadenoviralvectors”.kovesdi,imre；ransom,stephenc.us6261823b1(7/17/2001).“methodsforpurifyingviruses”.tang,johnchutay；vellekamp,gary；bondoc,jr.,laureanol.us6485958b2(11/26/2002).“methodforproducingrecombinantadenovirus”.blanche,francis；guillaume,jeanmarcus7326555b2(2/5/2008).“methodsofadenoviruspurification”.konz,jr.,johno.；lee,annl.；to,chishungbrian；goerke,aaronrus8932607b2(1/13/2015).“batchesofrecombinantadenoviruswithalteredterminalends”.custers,jeromeh.h.v.；vellinga,jort欧洲专利文献：ep1230354b1(1/7/2004).“permanentamniocytecellline,theproductionthereofanditsuseforproducinggenetransfervectors”.kochanek,stefan；schiedner,gudrunep1601776b1(7/2/2008).“expressionvectorscomprisingthemcmvie2promoter”.chatellard,philippe；imhof,markusep853660b1(1/22/2003).“methodforpreservinginfectiousrecombinantviruses,aqueousviralsuspensionanduseasmedicine”.sene,claude国际专利文献：wo2003049763a1(6/19/2003).“compositionforthepreservationofviruses|compositionpourlaconservationdevirus”.setiawan,kerrie；cameron,fiona,helenwo2003061708a1(7/31/2003).“stabilizedformulationsofadenovirus”.pungor,ernowo2003078592a2(9/25/2003).“methodforthepurification,productionandformulationofoncolyticadenoviruses”.memarzadeh,bahram；pennathur-das,rukmini；wypych,joseph；yu,dechaowo2003104467a1(12/18/2003).“meansandmethodsfortheproductionofadenovirusvectors”.vogels,ronald；bout,abrahamwo2004001032a2(12/31/2003).“stableadenoviralvectorsandmethodsforpropagationthereof”.vogels,ronald；havenga,menzo,jans,emco；zuijdgeest,david,adrianus,theodoruswo2004004762a1(1/15/2004).“iscompreparationandusethereof”.morein,bror；bengtsson,karinwo2004020971a2(3/11/2004).“chromatographicmethodsforadenoviruspurification”.senesac,josephwo2004037294a2(5/6/2004).“newsettingsforrecombinantadenoviral-basedvaccines”.havenga,menzo,jans,emco；holterman,lennart；kostense,stefan；pau,maria,grazia；sprangers,mieke,carol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accgtagaacgcagagctcctcgctgcagctgcagaagttggtcgtgaggcactgggca1800ggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgag1860acagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgc1920ctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattaca1958<210>2<211>1478<212>dna<213>小鼠巨细胞病毒<400>2gttaacgtaggtagggtcgtatcgagccgcggtccgtcctgctctgggctcgaatggcat60gggggacagcaattatatggttaactccgcccgttttatgactagaaccaatagttttta120atgccaaatgcactgaaatcccctaatttgcaaagccaaacgccccctatgtgagtaata180cggggactttttacccaatttcccacgcggaaagccccctaatacactcatatggcatat240gaatcagcacggtcatgcactctaatggcggcccatagggactttccacatagggggcgt300tcaccatttcccagcataggggtggtgactcaatggcctttacccaagtacattgggtca360atgggaggtaagccaatgggtttttcccattactggcaagcacactgagtcaaatgggac420tttccactgggttttgcccaagtacattgggtcaatgggaggtgagccaatgggaaaaac480ccattgctgccaagtacactgactcaatagggactttccaatgggtttttccattgttgg540caagcatataaggtcaatgtgggtgagtcaatagggactttccattgtattctgcccagt600acataaggtcaatagggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgcg660tcaatagggactttccattgggttttgcccagtacataaggtcaataggggatgagtcaa720tgggaaaaacccattggagccaagtacactgactcaatagggactttccattgggttttg780cccagtacataaggtcaatagggggtgagtcaacaggaaagttccattggagccaagtac840attgagtcaatagggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaatgggaggta900agccaatgggtttttcccattactggcacgtatactgagtcattagggactttccaatgg960gttttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagcca1020agtacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagg1080gggtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtc1140attgggtttttccagccaatttaatttaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaa1200tgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaat1260gggaaagtaccgttctcgagccaatacacgtcaatgggaagtgaaagggcagccaaaacg1320taacaccgccccggttttcccctggaaattccatattggcacgcattctattggctgagc1380tgcgttctacgtgggtataagaggcgcgaccagcgtcggtaccgtcgcagtcttcggtct1440gaccaccgtagaacgcagagctcctcgctgcagctgca1478<210>3<211>183<212>dna<213>人工序列<220><223>嵌合体内含子<400>3gaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggag60accaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcaccta120ttggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaatt180aca183<210>4<211>297<212>dna<213>智人<400>4acataaataggccctgcaagagctggctgcttagagactgcgagaaggaggtgcgtcctg60ctgcctgccccggtcactctggctccccagctcaaggttcaggccttgccccaggccggg120cctctggtacctgaggtcttctcccgctctgtgcccttctcctcacctggctgcaactga180gttcggggagcacggggcttctgcatactgaaggcacccactcagccaggcccttcttct240cctccaggtcccccacggcccttcaggataaaagctgcggtgctgaccttggccgtg297当前第1页12当前第1页12