本发明涉及用于产生人抗原-特异性t淋巴细胞的方法。该方法采用与抗原或其片段融合的mhcii类靶向信号以获得经过rna编码的蛋白质的mhci类和ii类递呈。因此，本发明涉及包含mhcii类靶向信号和至少一种抗原或其片段的表达载体及其用于体外产生抗原-特异性t淋巴细胞的用途。还描述了对肿瘤抗原或病毒抗原具有特异性的t细胞克隆和t细胞受体(tcr)。
背景技术：
过继性t细胞转移采用基于t细胞的细胞毒性反应来控制慢性病毒感染和肿瘤。在体外产生对患者癌症具有天然反应性或基因工程化反应性的t细胞，然后将该t细胞转移返回至患者体内。已经将过继转移自体肿瘤浸润性淋巴细胞(til)用于成功治疗晚期肿瘤患者。til疗法在临床上的广泛应用的主要局限性在于肿瘤的免疫原性通常很差，以及从胸腺中选择消极t细胞的机制，该机制有效地去除具有自身抗原-特异性的t细胞。因此，在许多情况下，无论是对肿瘤特异性抗原具有较高亲和力的t细胞，还是具有所需特异性的t细胞，都不能将它们从患者血液或肿瘤切除物中分离出来。为此，转移以基因方式重新引导的外周血淋巴细胞(pbl)为克服这些限制提供了可能性。
此外，t淋巴细胞在癌症和慢性感染中丧失功能并耗尽。
在t细胞受体(tcr)基因疗法的帮助下，可以从患者血液中快速地产生数百万个肿瘤反应性t细胞。tcr基因疗法开创了灵活方法以将肿瘤特异性转移至可扩增且在功能上有希望的t细胞亚群。该方法包括将限定的抗原-特异性t细胞克隆的经分离的tcr基因转移至与人类白细胞抗原(hla)匹配的供体的受体t淋巴细胞中，以使该受体t淋巴细胞具有所需的抗原-特异性。
对于癌症或病毒疾病，采用cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的过继性t细胞疗法是一种有希望的免疫疗法。为了增强临床反应，互补性转移cd4+辅助性t细胞为增强cd8+ctl反应提供了可能性。已知cd4+t淋巴细胞为cd8+ctl提供了关键性帮助，并且对长效cd8+记忆t细胞的产生具有关键作用。因此，快速且有效地分离和表征肿瘤抗原-特异性cd4+和cd8+t淋巴细胞是重要的。
许多肿瘤表达mhcii类分子，因此来自cd4+t细胞的tcr对攻击直接攻击这些肿瘤特别有用。
为了扩展采用过继性细胞疗法(act)来治疗患有生长更快的肿瘤或慢性病毒性疾病的患者的能力，目标是转移富集的肽特异性效应t细胞(cd4t辅助细胞和细胞毒性t淋巴细胞，这些细胞因其配体特异性而被选择)以有效地攻击病毒或肿瘤细胞，同时避免严重攻击正常组织。将这些细胞离体迅速地大量扩增，然后将其用于act。可替换地，采用受体外周血淋巴细胞或具有定义的特异性的激活的t细胞克隆(生长良好且没有攻击正常宿主组织的能力)，可以克隆这些配体特异性t细胞的t细胞受体(tcr)，并将它们作为tcr转基因在激活的淋巴细胞中表达。
因此，需要抗原-特异性tcr和分离这些tcr的有效方法。
技术实现要素：
因此，本发明的目的是提供用于分离具有抗原-特异性tcr的t细胞的有效方法。提供用于产生cd4tcr和/或cd8tcr的方法将是期望的。此外，本发明的目的是提供tcr或其功能部分(如cdr3区)。实现对肿瘤抗原表现出较高和/或最佳亲和力的tcr将是有利的。
因此，本发明的第一方面涉及产生人抗原-特异性t淋巴细胞的方法，包括以下步骤：
a)在抗原递呈细胞中表达至少一种融合蛋白，所述融合蛋白包含
-至少一种抗原或其片段，
-在抗原n-末端前端的内质网(er)-易位信号序列，和
-在抗原c-末端后端的包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域；和
b)在体外将包含t淋巴细胞的细胞群暴露于步骤a)的抗原递呈细胞，以激活对由抗原递呈细胞表达的抗原具有特异性的抗原-特异性t淋巴细胞。
将靶向序列(特别是与er-易位信号序列组合)与所需抗原或其片段融合允许有效地加载mhcii类复合物，还用于通常经由mhci类复合物递呈的细胞内蛋白质。通过上述方法也可以实现对mhci类复合物的加载。因此，该方法允许产生cd4+tcr和cd8+tcr。
至少一种步骤a)中的融合蛋白的表达可以是瞬时表达或稳定表达，优选瞬时表达，例如通过引入编码至少一种融合蛋白的ivt-rna。ivt-rna表达的优点为可以快速产生质量受控的ivt-rna并且该ivt-rna不携带免疫原性蛋白质污染物。
在具体的实施方式中，融合蛋白可以包含至少两种抗原或其片段。
在一些实施方式中，该方法可以进一步包括富集激活的t淋巴细胞的步骤。该富集步骤通常包括以下步骤：
(a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群与至少一种结合分子接触，该结合分子与至少一种由激活的t淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白质特异性结合；
(b)分离与至少一种结合分子结合的t淋巴细胞。
在优选的实施方式中，由激活的t淋巴细胞特异性表达的至少一种标志物蛋白质选自包括以下各项的组：ox40、cd137、cd40l、pd-1、il-2受体、干扰素γ、il-2、gm-csf和tnf-α。另外，在步骤(a)中，细胞可以进一步与特异性结合至cd4的结合分子和/或与特异性结合至cd8的结合分子接触。
在具体的实施方式中，选择激活的cd4t细胞包括以下步骤：
(a1)使步骤b)的细胞群与抗cd40的抗体接触，以阻断抗原递呈细胞的cd40-cd40l与抗原-特异性t淋巴细胞之间的相互作用，并使cd40l在t淋巴细胞表面积累；
(a2)使包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群与抗-cd40l抗体接触；
(b)分离标记有抗-cd40l抗体和抗-cd4抗体的t淋巴细胞。
另一个实施方式涉及根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤
c2)鉴定抗原-特异性t淋巴细胞，包括以下步骤：
a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群的扩增细胞克隆与以下各项孵育
(i)如步骤a)中定义的抗原递呈细胞，和
(ii)对照抗原递呈细胞；
b)比较每种细胞克隆与(i)和(ii)孵育的激活特征；
c)基于b)的比较，鉴定抗原-特异性细胞克隆；
其中，被(i)激活但不被(ii)激活表明细胞克隆是抗原-特异性的；被(i)激活并且被(ii)激活表明细胞克隆是抗原非特异性的；既不被(i)激活也不被(ii)激活表示细胞克隆未被激活。
在步骤b)中，至少一次、或至少两次、或至少三次或三次将抗原递呈细胞添加至包含t淋巴细胞的细胞群。重复添加抗原递呈细胞之间的时间间隔可以是7至21天、12至16天、或13至15天、或14天。
er易位信号序列来源于内体/溶酶体相关蛋白。内体/溶酶体相关蛋白可以选自由lamp1、lamp2、dc-lamp、cd68或cd1b所组成的组，优选地内体/溶酶体相关蛋白是lamp1。优选地，er易位信号序列源于人类。在具体的实施方式中，er易位信号序列包含序列seqidno：33或其片段。在更具体的实施方式中，er易位信号序列由以下序列seqidno：33组成。
包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。优选地，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域源于人类。
通常，抗原递呈细胞选自树突细胞、激活的b细胞、单核细胞、巨噬细胞、ebv转化的淋巴母细胞系，优选树突细胞，更优选单核细胞衍生的树突细胞。
通常，包含t淋巴细胞的细胞群是外周血淋巴细胞的群体。包含t淋巴细胞的细胞群可以是未被分离的外周血淋巴细胞的群体。可以通过本领域技术人员已知的手段富集细胞群的t淋巴细胞(优选cd8+和/或cd4+t淋巴细胞)。
本申请的另一个方面是通过本文所述的方法能够获得的t淋巴细胞。
本发明的另一个方面涉及表达载体，其包含：
-人内质网(er)-易位信号，和
-包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域。
载体可以包含用于体外mrna转录的启动子。er易位信号序列来源于内体/溶酶体相关蛋白，例如lamp1、lamp2、dc-lamp、cd68、cd1b，最优选lamp1。优选地，er易位信号序列源于人类。在具体的实施方式中，er易位信号序列包含序列seqidno：33或其片段。在更具体的实施方式中，er易位信号序列由以下序列seqidno：34组成。
内体/溶酶体靶向序列可以来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。内体/溶酶体靶向序列通常是跨膜胞质结构域的一部分。因此，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。优选地，包含内体和/或溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域源于人类。通常，内体/溶酶体靶向序列包含基序y-xx(x代表任何天然存在的氨基酸)，其后端是疏水性氨基酸(seqidno：38)。优选地，内体/溶酶体靶向序列是yqri(seqidno：39)。包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以包含序列seqidno：54或其片段。例如，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以包含序列seqidno：35或其片段。
在一些实施方式中，表达载体还包含er易位信号序列与包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域之间的限制性位点。在其它实施方式中，载体还包含至少一种抗原或其片段，该抗原或其片段插入在人内质网(er)-易位信号序列和包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域之间。
在具体的实施方式中，载体包含编码至少两种抗原或其片段的序列。在一些实施方式中，载体包含编码抗原的全长氨基酸序列的核酸序列。可替换地，载体包含编码抗原的氨基酸序列的核酸序列的片段。
通常，抗原是肿瘤抗原或病毒抗原。肿瘤抗原可以选自由病毒肿瘤抗原、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原和携带患者特异性突变且在患者肿瘤细胞中表达的抗原所组成的组。肿瘤抗原是肿瘤相关抗原，优选肿瘤相关抗原是癌/睾丸抗原(c/t抗原)。c/t抗原可以选自包含mage家族成员的组，例如mage-a1、mage-a3、mage-a4，但不限于这些，包含单点突变的肿瘤抗原、ny-eso1、肿瘤/睾丸-抗原1b、gage-1、ssx-4、xage-1、bage、gage、scp-1、ssx-2、ssx-4、ctz9、ct10、sage和cage。优选地，c/t抗原可以选自由gage-1、ssx-4和xage-1所组成的组。
本发明的另一个方面涉及如本文所述的表达载体用于体外产生抗原-特异性t淋巴细胞的用途。
本发明的另一个方面涉及用于在预防或治疗癌症的方法(包括通过本文所述的方法向哺乳动物给予t淋巴细胞)中使用的t-淋巴细胞。
另一个方面涉及用于产生抗原-特异性tcr的方法，其包括上述方法的步骤，并且还包括从通过如本文所述的方法产生的激活的抗原-特异性淋巴细胞中分离tcr的步骤。
另一个方面涉及分别对gage-1、ssx-4和xage-1具有特异性的tcr。
附图说明
图1：用于激活和分离抗原-特异性cd4+t细胞的靶向性mhcii类递呈。(a)用于验证crosstag信号的功能和必要性的各种ebna-3c构建体的示意图。示出了orf(atg至终止子)、crosstag-信号(lamp1和dc-lamp)、hla-dr11限制性ebna-3c表位(3h10)和聚a120延伸部分的不同组成。(b)crosstag-信号有助于高效的mhcii类交叉递呈。在用ivt-rna转染的apc(在三天内制备的源于单核细胞的dc(3d-mdc)，或小型爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)转化的淋巴母细胞系(mlcl))共培养16小时时，ebna-3c特异性cd4+t细胞克隆3h10的ifn-γ分泌。以三次重复的平均值+sd表示值。(c)激活标志物cd40l的表达适合于分离抗原-特异性cd4+t细胞。将用celltracetm紫标记的3h10细胞与浓度降低的自体pbl混合，并与自体供体的ebna-3c-crosstagivt-rna转染的mdc(apc)共培养。在共培养6小时时评估cd4+t细胞上的激活诱导的cd40l表达。
图2：从未经分离的pbl诱导和富集c/t-抗原-特异性cd4+t细胞。(a)在来自c/t-抗原-激发的pbl的cd4+t细胞表面的激活诱导的cd40l和cd137表达。分别在第13天和第27天，在体外培养物中将pbl特异性再刺激后6小时测定激活标志物表达。(b)直接比较群体cd40l阳性和cd40l阴性cd4+t细胞系的增殖能力。在第28天，根据cd4+t细胞的cd40l表达，将它们从激发的pbl培养物中分离出来。在facs分离后(第0天)和特异性再刺激后14天间隔结束时(第14天)评估细胞总数。描述为相对于第0天的x倍增殖。(c)比较在抗原-特异性再刺激后诱导的细胞因子分泌。在用crosstag-抗原ivt-rna转染的mdc共培养16小时时测定群体cd40l阳性和cd40l阴性cd4+t细胞系的ifn-γ分泌。以三次重复的平均值+sd表示值。
图3：筛选c/t-抗原-特异性cd4+t细胞克隆。(a)来源于c/t-抗原-激发的pbl培养物的克隆的示例性筛选数据。在与crosstag-抗原ivt-rna-转染的mdc(4种抗原的混合物)共培养16小时时评估ifn-γ分泌。条状物代表单个值。(b)验证所选t细胞克隆的c/t-抗原反应性。在与ivt-rna转染的mlcl(4种抗原的混合物)共培养后评估细胞因子分泌(ifn-γ和gm-csf)。以单个值表示数据。(c)确定cd4共受体表达。示出了示例性克隆。
图4：评估抗原-特异性。发现cd4+t细胞克隆的示例性数据显示出单一的c/t-抗原-特异性。在与ivt-rna转染的mlcl共培养后测定ifn-γ分泌。以两次重复的平均值+sd表示值，或者以标记为(*)的单个数据点表示值。
图5：crosstag-信号的必要性和蛋白质识别。(a)crosstag-信号对于基于ivt-rna的cd4+t细胞克隆激活的必要性。(b)识别在生理环境下加工的外源重组蛋白。如测定携带独特tcr的分离的cd4+t细胞克隆的ifn-γ分泌所示的，与转染有缺乏crosstag-信号的抗原-ivt-rna的mlcl(a)或加载有重组蛋白的mlcl(b)直接相比，抗原-crosstagivt-rna转染的apc(mlcl)的刺激能力。将模拟apc和单独的t细胞分别作为对照。以三次重复的平均值+sd表示值。
图6：mhcii类表位核心序列的定义。采用短crosstag-ivt-rna构建体验证通过直接鉴定mhcii类表位(depi)(虚线框)发现的肽片段。将gage-1-tcr-2转基因的3h10t细胞(a)或xage-1-tcr-1和xage-1-tcr-2细胞(b)与较短的重叠crosstag-ivt-rna构建体(表示为黑色条状物)或全长抗原-crosstagivt-rna-转染的apc(mlcl)共培养。在共培养16小时时评估ifn-γ分泌，并描绘识别的表位核心序列(实线框)。将具有模拟转染的apc或单独t细胞的共培养物作为对照。以三次重复的平均值+sd表示值。
图7：c/t-抗原-特异性cd4+t细胞受体的转基因表达。用编码cd4+t细胞克隆gage-1-tcr-1、xage-1-tcr-1或-tcr-2的相应tcr-α链和tcr-β链的ivt-rna转染3h10t细胞。将tcr-转基因的3h10细胞与加载抗原的apc(mlcl)共培养，并且在共培养16小时时检测ifn-γ分泌。将具有模拟转染的apc或单独t细胞的共培养物作为对照。以三次重复的平均值+sd表示值。
图8：crosstag-信号经由细胞内部[内源性]递呈途径促进mhcii类加载。用ebna-3c-crosstagivt-rna转染hla-drb1*11:01阳性dc和hla-drb1*11:01-阴性dc。以所有可能的组合将转染的dc和未转染的dc共同孵育，并在12小时后将它们与ebna-3c特异性cd4+t细胞克隆3h10共培养。在与dc共培养16小时时测定3h10细胞的ifn-γ分泌。以三次重复的平均值+sd表示值。
图9：表征用于pbl激发的3dmdc。(a)通过用单克隆抗体染色(开放曲线)和匹配的同种型对照(填充的灰色曲线)检测到的表面标志物表达。(b)ivt-rna转染的mdc的抗原mrna水平。示出了与未转染的mdc相比，抗原mrna拷贝数增加了x倍。采用抗原-特异性引物，通过qrt-pcr评估抗原mrna拷贝数。
图10：基于cd40l对c/t-抗原-特异性cd4+t细胞分选的门控策略。根据淋巴细胞的正向(fsc；fsc-a：前向角散射面积；fsc-h：前向角散射高度)和侧向角散射(ssc-a)选择淋巴细胞。采用dapi以排除死亡细胞。随后根据它们的cd40l表达对单细胞组分(fsc-a/fsc-h)的cd4-阳性细胞进行分选，并将它们确定为群体cd40l阳性cd4+t细胞系和群体cd40l阴性cd4+t细胞系。另外，基于单细胞，将cd40l阳性cd4+t细胞分选到96孔板中。
图11：可选的er易位信号序列
(a)用于产生ivt-rna的载体构建体的示意图。将特征化的cd4+t细胞克隆3h10(ebna-3c特异性的，hla-drb1*11:01限制性的)的靶抗原克隆到包含人lamp1、lamp2、dc-lamp、cd68或cd1b的er易位信号(抗原序列的5')和人dc-lamp的内体/溶酶体靶向序列(抗原序列的3')的各组合、仅包含dc-lamp的内体/溶酶体靶向序列、或不包含易位序列和靶向序列的pgem载体系统。另外，示出了所使用的信号肽序列(er易位信号)的氨基酸序列，以表明预测的肽酶切割位点。(b)将cd4+t细胞克隆3h10的细胞与经单种ivt-rna转染的apc(mlcl)共培养。将具有模拟转染的apc的共培养物作为对照。在共培养开始后16小时，通过标准的ifn-γelisa检测ifn-γ分泌。以三次重复的平均值+sd表示值。
图12：采用crosstag靶向信号同时进行mhc-ii类和mhc-i类递呈。(a)用于产生ivt-rna的载体构建体的示意图。将特征化的cd4+t细胞克隆3h10(ebna-3c特异性的，hla-drb1*11:01限制性的)和特征化的cd8+t细胞克隆ivsb(酪氨酸酶特异性的，hla-a2*01:01限制性的)的靶抗原克隆到含有或不含有crosstag靶向序列的pgem载体系统中。将ebna-3c作为1kb片段的完整基因序列(氨基酸421-780)进行克隆，并且其含有克隆3h10的表位。为了产生ivsb-3h10(表位)-crosstag构建体(而不是完整的抗原序列)，将包含克隆3h10(ebna-3c，氨基酸628-641，vvrmfmrerqlpqs；seqidno：36)和克隆ivsb(酪氨酸酶，氨基酸369-377，ymdgtmsqv；seqidno：37)的表位的小基因依次克隆到pgem-crosstag载体骨架中。为了促进细胞质中的转录的ivt-rna物质的稳定化，所有的pgem载体构建体均携带包含开放阅读框(orf)3’的120个腺嘌呤碱基对(聚-a120)的聚-a尾。(b)用(a)中所示的单种ivt-rna转染hla-a2*01:01-、hla-drb1*11:01-双阳性供体的成熟dc(mdc)的分离组分。转染后7小时，将不同的mdc群(1*105个细胞)以1:1的比率与1*105个cd4+t细胞克隆3h10细胞或cd8+t细胞克隆ivsb细胞进行共培养。将具有模拟转染的mdc(h2o)或单独t细胞的共培养物作为对照。在共培养开始后16小时，通过标准的ifn-γelisa检测ifn-γ分泌。以三次重复的平均值+sd表示值。
具体实施方式
在参照一些优选实施例详细地描述本发明之前，提供以下常规定义。
在不存在任何一个或多个要素、一种或多种限制下，可以适当地实施如下文说明性描述的本发明，这里并未具体公开。
将参照一些特定实施例且参考某些附图对本发明进行描述，但本发明仅由权利要求限定，并不限于此。
在本说明书和权利要求书中使用术语“包含(comprising)”时，其并不排除其它要素。为了本发明的目的，术语“由...组成(consistingof)”被认为是术语“包括(comprisingof”)”的优选实施例。如果在下文中将组定义为包括至少一定数量的实施例，则这也将理解为公开了优选仅由这些实施例组成的组。
在涉及单数名词时使用不定冠词或定冠词的情况下，例如，“一种(a)”、“一种(an)”或“该”，除非另有特定说明，否则该单数名词包括其复数。
如在本文中所使用的，术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。因此，术语“表达的”蛋白质或多肽包括但不限于细胞内的、跨膜的和分泌的蛋白质或多肽。
按其常规意义使用技术术语。如果某些术语具有特定含义，那么将在以下使用该术语的上下文中给出对其的定义。
本发明的一个方面涉及产生人抗原-特异性t淋巴细胞的方法，包括以下步骤：
a)在抗原递呈细胞中表达至少一种融合蛋白，所述融合蛋白包含
-至少一种抗原或其片段，
-在抗原n-末端前端的内质网(er)-易位信号序列，和
-在抗原c-末端后端的包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域；和
b)在体外将包含t淋巴细胞的细胞群暴露于步骤a)的抗原递呈细胞，以激活对由抗原递呈细胞表达的抗原具有特异性的抗原-特异性t淋巴细胞。
该片段可以是对该抗原具有特异性的抗原序列，即不存在于哺乳动物(特别是人类)的另一种蛋白质或肽中。该片段可以比抗原序列更短，例如比抗原短至少5％、至少10％、至少30％、至少50％、至少70％、至少90％。该片段的长度可以为至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或更多个氨基酸。
在一个实施方式中，融合蛋白包含至少两种抗原或其片段。融合蛋白可以包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种抗原或其片段。融合蛋白可以包含少于100种、少于50种、少于40种、少于30种、少于20种、少于10种抗原或其片段。
术语“激活抗原-特异性t淋巴细胞”是指激活幼稚t细胞(从头诱导)和激活记忆t淋巴细胞(再激活)。
通常，抗原递呈细胞和包含t淋巴细胞的细胞群来自相同的供体。也考虑了ep1910521中所述的同种异型限制的细胞，其中在供体的抗原递呈细胞中表达编码mhc分子的核酸，该供体不携带对应于所转移的所述mhc分子的mhc基因。
至少一种步骤a)中的融合蛋白的表达可以是瞬时表达或稳定表达。在优选的实施方式中，表达是瞬时表达，例如通过引入编码至少一种融合蛋白的ivt-rna。ivt-rna表达的优点为可以快速产生质量受控的ivt-rna并且该ivt-rna不携带免疫原性蛋白质污染物。
通过暴露t淋巴细胞(也称为激发)，大量不同的激活的淋巴细胞群在体外出现。通常，步骤b)中的暴露是将抗原递呈细胞与包含t淋巴细胞的细胞群共培养。识别抗原递呈细胞的mhc:表位复合物的t细胞被激活，一部分被激活的t细胞对递呈步骤a)中表达的抗原表位的mhc分子的复合物是特异性的。需要将这些受欢迎的t细胞从识别mhc分子(不区分那些递呈不是来源于步骤a)中表达的抗原的表位的肽或mhc分子)的t细胞中分离出来。
为了暴露步骤b)中的抗原递呈细胞，至少一次将抗原递呈细胞添加至包含t淋巴细胞的群体。第一次添加抗原递呈细胞也被称为激发。可以多次添加抗原递呈细胞，例如，至少两次或至少三次。第二次和随后每次添加抗原递呈细胞也被称为再刺激，由于在这些步骤中，已经被激活的t淋巴细胞接受另外刺激以进一步增殖。在某些实施方式中，添加一次抗原递呈细胞。在其它实施方式中，添加两次抗原递呈细胞。在另一个实施方式中，添加三次抗原递呈细胞。其它实施方式涉及其中将抗原递呈细胞添加三次或更多次的方法。可以每7至21天、或每12至16天、或每13至15天或每14天将新的apc添加至t细胞培养物中。本领域技术人员将理解，定期地对细胞提供含有补充的细胞因子的新鲜培养基。
将包含t淋巴细胞的细胞群在体外暴露于抗原递呈细胞意味着暴露不是在生物体(如哺乳动物)中发生，暴露而是发生在体外细胞培养中。细胞培养条件对于本领域技术人员来说是已知的，并且根据产生的t细胞的类型，包括添加细胞因子，例如il-2、il-4、il-7和/或il-15等(schendel,dj.等人,humancd8+tlymphocytes.1997.theimmunologymethodsmanual.(i.lefkovits编辑)第670-690页；regn,s.等人,2001.thegenerationofmonospecificandbispecificanti-viralcytotoxictlymphocytes(ctl)fortheprophylaxisofpatientsreceivinganallogeneicbonemarrowtransplant.bonemarrowtransplant.27:53-64；su,z.等人,antigenpresentingcellstransfectedwithlmp2arnainducecd4+lmp2a-specificcytotoxictlymphocyteswhichkillviaafas-independentmechanism.leuk.lymphoma43(8):1651-62)。
在一些实施方式中，该方法可以进一步包括富集激活的和/或抗原-特异性t淋巴细胞的步骤。该富集步骤通常包括以下步骤：
(a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群与至少一种结合分子或至少一种递呈所需抗原的表位的mhc分子接触，该结合分子与由激活的t淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白特异性结合；
(b)分离与至少一种结合分子或至少一种递呈所需抗原的表位的mhc分子结合的t淋巴细胞。
在具体的实施方式中，该方法可以包括富集激活的t淋巴细胞的步骤。该富集步骤通常包括以下步骤：
(a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群与至少一种结合分子接触，该结合分子与由激活的t淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白特异性结合；
(b)分离与至少一种结合分子结合的t淋巴细胞。
在其它的具体实施方式中，该方法可以包括富集对所需抗原具有特异性的t淋巴细胞的步骤。该富集步骤通常包括以下步骤：
(a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群与递呈所需抗原的表位的mhc分子接触；
(b)分离与至少一种递呈所需抗原的表位的mhc分子结合的t淋巴细胞。
基于由激活的t淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白而富集激活的t淋巴细胞允许富集广谱的激活的t细胞，而不依赖于限制性和特异性表位。
与标志物蛋白特异性结合的结合分子可以不限制于抗体、抗体衍生物、抗体片段或前述与其它分子的缀合物。结合蛋白可以是被标记的，例如为了有助于分选程序，如facs或macs。
由激活的t淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白可以是由激活的t淋巴细胞表达的任何表面蛋白或分泌蛋白，并且基本上不由非激活的t淋巴细胞表达。在优选的实施方式中，至少一种由激活的t淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白选自包括ox40、cd137、cd40l、pd-1、il-2受体、干扰素γ、il-2、gm-csf和tnf-α的组。采用这些标志物允许富集激活的t淋巴细胞，而不依赖于tcr递呈的特定表位。该方法有助于对识别所选抗原的所有潜在免疫原性表位的t细胞进行分离，并且例如对于定义不明的抗原特别有用。
在富集步骤中，可以将选定的细胞合并为亚群或直接分离为单个细胞克隆。在具体的实施方式中，第一富集步骤中细胞是合并的，并且在进一步富集步骤中将细胞分离成单个克隆。可以进行单个克隆分离，而不限于经由有限稀释或采用facs或macs进行自动化单细胞分选。优选地，通过facs进行单细胞分选。
在具体的实施方式中，选择激活的cd4t细胞包括以下步骤：
(a1)使表达步骤a)的至少一种融合蛋白的抗原递呈细胞与抗cd40的抗体接触，以阻断抗原递呈细胞的cd40-cd40l与抗原-特异性t淋巴细胞之间的相互作用，并使cd40l在t淋巴细胞表面积累；
(a2)使包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群与抗-cd40l抗体接触；
(b)分离标记有抗-cd40l抗体和抗-cd4抗体的t淋巴细胞。
为了通过分泌的蛋白(例如，细胞因子(如干扰素-γ))选择激活的t细胞，识别t-细胞表面标志物和靶细胞因子的双特异性分子捕获细胞表面上的分泌细胞因子，该分泌细胞因子随后可以通过标记的检测抗体被检测到，如becker等人所描述的(becker,c等人,2001.adoptivetumortherapywithtlymphocytesenrichedthroughaifncaptureassay.naturemed.7(10):1159-1162)。
另外，在步骤(a)中，细胞可以进一步与特异性结合至cd4的结合分子和/或与特异性结合至cd8的结合分子接触。
可替换地，可以通过采用递呈所需抗原(即由步骤a的抗原递呈细胞外源表达的抗原)的表位的mhc分子来进行富集。例如为了有利于分选程序(如facs或macs)，mhc分子可以是标记的。可以通过组装可溶性的肽:mhc分子的多聚体来克服tcr与相应肽:mhc复合物之间的低亲和力相互作用，如wilde等人的描述(dendriticcellspulsedwithrnaencodingallogeneicmhcandantigeninducetcellswithsuperiorantitumoractivityandhighertcrfunctionalavidity.blood114(10):2131-2139；2009)，例如但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体或八聚体。此外，可以采用所谓的肽:mhc连锁状多聚体，其与tcr可逆结合并因此允许与高亲和力tcr分离，而没有诱导功能改变或激活诱导的细胞死亡的风险(knabel等人,(2002)reversiblemhcmultimerstainingforfunctionalisolationoft-cellpopulationsandeffectiveadoptivetransfer.naturemedicine,8(6),631–7)。t细胞:连锁状多聚体相互作用的可逆特性是基于作为连锁状多聚体骨架的修饰形式的链霉亲和素(strep-tactin)。
该方法允许靶向富集具有特定限制的表位特异性tcr。
可以通过荧光激活的细胞分选(facs)以及磁激活的细胞分选(macs)来进行激活的和/或抗原-特异性的t淋巴细胞的分离。对于facs，用荧光染料标记与标志物蛋白或递呈所需抗原的表位的mhc分子特异性结合的结合分子。facs特别有利于分离纯度较高的较小数量。对于macs，用磁性颗粒(如磁珠)标记与标志物蛋白或递呈所需抗原的表位的mhc分子特异性结合的结合分子。macs特别适用于快速分选大量培养物。
另外，在步骤(a)中，细胞还可以与特异性结合至cd4的结合分子接触以进一步富集cd4和/或与特异性结合至cd8的结合分子接触。
另一个实施方式涉及根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤
c2)鉴定抗原-特异性t淋巴细胞，包括以下步骤：
a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群的扩增细胞克隆与以下各项孵育
(i)如步骤a)中定义的抗原递呈细胞，和
(ii)对照抗原递呈细胞；
b)比较每种细胞克隆与(i)和(ii)孵育的激活特征；
c)基于b)的比较，鉴定抗原-特异性细胞克隆；
其中，被(i)激活但不被(ii)激活表明细胞克隆是抗原-特异性的。
可以在步骤c1)富集激活的t淋巴细胞之后进行步骤c2)鉴定抗原-特异性t淋巴细胞，或者可替换地可以在步骤b)将包含t淋巴细胞的细胞群暴露于抗原递呈细胞之后(而不进行富集步骤c1))进行步骤c2)。
另一个实施方式涉及根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤
c2)鉴定抗原-特异性t淋巴细胞，包括以下步骤：
a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群的至少一部分细胞与以下各项孵育
(i)如步骤a)中定义的抗原递呈细胞，和
(ii)对照抗原递呈细胞或不存在抗原递呈细胞；
b)比较至少一部分细胞与(i)和(ii)孵育的激活特征；
c)基于b)的比较，鉴定具有抗原-特异性的一部分细胞；
其中，被(i)激活但不被(ii)激活表明这部分细胞是抗原-特异性的。
另一个实施方式涉及根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤
c2)鉴定抗原-特异性t淋巴细胞，包括以下步骤：
a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群的扩增的t细胞克隆与以下各项孵育
(i)如步骤a)中定义的抗原递呈细胞，和
(ii)对照抗原递呈细胞或不存在抗原递呈细胞；
b)比较每种细胞克隆与(i)和(ii)孵育的激活特征；
c)基于b)的比较，鉴定具有抗原-特异性的细胞克隆；
其中，被(i)激活但不被(ii)激活表明细胞克隆是抗原-特异性的。
例如，可以通过测定激活诱导的细胞因子释放或抗原引导的杀伤能力来确定t淋巴细胞的激活特征。
为了测定激活诱导的细胞因子分泌，可以将t细胞与加载抗原的apc共培养。可以采用不同比率的效应细胞与靶细胞(e:t)。可以将与对照抗原递呈细胞(即，模拟转染的apc)孵育的t细胞或不存在刺激细胞下孵育的t细胞作为阴性对照。通过标准的酶联免疫吸附测定法(elisa)评估培养物上清液。标志物的实例是但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、干扰素-γ(ifn-γ)、il-2和tnf-α分泌物。在遇到抗原后所产生的ifn-γ、il-2和tnf-α分泌物与抗肿瘤功能增强相关，因此它们在测定cd8+细胞毒性t细胞的抗原诱导的细胞因子分泌物时特别有用。此外，对于评估抗原-特异性cd4+t辅助-1(th1)-极化t细胞克隆，ifn-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)是明确的细胞因子。
如果同时使用多种抗原用于原代t细胞诱导，那么可以以相同比例将表达每种激发抗原的各个apc群体混合，并用于t细胞共培养。因此，为评估特异性而进行的初始筛选测定法仅允许预测所有配置的靶抗原的总体抗原反应性。评估单抗原特异性需要随后将抗原反应性t细胞与单种ivtrna转染的apc共培养。
此外，可以测定(例如通过铬释放测定法)单个t细胞克隆的细胞毒性活性。以这种测定法，用放射性铬标记靶细胞，并将其暴露于t细胞。在杀死靶细胞后，放射性铬被释放到上清液中，并在共培养开始后4小时内能够检测到放射性铬。通过在不存在效应细胞下孵育靶细胞来评估自发释放，以自发释放将具体的铬释放标准化。因此，上清液中的高含量铬与极好的细胞溶解t细胞活性相关。优选地进行铬释放测定以筛选肿瘤抗原-特异性cd8+t细胞。
适合在鉴定抗原-特异性t淋巴细胞中使用的抗原递呈细胞可以是，例如，表达期望抗原和所需mhc分子的肿瘤细胞系、表达常见mhc分子的已建立的抗原递呈细胞系、或源自与包含t淋巴细胞的群体相同的供体的抗原递呈细胞。
已建立的抗原递呈细胞系的一个实例是表达常见的hla-a*02:01等位基因的人淋巴样t2细胞系，其显示出缺陷性内在表位递呈并且可以在外部加载有短肽，例如合成肽：该细胞系可被用于筛选hla-a*02:01-限制性cd8+t淋巴细胞。另一个实例是人k562细胞系(缺乏hlai类和ii类表达)，其中可以将任何感兴趣的hla分子稳定引入或瞬时引入，因此可用于cd8+t淋巴细胞和cd4+t淋巴细胞筛选。
供体来源的抗原递呈细胞可以是例如分离的单核细胞(其成熟后成为树突细胞)。成熟的树突细胞表现出最佳的激活能力。
有用的供体来源的apc的另一个实例是爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)-永生化的b淋巴细胞，即所谓的淋巴母细胞细胞系(lcl)。由于lcl天生来源于b细胞，因此这些apc善于加工和递呈抗原。此外，lcl表达共刺激分子，如b7.1(cd80)和b7.2(cd86)以及有助于增强其刺激能力的合适粘附分子。可以将基因组减少的ebv突变菌株(小型ebv)用于产生缺少大部分裂解周期基因的小型ebv转化的b细胞(mlcl)，从而诱导t淋巴细胞的ebv依赖性激活(kempkes，b.等人(1995)immortalizationofhumanblymphocytesbyaplasmidcontaining71kilobasepairsofepstein-barrvirusdna.jvirol69(1):231-238.,1995；moosmann,等人,(2002)bcellsimmortalizedbyamini-epstein-barrvirusencodingaforeignantigenefficientlyreactivatespecificcytotoxictcells.blood100(5):1755-1764)。
可以将供体来源的lcl/mlcl用于评估t细胞特异性，特别是在需要对大量分离的t细胞克隆进行评价时。可以通过例如逆转录病毒转导ivtrna转染和供应外部肽或蛋白质来完成lcl/mlcl的抗原加载。
抗原-特异性t淋巴细胞的分离是基于对(i)与表达所需抗原的抗原递呈细胞孵育的t淋巴细胞和(ii)与对照抗原递呈细胞或在不存在抗原递呈细胞的情况下孵育的t淋巴细胞的激活特征的比较。
被(i)表达所需抗原的抗原递呈细胞激活并且未被(ii)对照抗原递呈细胞或在不存在抗原递呈细胞下激活表示t细胞克隆是抗原-特异性的。与未激活相比，激活表明与表达所需抗原的抗原递呈细胞孵育的t淋巴细胞的值(即，ifn-γ分泌)降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％。
er易位信号序列可以来源于内体/溶酶体相关蛋白。
在本公开的方法中使用的er-易位信号序列可以是定位于内体/溶酶体的蛋白质的分选序列。如在本文中所使用的定位于内体/溶酶体的蛋白质是指位于细胞的内体和/或溶酶体的膜或内腔的蛋白质。
定位于内体或溶酶体的蛋白质的实例是糖苷酶，如α-半乳糖苷酶a/gla、内切-β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶h/内切h、α-n-乙酰半乳糖胺酶/naga、半乳糖神经酰胺酶/galc、α-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶/naglu、葡糖神经酰胺酶/gba、α-半乳糖苷酶/α-gal、乙酰肝素酶/hpse、α-l-岩藻糖苷酶、肝素酶i、组织α-l-岩藻糖苷酶/fuca1、肝素酶ii、β-半乳糖苷酶-1/glb1、肝素酶iii、β-葡萄糖醛酸酶/gusb、氨基己糖苷酶a/hexa、β(1-3)-半乳糖苷酶、透明质酸裂解酶、β(1-4)-半乳糖苷酶、透明质酸酶1/hyal1、几丁质酶3-样1、透明质酸酶4/hyal4、几丁质酶3-样2、α-l-艾杜糖醛酸酶/idua、几丁质酶3-样3/ecf-l、壳二糖酶/ctbs、壳三糖酶/chit1、乳糖酶样蛋白/lctl、软骨素b裂解酶/软骨素酶b、溶酶体α-葡糖苷酶、软骨素酶abc、mbd4、软骨素酶ac、neu-1/唾液酸酶-1、胞质β-葡糖苷酶/gba3、o-连接的n-乙酰葡糖胺水解酶(o-glcnacase/oga)、内切-β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶f1/内切f1、n-糖酰胺酶f(pngasef)、内切-β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶f3/内切f3、spam1；溶酶体内蛋白酶、如amsh/stambp、组织蛋白酶h、组织蛋白酶3、组织蛋白酶k、组织蛋白酶6、组织蛋白酶l、组织蛋白酶7/组织蛋白酶1、组织蛋白酶o、组织蛋白酶a/溶酶体羧肽酶a、组织蛋白酶s、组织蛋白酶b、组织蛋白酶v、组织蛋白酶c/dppi、组织蛋白酶x/z/p、组织蛋白酶d、半乳糖神经酰胺酶/galc、组织蛋白酶f、
er易位信号序列来源于内体/溶酶体相关蛋白。内体/溶酶体相关蛋白可以是lamp1，lamp2，dc-lamp，cd68或cd1b，优选lamp1。优选地，er易位信号源于人类。er易位信号序列可以包含seqidno：33、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44和seqidno：46中的至少一种的序列。在一些实施方式中，er易位信号序列可以由选自由seqidno：34、seqidno：41、seqidno：43、seqidno：45、seqidno：47所组成组的序列之一组成。在具体实施方式中，er易位信号序列包含序列seqidno：33或其片段。在更具体的实施方式中，er易位信号序列由以下序列seqidno：34组成。
内体/溶酶体靶向序列可以来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。内体/溶酶体靶向序列通常是跨膜胞质结构域的一部分。因此，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。优选地，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域源于人类。通常，内体/溶酶体靶向序列包含基序y-xx，随后接着疏水性氨基酸。优选地，内体/溶酶体靶向信号序列是yqri。包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以包含序列seqidno：54或其片段。例如，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以包含序列seqidno：35或其片段。
术语疏水性氨基酸是本领域技术人员所熟知的。疏水氨基酸的实例是ala、ile、leu、phe、val、pro、gly、met、trp、tyr、pro、cys。
通常，抗原递呈细胞选自树突细胞、激活的b细胞、单核细胞、巨噬细胞、ebv转化的淋巴母细胞系，优选树突细胞，更优选源于单核细胞的树突细胞。
抗原递呈细胞可以包含不同群体的抗原递呈细胞，每个群体表达不同的抗原融合蛋白。
在一些实施方式中，抗原递呈细胞是通过包括以下步骤的方法产生的成熟树突细胞：i)提供单核细胞；ii)将步骤i)的单核细胞与il-4和gm-csf孵育；iii)将步骤ii)的单核细胞与il-4和gm-csf及成熟混合物组合孵育。
成熟混合物可以包含选自由il-β、tnf-α、inf-γ、tlr7/8激动剂、pge2和tlr3激动剂或其组合所组成的组中的至少一种组分。例如，tlr7/8激动剂可以是r848和/或tlr3激动剂可以是聚(i:c)。步骤ii)的孵育可以持续至少2天。步骤iii)的孵育可持续至少12小时，优选24小时。
通常，包含t淋巴细胞的细胞群是外周血淋巴细胞的群体。包含t淋巴细胞的细胞群可以是未经分离的外周血淋巴细胞的群体。细胞群可以富含t淋巴细胞，优选cd8+和/或cd4+t淋巴细胞。
本发明的另一个方面涉及表达载体，其包含：
-人内质网(er)-易位信号序列，和
-包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域。
载体可以包含用于体外mrna转录的启动子。er易位信号序列源自内体/溶酶体相关蛋白，例如lamp1、lamp2、dc-lamp、cd68、cd1b，优选lamp1。优选地，er易位信号源于人类。在具体的实施方式中，er易位信号包含序列seqidno：33或其片段。在更具体的实施方式中，er易位信号由以下序列seqidno：34组成。
内体/溶酶体靶向序列可以来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。内体/溶酶体靶向序列通常是跨膜胞质结构域的一部分。因此，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。优选地，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域源于人类。
通常，内体/溶酶体靶向序列包含基序y-xx，随后接着疏水性氨基酸(x代表任何天然存在的氨基酸)。优选地，内体/溶酶体靶向信号是yqri。包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以包含序列seqidno：54或其片段。例如，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以包含序列seqidno：35或其片段。
在一些实施方式中，表达载体还包含位于er易位信号和包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域之间的限制性位点。在其它实施方式中，载体还包含插入在人内质网(er)-易位信号和包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域之间的至少一种抗原或其片段。
在具体的实施方式中，载体包含编码至少两种抗原或其片段的序列。载体可以包含编码至少三种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种抗原或其片段的序列。载体可以包含编码少于100种、少于50种、少于40种、少于30种、少于20种、少于10种抗原或其片段的序列。
在一些实施方式中，载体包含编码抗原的氨基酸序列全长的核酸序列。可替换地，载体包含编码抗原的氨基酸序列的核酸序列的片段。如图12所示，其中已经导入了包含两种不同抗原的片段的载体的抗原递呈细胞可以诱导对这两种抗原具有特异性的不同tcr的激活。
通常，抗原是肿瘤抗原或病毒抗原。肿瘤抗原可以选自由病毒肿瘤抗原、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原和携带患者特异性突变并在患者的肿瘤细胞中表达的抗原所组成的组。
病毒肿瘤抗原(也称为致癌病毒抗原)是致癌病毒的抗原，如致癌dna病毒(例如，如乙型肝炎病毒、疱疹病毒和乳头瘤病毒的病毒)和致癌rna病毒。肿瘤特异性抗原是指仅由肿瘤细胞表达的肿瘤相关突变。肿瘤相关抗原的组包括，例如组织特异性癌症/睾丸抗原或组织分化抗原，如mart-1、酪氨酸酶或cd20。优选地，肿瘤抗原是肿瘤相关抗原，更优选地，肿瘤相关抗原是癌症/睾丸抗原(c/t抗原)。c/t抗原可以选自包含mage家族成员的组(例如mage-a1、mage-a3、mage-a4，但不限于这些)、包含单点突变的肿瘤抗原、ny-eso1、肿瘤/睾丸抗原1b、gage-1、ssx-4、xage-1、bage、gage、scp-1、ssx-2、ssx-4、ctz9、ct10、sage和cage。优选地，c/t抗原可以选自由gage-1、ssx-4和xage-1所组成的组。优选地，携带患者特异性突变并在患者的肿瘤细胞中表达的抗原在患者的非癌性细胞中不表达。
本发明的另一个方面涉及表达至少一种融合蛋白的抗原递呈细胞，特别是树突细胞，该融合蛋白包含
-至少一种抗原或其片段，
-在抗原n-末端前端的内质网(er)-易位信号序列，和
-在抗原c-末端后端的包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域。
本发明的另一个方面涉及如在本文中所述的表达载体用于在体外产生抗原-特异性t淋巴细胞的用途。
本发明的另一个方面涉及用于在预防或治疗癌症的方法中使用的t-淋巴细胞，该方法包括向哺乳动物施用由本文所述的方法所产生的t-淋巴细胞。
另一个方面涉及用于产生抗原-特异性tcr的方法，其包括上述方法的步骤并且还包括从由本文所述的方法所产生的激活的抗原-特异性淋巴细胞中分离tcr的步骤。
tcr的分离和随后序列分析记载在例如steinle等人中(invivoexpansionofhla-b35alloreactivetcellssharinghomologoustcellreceptors:evidenceformaintenanceofanoligoclonallydominatedallospecificitybypersistentstimulationwithanautologousmhc/peptidecomplex.thejournalofexperimentalmedicine,181(2),503–13；1995)。例如，可以通过pcr或新一代测序方法来进行序列分析。鉴定核酸序列的方法对于本领域技术人员而言是熟知。
tcr由两种不同的蛋白质链(a和b)组成。tcrα链包含可变区(v)、连接区(j)和恒定区(c)。tcrα链包含可变区(v)、多变区(d)、连接区(j)和恒定区(c)。tcrα链和tcrβ链二者的重排区v(d)j都含有高变区(cdr，互补决定区)，该高变区中的cdr3区决定了特异性表位识别。
本发明的一个方面涉及对gage-1具有特异性的tcr。在一个实施方式中，对gage-1具有特异性的tcr特异性地识别选自由seqidno：48和seqidno：49所组成的组的氨基酸序列或其片段中的至少一种。该片段的长度可以为至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或更多个氨基酸。tcr可以特异性地结合至由seqidno：48和seqidno：49所组成的组的氨基酸序列或其片段中的至少一种。
对gage-1具有特异性的tcr可以包含tcrα链和tcrβ链，tcrα链具有与seqidno：7具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列，tcrβ链具有与seqidno：8具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列。
某些实施方式涉及对gage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含具有seqidno：7的氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：8的氨基酸序列的tcrβ链。
此外，本申请涉及对gage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链包含与seqidno：7具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：3的序列的cdr3；
-tcrβ链包含与seqidno：8具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：4的序列的cdr3。
某些实施方式涉及对gage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链包含与seqidno：7具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：3的序列的cdr3；
-tcrβ链包含与seqidno：8具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：4的序列的cdr3。
某些实施方式涉及对gage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含由核苷酸序列编码的tcrα链(该核苷酸序列与seqidno：5具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性)，和由核苷酸序列编码的tcrβ链(该核苷酸序列与seqidno：6具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性)。
某些实施方式涉及对gage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含由核苷酸序列seqidno：5编码的tcrα链和由核苷酸序列seqidno：6编码的tcrβ链。
此外，本申请涉及对gage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链由与seqidno：5具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：1所示的核苷酸序列编码的cdr3区；
-tcrβ链由与seqidno：6具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：2所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
某些实施方式涉及对gage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链由与seqidno：5具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码并且包含由seqidno：1所示的核苷酸序列编码的cdr3区；
-tcrβ链由与seqidno：6具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码并且包含由seqidno：2所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
本申请的另一个方面涉及对ssx-4具有特异性的tcr，该tcr包含与seqidno：15具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的tcrα链和与seqidno：16具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的tcrβ链。
某些实施方式涉及对ssx-4具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含具有seqidno：15的氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：16的氨基酸序列的tcrβ链。
此外，本申请涉及对ssx-4具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链包含与seqidno：15具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：11的序列的cdr3；
-tcrβ链包含与seqidno：16具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：12的序列的cdr3。
某些实施方式涉及对ssx-4具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链包含与seqidno：15具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：11的序列的cdr3；
-tcrβ链包含与seqidno：16具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：12的序列的cdr3。
某些实施方式涉及对ssx-4具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含由与seqidno：13具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码的tcrα链和由与seqidno：14具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码的tcrβ链。
某些实施方式涉及对ssx-4具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含由核苷酸序列seqidno：13编码的tcrα链和由核苷酸序列seqidno：14编码的tcrβ链。
此外，本申请涉及对ssx-4具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链由与seqidno：13具有至少80％同一性的核苷酸序列编码并且包含由seqidno：9所示的核苷酸序列编码的cdr3区；
-tcrβ链由与seqidno：14具有至少80％同一性的核苷酸序列编码并且包含由seqidno：10所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
某些实施方式涉及对ssx-4具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链由与seqidno：13具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码并且包含由seqidno：9所示的核苷酸序列编码的cdr3区；
-tcrβ链由与seqidno：14具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码并且包含由seqidno：10所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
本发明的一个方面涉及对xage-1具有特异性的tcr。在一个实施方式中，对xage-1具有特异性的tcr特异性地识别选自由seqidno：50和seqidno：51所组成的组的氨基酸序列或其片段中的至少一种。该片段的长度可以为至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或更多个氨基酸。tcr可以特异性地结合至选自由seqidno：50和seqidno：51所组成的组的氨基酸序列或其片段中的至少一种。
对xage-1具有特异性的tcr可以包含tcrα链和tcrβ链，tcrα链具有与seqidno：23具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列，tcrβ链具有与seqidno：24具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列。
某些实施方式涉及对xage-1具有与特异性的tcr受体，该tcr受体包含具有seqidno：23的氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：24的氨基酸序列的tcrβ链。
此外，本申请涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链包含与seqidno：23具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且包含具有seqidno：19的序列的cdr3；
-tcrβ链包含与seqidno：24具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且包含具有seqidno：20的序列的cdr3。
某些实施方式涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链包含与seqidno：23具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：19的序列的cdr3；
-tcrβ链包含与seqidno：24具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列并且包含具有seqidno：20的序列的cdr3。
某些实施方式涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含由核苷酸序列编码的tcrα链(该核苷酸序列与seqidno：21具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性)和由核苷酸序列编码的tcrβ链(该核苷酸序列与seqidno：22具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性)。
某些实施方式涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含由核苷酸序列seqidno：21编码的tcrα链和由核苷酸序列seqidno：22编码的tcrβ链。
此外，本申请涉及对xage-1具有与特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链由与seqidno：21具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：17所示的核苷酸序列编码的cdr3区；
-tcrβ链由与seqidno：22具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：18所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
某些实施方式涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链由与seqidno：21具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：17所示的核苷酸序列编码的cdr3区；
-tcrβ链由与seqidno：22具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：18所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
本申请的另一个方面涉及对xage-1具有特异性的tcr，该tcr包含与seqidno：31具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的tcrα链，和与seqidno：32具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列的tcrβ链。
某些实施方式涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含具有seqidno：31的氨基酸序列的tcrα链和包含seqidno：32的氨基酸序列的tcrβ链。
此外，本申请涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链包含与seqidno：31具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且包含具有seqidno：27的序列的cdr3；
-tcrβ链包含与seqidno：32具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且包含具有seqidno：28的序列的cdr3。
某些实施方式涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链包含与seqidno：31具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列，并且包含具有seqidno：27的序列的cdr3；
-tcrβ链包含与seqidno：32具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列，并且包含具有seqidno：28的序列的cdr3。
某些实施方式涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含由与seqidno：29具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码的tcrα链，和由与seqidno：30具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码的tcrβ链。
某些实施方式涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含由核苷酸序列seqidno：29编码的tcrα链和由核苷酸序列seqidno：30编码的tcrβ链。
此外，本申请涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链由与seqidno：29具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：25所示的核苷酸序列编码的cdr3区；
-tcrβ链由与seqidno：30具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：26所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
某些实施方式涉及对xage-1具有特异性的tcr受体，该tcr受体包含tcrα链和tcrβ链，其中
-tcrα链由与seqidno：29具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：25所示的核苷酸序列编码的cdr3区；
-tcrβ链由与seqidno：30具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码，并且包含由seqidno：26所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
本申请还涉及编码如上定义的tcr的核酸分子。
整个核酸序列中有用的变化可能是密码子优化。
可以在表达的氨基酸序列内进行引起保守性替换的改变。可以在不影响功能的tcr链氨基酸序列的互补决定区和非互补决定区中进行这些变化。通常，不应在cdr3区进行增加和缺失。
本领域技术人员理解“保守性氨基酸替换”的概念，并且其优选地表示编码带正电荷的残基(h、k和r)的密码子被编码带正电荷的残基的密码子替换，编码带负电荷的残基(d和e)的密码子被编码带负电荷残基的密码子替换，编码中性极性残基(c、g、n、q、s、t和y)的密码子被编码中性极性残基的密码子替换，以及编码中性非极性残基(a、f、i、l、m、p、v和w)的密码子被编码中性非极性残基的密码子替换。这些变化可以自发发生，可以通过随机诱变引入变化，或者可以通过定向诱变引入变化。可以进行这些改变，但不破坏这些多肽的基本特征。普通技术人员可以容易地和常规地筛选氨基酸变体和/或编码它们的核酸，以确定这些变体是否通过本领域已知的方法显著降低或破坏配体结合能力。
表位标签是可以产生特异性抗体的氨基酸的较短延伸部分，在一些实施方式中其允许人们特异性地鉴定和追踪已经添加到活生物体或被培养的细胞中具有标签的蛋白质。可以使用许多不同的技术来实现检测标签分子。这些技术的实例包括：免疫组织化学、免疫沉淀，流式细胞术、免疫荧光显微术、elisa、免疫印迹(“western”)和亲和层析。表位标签将已知表位(抗体结合位点)添加至受试者蛋白上，以提供已知且通常高亲和力的抗体的结合，从而允许人们特异性鉴定和追踪已经添加至活生物体或被培养的细胞中具有标签的蛋白质。
在本发明的上下文中，“功能性”tcrα和/或β链融合蛋白应该表示例如通过增加、缺失或替换氨基酸而被修饰的tcr或tcr变体，该tcr或tcr变体至少维持基本的生物活性。在tcr的α-和/或β-链的情况下，这表示两条链都能够形成发挥其生物学功能(特别是与所述tcr的特异性肽-mhc复合物结合，和/或特异性肽:mhc相互作用时的功能性信号转导)的t细胞受体(具有未修饰的α-和/或β-链或具有其它创造性的融合蛋白α-和/或β-链)。
在具体的实施方式中，tcr可以被修饰成功能性t-细胞受体(tcr)α-和/或β-链融合蛋白，其中所述表位-标签的长度为6至15个氨基酸，优选9至11个氨基酸。在另一个实施方式中，tcr可以被修饰成功能性t-细胞受体(tcr)α-和/或β-链融合蛋白，其中所述t-细胞受体(tcr)α-和/或β-链融合蛋白包含两个或更多个被间隔开或直接相连的表位-标签。只要融合蛋白保持其生物活性/多种活性(“功能性”)，那么融合蛋白的实例可以含有2个、3个、4个、5个或甚至更多个表位标签。
优选的是根据本发明的功能性t-细胞受体(tcr)α-和/或β-链融合蛋白，其中所述表位-标签选自但不限于cd20或her2/neu标签或其它常规的标签，如myc-标签、flag-标签、t7-标签、ha(血凝素)-标签、his-标签、s-标签、gst-标签或gfp-标签。myc、t7、gst、gfp标签是来自现有分子的表位。然而，flag是设计用于高抗原性的合成表位标签(参见，例如美国专利第4,703,004号和第4,851,341号)。可以优选使用myc标签，因为可获得的高质量的试剂可用于其检测。表位标签除了被抗体识别外，当然还可以具有一种或多种其它功能。这些标签的序列记载在文献中并为本领域技术人员所熟知。
本发明的另一个方面涉及表达如上定义的tcr的t细胞。
此外，本发明涉及包含一种或多种编码如上定义的tcr的核酸序列的载体。载体优选为质粒、穿梭载体、噬菌粒(phagemide)、柯斯质粒载体(cosmid)、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或颗粒和/或用于基因治疗的载体。
“载体”是具体将核酸序列携带到合适宿主细胞中的能力的任何分子或组合物，在宿主细胞中可以合成经过编码的多肽。通常且优选地，载体是使用本领域已知的重组dna技术已经被工程化的核酸，以并入所需的核酸序列(例如，本发明的核酸)。载体可以包含dna或rna和/或包含脂质体。载体优选为质粒、穿梭载体、噬菌粒、柯斯质粒载体、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或颗粒和/或用于基因治疗的载体。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可以包含本领域普通技术人员已知的一种或多种选择标志物基因和其它遗传元件。载体优选为表达载体，其包含根据本发明的核酸，本发明的核酸可操作地连接至允许表达所述核酸的序列。
在本发明的另一个方面，提供了已经导入了编码上述tcr的以上核酸序列的细胞。在该t细胞中，可以引入包含编码上述tcr的核酸序列的上述载体、或者可以引入编码所述tcr的体外转录的rna。细胞可以是外周血淋巴细胞，如t细胞。例如，克隆和外源表达tcr的方法记载在engels等人中(relapseoreradicationofcancerispredictedbypeptide-majorhistocompatibilitycomplexaffinity.cancercell,23(4),516–26.2013)。
本申请的另一个方面涉及用作药物的tcr或表达如上定义的tcr的细胞。因此，本申请还涵盖包含tcr或表达上述tcr的细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。某些实施方式是指用于在治疗涉及表达gage-1、ssx-4、xage-1或其混合的恶性细胞的疾病的tcr或表达如上定义的tcr的细胞。因此，本申请还涉及用于治疗癌症的如上定义的tcr。因此，本申请涉及治疗需要过继性细胞疗法的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文定义的药物组合物。患者可能患有涉及表达gage-1、ssx-4、xage-1或其混合的恶性细胞的疾病。
那些本发明的活性组分优选地用于这类药物组合物中，用于与可接受的载体或载体材料混合的剂量中，因而可以治疗或至少减轻疾病。这些组合物(除了活性组分和载体之外)还可以包含填充材料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它现有技术已知的材料。
术语“药学上可接受的”定义为不影响活性组分的生物活性有效性的无毒材料。载体的选择取决于应用。
药物组合物可以含有增强活性组分活性或补充治疗的其它组分。这类其它组分和/或因素可以是药物组合物的一部分以实现协同效应或将不利的或不希望的影响最小化。
用于本发明活性组分的制剂或制备和施用/药物治疗的技术公布于“remington'spharmaceuticalsciences”，mack出版公司，easton,pa，最新版。合适的施用是肠胃外施用，例如肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、结节内、腹膜内或瘤内注射。静脉注射是治疗患者的优选方法。
根据优选的实施方式，药物组合物是输液或注射剂。
可注射的组合物是药学上可接受的流体组合物，其包含至少一种活性成分，例如表达tcr的扩增的t-细胞群体(例如，待治疗患者的自体或同种异体的t-细胞群体)。通常将活性成分溶解或悬浮在生理上可接受的载体中，并且组合物可以额外包含少量的一种或多种无毒辅助物质，如乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等。可用于与本公开的融合蛋白一起使用的这种可注射组合物是常规的；对于本领域普通技术人员而言，合适的制剂是众所周知的。
实施例
通过crosstag载体验证有效的mhcii类交叉递呈
为了获得rna编码的蛋白质的mhcii类交叉递呈，将选定的抗原dna序列与mhcii类靶向信号(crosstag)偶联。为此，将人溶酶体相关膜蛋白1(lamp-1)5'的er-易位信号与人dc-lamp的多个跨膜胞质结构域融合。通过多个独特的限制性位点将这两个信号组分分隔开，该限制性位点允许将框中的选定抗原序列与crosstag整合在一起。lamp-1信号肽用于促进将新合成的蛋白质共翻译易位到er中。在易位后，细胞质dc-lamp靶向信号(yxxφ基序；x代表任何天然存在的氨基酸；φ代表任何疏水性氨基酸；seqidno：38)应确保蛋白有效地穿梭至内体/溶酶体区室。
我们整合了爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原(ebna)-3c的部分编码序列，其编码含有针对ebna-3c特异性cd4+t细胞克隆3h10(hla-drb1*11:01是受限的)的已知表位的1kb片段(记载于xiaojunyu等人：antigen-armedantibodiestargetingblymphomacellseffectivelyactivateantigen-specificcd4+tcells.blood2015mar5；125(10):1601-10.；http://www.iedb.org/assayid/2445148中)。采用仅包含一种信号或两种信号都不包含的其它构建体来评估每个序列对期望的mhcii类交叉递呈的必要性(图1a)。随后从线性化质粒体外转录rna，并将该rna转染至表达所需限制元件hla-drb1*11:01的不同apc中。在具有转染有ebna-3ccrosstag-rna的dc和小型ebv转化的淋巴母细胞系(mlcl)的共同培养实验中，对特异性抗原识别后由克隆3h10所产生的ifn-γ的测定允许检测到内源性翻译和加工的蛋白质的有效mhcii类交叉递呈(图1b)。只有含有lamp-1er-易位信号的ivt-rna导致可检测到的t细胞激活。在与用ebna-3c-crosstag-rna实现的显著的mhcii类递呈相比较时，单独的lamp-1信号肽赋予的交叉递呈能力较小。我们采用对ebv-抗原bnrf1的hla-drb1*15:01-限制性表位具有特异性的另一种cd4+t细胞克隆证实了这一数据(数据未显示)。
接下来，我们采用3h10t细胞来阐明crosstag信号是否是经由1)蛋白质分泌和再摄取或2)细胞内部递呈途径导致mhcii类递呈。为此，我们用ebna-3c-crosstag-rna转染hla-drb1*11:01阳性dc或hla-drb1*11:01阴性dc。将转染的和未转染的dc以所有可能的组合(hla-drb1*11:01-阳性/阴性)共孵育，并随后与3h10细胞共培养。只有在hla-drb1*11:01阳性dc转染有抗原-crosstag-rna时，才检测到apc的识别。未检测到未转染的hla-drb1*11:01-阳性dc(其具有潜在的摄取和加工由hla-drb1*11:01-阴性dc分泌的抗原的能力)的识别(图8)。
抗原-crosstag诱导的cd40l表达
为了开发用于选择性富集抗原-特异性cd4+t细胞的快速方法，我们评估了抗原-crosstag-rna转染的dc在应答cd4+t细胞中诱导cd40l表达的能力。为此，我们用荧光示踪染料对3h10t细胞进行染色，并将它们与自体pbl混合至总细胞的10％、5％、1％或0.1％的终浓度(图1c)。将这些不同成分与ebna-3c-crosstagivt-rna转染的自体dc共培养，并进行染色用于cd40l表达。共培养6小时后，我们在ebna-3c特异性3h10细胞中检测到大量的cd40l表达，但在自体pbl中仅观察到少量cd40l表达。即使在3h10细胞的最低浓度(0.1％)下，在66％的3h10细胞群中随后分选出cd40l-阳性cd4+t细胞。
可选的er易位信号序列
在测定在特异性抗原识别后由3h10克隆产生的ifn-γ时，我们能够在转染有不同的标记有crosstag-rna和crosstag-rna的不同替代物的ebna-3c的apc的共培养实验中检测到内源性翻译和加工的蛋白质的有效mhcii类交叉递呈(图11)。
有效的mhcii类递呈和mhci类递呈
我们可以证明采用crosstag-信号不仅有利于mhcii类递呈，还有利于mhci类递呈(图12)。
有效递呈由相同的ivt-mrna分子编码的几种抗原
此外，我们可以建立通过相同的ivt-mrna递呈起源自不同抗原的多个表位的有效方法。如图12所示，表达包含起源自不同抗原的两个表位的构建体的抗原递呈细胞激活ebna-3c特异性克隆3h10和酪氨酸酶特异性克隆ivsb。因此，具有两个不同表位的ivt构建体有助于这两种表位的递呈。
用负载rna的dc激活pbl
为了得到高通量方法，我们探索了采用平行的多种候选抗原以激发cd4+t细胞的可能性。因此，采用转染有ivt-rna物质的dc激活存在于未经分离的pbl中的cd4+t细胞，该ivt-rna物质编码四种不同的与crosstag-信号融合的c/t-抗原(gage-1、mage-a4、ssx-4和xage-1)。通过电穿孔法用每种ivt-rna分别转染dc，如记载于(javorovic,m.等人.(2008)inhibitoryeffectofrnapoolcomplexityonstimulatorycapacityofrna-pulseddendriticcells.jimmunother31(1):52-62)中的。我们通过流式细胞术以共刺激分子的表达水平来测定经转染的dc的成熟状态。我们的dc显示了具有高表达的共刺激分子(cd80、cd83、cd86)和hlaii类的成熟表型(图9a)。
为了评价转染效率，通过定量rt-pcr分析源自从转染的dc提取的mrna的抗原cdna。获得的数据显示在电穿孔后的c/t-抗原mrna拷贝数增加了1.5*105至2*107倍的范围(图9b)。此外，在转染对照egfpivt-rna后12小时，通过流式细胞术检测到约68％的dc表达出增强的绿色荧光蛋白(egfp)(数据未显示)。
在用抗原-crosstagrna转染后，汇集四种单独的dc群体，并同时使用以激发健康供体的未经分离的自体pbl。随后的扩增方法包括两轮apc刺激。将初始dc制剂的冷冻等分试样解冻，并将它们用于再刺激培养物。
分离激活的cd4+t细胞
在dc共培养每次间隔14天后，激发的自体pbl显示细胞数目总体增加3-4倍。在多个时间点测定cd4:cd8比率的变化，以示踪激活的cd4+t细胞的扩增。另外，在阻断cd40的抗体存在下，将pbl样品与加载抗原的dc共孵育，随后采用对cd4、cd137和cd40l具有特异性的单克隆抗体通过流式细胞术进行分析(图2a)。在监测期内，cd4:cd8比率从第0天的1.7反转为第27天的0.7，反映出cd8+t细胞的增殖增强(数据未显示)。然而，在cd4+t细胞群体中，cd40l-阳性t细胞的百分比从第13天的4.6％上升到第27天的30％以上。然而，推定的调节性t细胞(treg)(描述为cd137单阳性cd4+t细胞)的数量下降了约36％(schoenbrunn等人,aconverse4-1bbandcd40ligandexpressionpatterndelineatesactivatedregulatorytcells(treg)andconventionaltcellsenablingdirectisolationofalloantigen-reactivenaturalfoxp3+treg.jimmunol.2012；189(12):5985-94.)。
在第三次刺激周期后，从pbl培养物中富集cd40l-阳性cd4+t细胞，并通过facs将它们直接克隆到96孔板中(图10)。克隆的cd4+t细胞扩增。将克隆程序中的过量细胞确立为大量cd40l-阳性(cd40lpos)cd4+t细胞系和cd40l-阴性(cd40lneg)cd4+t细胞系。由于分选的cd40l阳性cd4+t细胞在c/t-抗原-特异性再刺激后的14天内增殖了近四倍，并且与rna转染的apc共培养后所释放后的ifn-γ的量与cd40l阴性t细胞相比显著更高，它们的分析表明成功富集了c/t-抗原-特异性的cd4+t淋巴细胞(图2b，c)。
筛选c/t-抗原-反应性cd4+t细胞克隆
我们在facs克隆后12天开始以ifn-γ释放测定法测试了在96孔培养物中扩增的t细胞克隆的抗原反应性(图3a)。采用所有四种抗原-crosstagrna-加载的dc的混合物的共培养表明，除了存在非反应性非特异性的t细胞克隆外还存在多种抗原反应性t细胞克隆。除少数例外，抗原反应性t细胞克隆在与模拟转染的dc共培养中未显示背景激活。
为了验证这些观察结果，我们采用经ivt-rna转染的mlcl作为apc的替代来源，在一天后重新测试选定的克隆。ifn-γ和gm-csf释放测定法证实了先前对dc的发现(图3b)。此外，为了cd4和cd8表面表达，将选定的t细胞克隆染色，并发现全部都表达cd4共受体(图3c)。
抗原-特异性cd4+t细胞克隆的分子和功能特征
为了分析抗原反应性cd4+t细胞克隆各自的抗原特异性，我们随后将单个克隆与用单种抗原-crosstagrna转染的不同apc群体共培养。使用标准elisa，通过ifn-γ分泌测定反应(图4)。我们检测了识别用于激发的四种c/t抗原中的每一种的抗原-特异性cd4+t细胞克隆。通过模拟转染的apc，t细胞克隆没有显示出背景激活，t细胞克隆也没有显示与其它抗原的任何可检测到的交叉反应性(在激发期间t细胞克隆暴露于该抗原)。
使用tcr库分析，我们从多个分离的克隆鉴定出4种独特的t细胞受体序列。mhc限制性测定法显示由不同的mhcii类同种异型递呈的不同t细胞识别的表位(数据未显示)。
通过提供有不含crosstag信号的ivt-rna的dc无法诱导分离的cd4+t细胞克隆分泌ifn-γ的事实，我们证明了将抗原与crosstag-信号融合的重要性(图5a)。只有在cd4+t细胞克隆与用抗原-crosstagrna转染的apc共培养时，才会引发激活诱导的ifn-γ分泌。一个例外是表达gage-1-tcr-2的t细胞克隆，该t细胞克隆还识别转染有缺乏各自分选信号的rna的apc，尽管识别水平非常低。
为了证实我们分离的cd4+t细胞克隆的抗原特异性，我们用重组蛋白加载apc。cd4+t细胞克隆对加载蛋白质的apc表现出ifn-γ分泌阳性结果，该ifn-γ分泌与在抗原-crosstagrna-转染的apc共培养中所观察到的激活相当(图5b)。
直接mhcii类表位鉴定
对于这4种克隆，采用直接确定mhcii类表位(depi)位置的方法来限定这4种克隆与mhcii类分子联合识别的表位(milosevic,s.等人.(2006)identificationofmajorhistocompatibilitycomplexclassii-restrictedantigensandepitopesoftheepstein-barrvirus)。我们用较短的重叠crosstag-rna构建体验证了对分离的抗原片段的识别，并使用它们进一步构建最小化的表位序列(图6a，6b)。据此，发现gage-1-tcr-1识别由hla-drb5*01:01递呈的gage-176–98表位。有趣的是，两种xage-1特异性的cd4+t细胞克隆识别相同的xage-137–49表位，该xage-137–49表位由两种不同的mhcii型同种异型(hla-drb1*13:02和hla-drb5*01:01)递呈。
c/t-抗原-特异性tcr的转基因表达
在分析tcr库后，我们采用tcr表达载体重建分离的tcr序列。用cd4+t细胞克隆gage-1-tcr-2、xage-1-tcr-1或xage-1-tcr-2的相应tcr-α和β链转染3h10克隆的cd4+t细胞(ebna-3c-特异性的和hla-drb1*11:01受限的)。将tcr工程化的3h10细胞与加载c/t-抗原的apc共培养(图7)。我们通过测定ifn-γ分泌，显示出所有cd4+t细胞克隆的特异性被成功转移至3h10细胞，而没有影响其内源性ebv-特异性的tcr。因此，在tcr转染后，3h10细胞识别ebna-3c-crosstagivt-rna-转染的apc以及转染有相应的c/t-抗原-crosstagivt-rna的apc。
方法
遗传构建体
采用pgem-egfp-a120载体作为crosstag-载体(s.milosevic)的起始构建体。原始pgem载体的聚a120变体使得经过转录的rna的稳定性更高并改善蛋白质表达。该质粒还包含位于egfpcdna5'末端的独特agei位点，以及位于3'末端的独特ecori位点。spei位点紧接着聚-a尾，其允许将用于ivt-rna生产的质粒线性化。
通过用编码crosstag靶向信号的cdna替代egfp来克隆pgem-crosstag-a120质粒。该crosstag序列由与dc-lamp(登录号：np_055213，376-416个氨基酸)的跨膜胞质结构域的5'融合的人溶酶体相关膜蛋白-1(lamp-1，登录号：np_005552，1-28个氨基酸)的er-易位信号组成。为了插入编码抗原的cdna，用含有nhei、kpni和psti限制性位点的18-bp的间隔序列将不同的crosstag序列分隔开，而不破坏lamp1开放阅读框(orf)。实际上使用计算克隆软件设计密码子优化的cross-tag序列，并由geneart(regensburg)进行合成。随后采用agei(5'末端)和ecori(3'末端)限制性位点将完整的crosstag序列从质粒dna切割掉，并将其连接到等量消化的pgem-a120载体的mcs中。
为了克隆各种c/t抗原-crosstag构建体(pgem-gage-1-crosstag-a120、pgem-mage-a4-crosstag-a120、pgem-ny-eso-1-crosstag-a120、pgem-ssx-4-crosstag-a120、pgem-xage-1-crosstag-a120)，通过pcr采用正向和反向基因特异性引物从质粒扩增抗原cdna(登录号：gage-1、u19142；mage-a4、nm_001011550；ny-eso1、aj003149；ssx-4、u90841；xage-1、af251237)，并经由nhei和psti/noti限制性位点连接。用于pcr反应的引物均可根据要求提供。将所有抗原序列插入pgem-crosstag-a120的不同(split)crosstag-信号中，而不破坏初始orf。
为了验证cd4+t细胞表位，合成互补寡核苷酸(metabion)并进行退火。将退火时所产生的粘性末端用于将这些短抗原序列直接连接到crosstag载体中。
产生ivt-rna
在将spei线性化之后，根据制造商的说明书，使用mmessagemmachinet7试剂盒(ambion)，将pgem-质粒作为产生单种体外转录(ivt)rna的模板。为了控制质量，通过琼脂糖凝胶电泳分析ivt-rna产物长度。通过nanodropnd-1000分光光度计(赛默飞世尔科技公司(thermoscientific))测定浓度和纯度。
细胞培养
按照bürdek等人的描述产生和转染源自单核细胞的3dmdc(journaloftranslationalmedicine2010,8:90)。通过按照bürdek等人的描述以电穿孔法实现mdc和小型-爱泼斯坦-巴尔病毒-(ebv)转化的淋巴母细胞系(mlcl)的rna转染(three-daydendriticcellsforvaccinedevelopment:antigenuptake,processingandpresentation.journaloftranslationalmedicine2010,8:90)。
按照先前记载使mlcl作为悬浮培养物在lcl培养基中生长(milosevic,s.等人.(2006)identificationofmajorhistocompatibilitycomplexclassii-restrictedantigensandepitopesoftheepstein-barrvirus)。通过在存在25μg重组人gage-1、mage-a4、ssx-4或xage-1蛋白下，将2*106个细胞在24孔板的2mllcl培养基中培养16小时(在hek-293t细胞中表达后经由6x-chis标签富集)来实现mlcl的蛋白质加载。在孵育期结束时，用rpmi1640洗涤细胞两次，并将其与特异性cd4+t细胞克隆共培养。
定量rt-pcr
将经转染dc和未转染dc的细胞rna分离出来，并使用用于rt-pcr的第一链cdna合成试剂盒(amv)(罗氏)以寡聚-dt引物合成相应的cdna。根据制造商的手册，采用
t细胞和dc的表面表型分型
用以下抗体检测由t细胞和dc表达的表面标志物：pe缀合的ccr7-特异性抗体(3d12)(ebioscience)、hz450缀合的cd4-特异性抗体(rpa-t4)、hz500缀合的cd8-特异性抗体(rpa-t8)、fitc缀合的cd14-特异性抗体(m5e2)、pe缀合的cd40-特异性抗体(5c3)、pe缀合的cd40l-特异性抗体(trap1)、pe缀合的cd80-特异性抗体(l307.4)、fitc缀合的cd83-特异性抗体(hb15e)、fitc缀合的cd86-特异性抗体(2331)、apc缀合的cd137-特异性抗体(4b4-1)、fitc缀合的dc-sign-特异性抗体(dcn46)、pe缀合的hla-dr-特异性抗体(g46-6)(均来自bdbiosciences)。洗涤后，将细胞在4℃下染色30分钟，并添加碘化丙啶(2μg/ml)以排除死亡细胞。通过流式细胞术分析所有表面标志物的表达(lsrii，bd)。使用flowjo8软件(treestar)完成采集后的数据分析。采用2μg/mlαcd40抗体(克隆g28.5，由柏林-勃兰登堡再生疗法中心的m.frentsch提供)，按照(frentsch,m.等人,(2005)directaccesstocd4+tcellsspecificfordefinedantigensaccordingtocd154expression.natmed11(10):1118-1124)的描述分析t细胞表面表达的cd40l，并在t细胞：apc共培养开始后6小时进行评估。
用rna转染的dc从头激发pbl
在分开的群体中用编码c/t-抗原gage-1、mage-a4、ssx-4和xage-1的2种单种crosstag-rna转染来自健康供体的3dmdc。在电穿孔后收获经转染的mdc，并且将混合物中的混合mdc与外周血淋巴细胞(pbl)(外周血淋巴细胞与混合mdc的比率在2:1内)共培养，其在产生mdc过程中的pbmc塑性粘附期间是不贴壁的。在37℃下在潮湿气氛中培养细胞。在1天后加入白细胞介素-2(il-2，20u/ml；chironbehring)和il-7(5ng/ml)(promokine)，之后每隔一天加入它们。将不用于pbl共培养的混合mdc冷冻保存，并将其解冻以用于对从头诱导的pbl培养物的再次刺激。
分离和扩增抗原-特异性cd4+t细胞
按照frentsch,m.描述的，在存在αcd40抗体下，将被激发的pbl与crosstag-rna转染的mdc(4种抗原的混合物)以2:1的比率共培养6小时(frentsch,m.,(2005)directaccesstocd4+tcellsspecificfordefinedantigensaccordingtocd154expression.natmed11(10):1118--1124)。在刺激期后，用αcd4-和αcd40l-特异性抗体(sk3和trap1；bdbiosciences)对细胞进行染色。添加dapi以排除死细胞。使用facsariaiii(bdbiosciences)，将活cd40l-阳性cd4+t细胞作为单细胞分选到圆底96孔板的孔中。采用抗原-crosstagivt-rna-转染的mlcl、饲养细胞和il-2扩增96孔板中的cd4+t细胞克隆。
细胞因子释放测定
为了测定激活诱导的细胞因子分泌，在37℃和潮湿气氛下，在圆底96孔板中将5*104个t细胞与1*105个加载有ivt-rna的apc(dc/mlcl)在200μlt细胞培养基中共培养。将用模拟转染的apc与t细胞或不在刺激细胞下的t细胞用作阴性对照。在共培养16小时后，收集上清液，并采用opteia人ifn-γ或gm-csf组合(均来自bdbiosciences)通过酶联免疫吸附测定法(elisa)进行评估。
基于ivt-rna的tcr基因转移
按照steinle,a.等人描述的，采用一组tcr-vα-和tcr-vβ-特异性引物通过pcr测定tcr-α-链和tcr-β-链重排和其序列(steinle,a.,等人,(1995)invivoexpansionofhla-b35alloreactivetcellssharinghomologoustcellreceptors:evidenceformaintenanceofanoligoclonallydominatedallospecificitybypersistentstimulationwithanautologousmhc/peptidecomplex.jexpmed181(2):503-513)。在用其鼠源对应物替换这两条tcr链的恒定区后，随后合成密码子优化的tcr-α-和tcr-β-链序列，并将其克隆到用于产生rna的表达载体中。为了验证这些tcr序列的特异性，用tcr-α-ivt-rna和tcr-β-ivt-rna共转染t细胞克隆3h10(hla-drb1*11:01受限的，ebvebna-3c特异性的)的细胞，并用于细胞因子分泌测定。
该申请还包括以下实施方式：
实施方式1：一种产生人抗原-特异性t淋巴细胞的方法，包括以下步骤：
a)在抗原递呈细胞中表达至少一种融合蛋白，所述融合蛋白包含
-至少一种抗原或其片段，
-在抗原n-末端前端的内质网(er)-易位信号序列，和
-在抗原c-末端后端的包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域；和
b)在体外将包含t淋巴细胞的细胞群暴露于步骤a)的抗原递呈细胞，以激活对由抗原递呈细胞表达的抗原具有特异性的抗原-特异性t淋巴细胞。
实施方式2：根据实施方式1的方法，其中步骤b)中的暴露是将抗原递呈细胞与包含t淋巴细胞的细胞群共培养。
实施方式3：根据实施方式1或2所述的方法，其中步骤a)的表达是瞬时表达或稳定表达，优选瞬时表达。
实施方式4：根据实施方式3的方法，其中瞬时表达是通过引入编码至少一种融合蛋白的ivt-rna来进行的。
实施方式5：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤
c1)富集激活的和/或抗原-特异性的t淋巴细胞。
实施方式6：根据实施方式5的方法，其中富集激活的t淋巴细胞包括以下步骤：
(a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群与至少一种结合分子或与至少一种递呈所需抗原的表位的mhc分子接触，该结合分子与由激活的t淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白特异性结合；
(b)分离与至少一种结合分子或至少一种递呈所需抗原的表位的mhc分子结合的t淋巴细胞。
实施方式7：根据实施方式6的方法，其中与标志物蛋白特异性结合的结合分子是抗体、抗体衍生物、抗体片段或前述与其它分子的缀合物。
实施方式8：根据实施方式6或7所述的方法，其中由激活的t淋巴细胞特异性表达的至少一种标志物蛋白选自包括ox40、cd137、cd40l、pd-1、il-2受体、干扰素γ、il-2、gm-csf和tnf-α的组。
实施方式9：根据实施方式8的方法，其中在步骤(a)中，细胞进一步与特异性结合至cd4的结合分子接触。
实施方式10：根据实施方式8或9的方法，其中在步骤(a)中，细胞进一步与特异性结合至cd8的结合分子接触。
实施方式11：根据实施方式6的方法，其中选择激活的cd4t细胞包括以下步骤：
(a1)使步骤b)的细胞群与抗cd40的抗体接触，以阻断抗原递呈细胞的cd40-cd40l与抗原-特异性t淋巴细胞之间的相互作用，并使cd40l在t淋巴细胞表面积累；
(a2)使包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群与抗-cd40l抗体接触；
(b)分离标记有抗-cd40l抗体和抗-cd4抗体的t淋巴细胞。
实施方式12：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤
c2)鉴定抗原-特异性t淋巴细胞，包括以下步骤：
a)将包含激活的抗原-特异性t淋巴细胞的细胞群的扩增细胞克隆与以下各项孵育
(i)如步骤a)中定义的抗原递呈细胞，和
(ii)对照抗原递呈细胞或不存在抗原递呈细胞；
b)比较每种细胞克隆与(i)和(ii)孵育的激活特征；
c)基于b)的比较，鉴定抗原-特异性细胞克隆；
其中，被(i)激活但不被(ii)激活表明细胞克隆是抗原-特异性的。
实施方式13：根据前述实施方式中任一项的方法，其中在步骤b)中，至少一次、可选地至少两次、可选地至少三次或可选地三次将抗原递呈细胞添加至包含t淋巴细胞的细胞群。
实施方式14：根据实施方式12的方法，其中重复添加抗原递呈细胞之间的时间间隔是7至21天、优选地12至16天、更优选地13至15天、甚至更优选地14天。
实施方式15：根据前述实施方式中任一项的方法，其中er易位信号序列来源于内体/溶酶体相关蛋白。
实施方式16：根据实施方式15的方法，其中内体/溶酶体相关蛋白选自包括lamp1、lamp2、dc-lamp、cd68和cd1b的组，优选lamp1。
实施方式17：根据前述实施方式中任一项的方法，其中内体/溶酶体靶向序列来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。
实施方式18：根据前述实施方式中任一项的方法，其中包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。
实施方式19：根据前述实施方式中任一项的方法，其中er易位信号序列源于人类。
实施方式20：根据前述实施方式中任一项的方法，其中包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域源于人类。
实施方式21：根据前述实施方式中任一项的方法，其中er易位信号包含序列seqidno：33或其片段。
实施方式22：根据实施方式20的方法，其中er易位信号序列由序列seqidno：34组成。
实施方式23：根据前述实施方式中任一项的方法，其中抗原递呈细胞选自树突细胞、激活的b细胞、单核细胞、巨噬细胞、ebv转化的淋巴母细胞系，优选树突细胞，更优选单核细胞衍生的树突细胞。
实施方式24：根据前述实施方式中任一项的方法，其中抗原递呈细胞包含抗原递呈细胞的不同群体，每个群体表达不同的抗原融合蛋白。
实施方式25：根据前述实施方式中任一项的方法，其中抗原递呈细胞是通过包括以下步骤的方法产生的成熟树突细胞：
i)提供单核细胞；
ii)将步骤i)的单核细胞与il-4和gm-csf孵育；
iii)将步骤ii)的单核细胞与il-4和gm-csf及成熟混合物组合孵育。
实施方式26：根据实施方式25的方法，其中成熟混合物包括il-β、tnf-α、inf-γ、tlr7/8激动剂、pge2和tlr3激动剂的组合。
实施方式27：根据实施方式25或26的方法，其中步骤ii)的孵育持续至少2天。
实施方式28：根据实施方式25至27的方法，其中步骤iii)的孵育持续至少12小时，优选24小时。
实施方式29：根据实施方式28的方法，其中tlr7/8激动剂是r848并且其中tlr3激动剂是聚(i:c)。
实施方式30：根据前述实施方式中任一项的方法，其中包含t淋巴细胞的细胞群是外周血淋巴细胞的群体。
实施方式31：根据前述实施方式中任一项的方法，其中包含t淋巴细胞的细胞群是未经分离的外周血淋巴细胞的群体。
实施方式32：根据前述实施方式中任一项的方法，其中细胞群富含t淋巴细胞，优选cd8+和/或cd4+t淋巴细胞。
实施方式33：前述实施方式中任一项的方法，其中融合蛋白包含至少两种抗原或其片段。
实施方式34：通过根据实施方式1至33的方法能够获得的t淋巴细胞。
实施方式35：一种表达载体，其包含：
-人内质网(er)-易位信号序列，和
-包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域。
实施方式36：根据实施方式1的表达载体，其中载体包含用于体外mrna转录的启动子。
实施方式37：根据实施方式35或36的表达载体，其中er易位信号序列来源于内体/溶酶体相关蛋白。
实施方式38：根据实施方式35至37中任一项的表达载体，其中内体/溶酶体相关蛋白选自包括lamp1、lamp2、dc-lamp、cd68、cd1b的组。
实施方式39：根据实施方式35至38中任一项的表达载体，其中内体/溶酶体靶向序列来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。
实施方式40：根据实施方式35至39中任一项的表达载体，其中包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域来源于lamp1或dc-lamp，优选dc-lamp。
实施方式41：根据实施方式35至40中任一项的表达载体，其中er易位信号序列源于人类。
实施方式42：根据实施方式35至41中任一项的表达载体，其中包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域源于人类。
实施方式43：根据实施方式35至42中任一项的表达载体，其中er易位信号序列包含seqidno：33的序列或其片段。
实施方式44：根据实施方式35至43中任一项的表达载体，其中er易位信号由seqidno：34的序列组成。
实施方式45：根据实施方式35至44中任一项的表达载体，其中内体/溶酶体靶向序列包含seqidno：38的基序。
实施方式46：根据实施方式35至45中任一项的表达载体，其中内体/溶酶体靶向信号序列是seqidno：39的序列。
实施方式47：根据实施方式35至46中任一项的表达载体，其中包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域包含序列seqidno：54或其片段，如seqidno：35或其片段。
实施方式48：根据实施方式35至47中任一项的表达载体，其还包含位于er易位信号序列与包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域之间的限制性位点。
实施方式49：根据实施方式35至48中任一项的表达载体，其中载体还包含插入在人内质网(er)-易位信号序列和包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域之间的至少一种抗原或其片段。
实施方式50：根据实施方式49中任一项的表达载体，其中载体包含插入在人内质网(er)-易位信号序列和包含内体/溶酶体靶向序列的人跨膜胞质结构域之间的至少两种抗原或其片段。
实施方式51：根据实施方式35至50中任一项的表达载体，其中载体包含编码抗原的氨基酸序列全长的核酸序列。
实施方式52：根据实施方式35至51中任一项的表达载体，其中载体包含编码抗原的氨基酸序列的核酸序列的片段。
实施方式53：根据实施方式52的表达载体，其中抗原是肿瘤抗原或病毒抗原。
实施方式54：根据实施方式53的表达载体，其中肿瘤抗原选自由病毒肿瘤抗原、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原和携带患者特异性突变并在患者的肿瘤细胞中表达的抗原所组成的组。
实施方式55：根据实施方式35至54中任一项的表达载体，其中肿瘤抗原是肿瘤相关抗原。
实施方式56：根据实施方式35至55中任一项的表达载体，其中肿瘤相关抗原是癌症/睾丸抗原(c/t抗原)。
实施方式57：根据实施方式35至56中任一项的表达载体，其中c/t抗原选自包括mage-a1、mage-a3、mage-a4、ny-eso1、肿瘤/睾丸-抗原1b、gage-1、ssx-4、xage-1、bage、gage、scp-1、ssx-2、ssx-4、ctz9、ct10、sage和cage的组。
实施方式58：根据实施方式35至57中任一项的表达载体，其中c/t抗原选自由gage-1、ssx-4和xage-1所组成的组。
实施方式59：根据实施方式35至58中任一项的表达载体用于体外产生抗原-特异性t淋巴细胞的用途。
实施方式60：用于在预防或治疗癌症的方法中使用的t-淋巴细胞，该方法包括向哺乳动物施用根据实施方式34的t-淋巴细胞。
实施方式61：一种产生抗原-特异性tcr的方法，包括根据实施方式1至33中任一项的方法的步骤，并且还包括从激活的抗原-特异性淋巴细胞分离tcr的步骤。
实施方式62：一种从根据实施方式34的淋巴细胞分离的tcr。
实施方式63：一种对gage-1具有特异性的tcr，其包含
-包含由seqidno：5所示的核苷酸序列编码的cdr3区的tcrα链，
-包含由seqidno：6所示的核苷酸序列编码的cdr3区的tcrβ链。
实施方式64：根据实施方式63的对gage-1具有特异性的tcr，其包含
-由与seqidno：5具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的tcrα链，并且该tcrα链包含由seqidno：1所示的核苷酸序列编码的cdr3区，
-由与seqidno：6具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的tcrβ链，并且该tcrβ链包含由seqidno：2所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
实施方式65：一种对ssx-4具有特异性的tcr，其包含
-包含由seqidno：13所示的核苷酸序列编码的cdr3区的tcrα链，
-包含由seqidno：14所示的核苷酸序列编码的cdr3区的tcrβ链。
实施方式66：根据实施方式65的对ssx-4具有特异性的tcr，其包含
-由与seqidno：13具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的tcrα链，并且该tcrα链包含由seqidno：9所示的核苷酸序列编码的cdr3区，
-由与seqidno：14具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的tcrβ链，并且该tcrβ链包含由seqidno：10所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
实施方式67：一种对xage-1具有特异性的tcr，其包含
-包含由seqidno：21所示的核苷酸序列编码的cdr3区的tcrα链，
-包含由seqidno：22所示的核苷酸序列编码的cdr3区的tcrβ链。
实施方式68：根据实施方式66的对xage-1具有特异性的tcr，其包含
-由与seqidno：21具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的tcrα链，并且该tcrα链包含由seqidno：17所示的核苷酸序列编码的cdr3区，
-由与seqidno：22具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的tcrβ链，并且该tcrβ链包含由seqidno：18所示的核苷酸序列编码的cdr3区。
实施方式69：一种对xage-1具有特异性的tcr，其包含
-包含由seqidno：29所示的核苷酸序列编码的cdr3区的tcrα链，
-包含由seqidno：30所示的核苷酸序列编码的cdr区的tcrβ链。
实施方式70：根据实施方式68的对xage-1具有特异性的tcr，其包含
-由与seqidno：29具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的tcrα链，并且该tcrα链包含由seqidno：25所示的核苷酸序列编码的cdr3区，
-由与seqidno：30具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的tcrβ链，并且该tcrβ链包含由seqidno：26所示的核苷酸序列编码的cdr区。
实施方式71：用于在预防或治疗癌症的方法中使用的根据实施方式62至70中任一项的tcr。
实施方式72：预防或治疗癌症的方法，其包括向哺乳动物施用根据实施方式62至70中任一项的tcr的步骤。