本发明属于生物
技术领域：
，涉及病原菌--小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测，具体涉及一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法及其应用。
背景技术：
：：小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica,Y.e)，简称耶氏菌，属于肠杆菌科耶尔森氏菌属，最早1933年发现于美国纽约州，由Frederiksen在1964年命名的，小肠结肠炎耶尔森氏菌在自然界分布很广，动物是该菌的重要宿主，几乎所有的家畜都曾发现该菌的自然感染，其中猪携带量最高，其次为犬、鸡、牛和羊等。小肠结肠炎耶尔森氏菌是一类人畜共患病病原菌，也是重要的食源性致病菌之一，很多国家都已将该菌列为进出口食品的常规检测项目，在过去的二十年间，欧、美等国家发生了多起的由该菌引起的食源性中毒事件;在上世纪80年代中期我国证实有两次大的暴发流行,造成五百多人感染,其原因均为食物污染小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的。该菌具有嗜冷性，能在冷藏条件下生长与繁殖，而且在一定条件下会产生耐热性肠毒素，是冷藏食品的一大威胁，尤其是贮藏于冰箱中的肉制品、奶制品。人感染后，其临床表现多样，其中以胃肠炎(或小肠结肠炎)最为常见，还能引起呼吸道、心脑血管系统、骨骼、结缔组织和全身疾病，甚至引起急性阑尾炎、败血症。许多动物都有可能受到小肠结肠炎耶尔森氏菌的感染，几乎所有家养动物都属于自然感染，其中一部分动物，如猪、牛、猫和狗等，被认为是小肠菌的健康带菌者。小肠结肠炎耶尔森氏菌典型的宿主动物是猪（带菌率最高），有50%的被侵染率。牛的被侵染率也很大，约为7.9%~24.6%。啮齿类动物的携菌几率大概在5.2%~10%之间，目前已检测出的本身携带小肠结肠炎耶尔森氏菌的啮齿动物有30多种。小肠结肠炎耶尔森氏菌是重要的人畜共患病微生物，能通过食物传播。该菌能够引起多种动物以及人的小肠结肠炎耶尔森氏菌病。正因如此很多国家规定，对于进出口的食品该菌是必检的常规项目。常规的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法操作步骤复杂，并且费时，一般要3~7天，例如2008年颁布的新国标GB/T4789.8-2008是目前主流的检测手段，不能达到快速检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的要求。所以建立一种快速、有效的检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法是迫切需要的。技术实现要素：：基于现有小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法的不足，本发明旨在提供一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法及其运用，该小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法操作简单，灵敏度高，特异性高，特别适合基层食品安全的检测。为实现本发明的目的，解决现有技术中存在的技术问题，本发明采用了如下技术方案：一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法，包括如下步骤：步骤一，制备探针分子：根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的基因组结构和保守序列，选取小肠结肠炎耶尔森氏菌的毒力基因ail作为检测目标片段，根据GenBank:KT209996.1公开的小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因序列，设计探针分子，所述探针分子序列为5’-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA-3’，所述探针分子的5’端采用报告荧光基团进行标记，即探针分子结构为：报告荧光基团-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA；步骤二，将聚苯乙烯纳米球溶液与步骤一所制得的探针分子：报告荧光基团-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA混合，然后加入待测样品，检测荧光。其中，步骤一中所述的报告荧光基团优选为异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、四甲基罗丹明（TAMRA）、ROX、CY3、CY5、CY5.5、CALred、Red640和TexasRed等。其中，步骤二中所述的聚苯乙烯纳米球由以下方法制备得到：将0.05g过硫酸氨和0.05g十二烷基磺酸钠溶解到10mL水中，再加入12mL苯乙烯，将反应物加热一段时间，然后将产物离心，用甲醇冲洗移除SDS，即制得聚苯乙烯纳米球。在本发明结果判定过程中，分别设置阳性对照组和阴性对照组，根据样品检测荧光的强度判断样品中是否存在小肠结肠炎耶尔森氏菌。本发明还请求保护一种用于小肠结肠炎耶尔森氏菌检测的试剂盒，其包括：探针分子溶液、聚苯乙烯纳米球溶液、阳性对照质粒、阴性对照，其中所述探针分子的结构为：报告荧光基团-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA。本发明还请求保护所述的小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法或用于小肠结肠炎耶尔森氏菌检测的试剂盒在用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测，所述的食品为肉类食品，优选为畜禽肉和鱼肉，例如鸡肉、猪肉、牛肉、鱼肉等，特别是冻藏的肉类食品。基于以上技术方案，本发明所使用的小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法成本低廉，其是将靶核酸分子特异性结合探针分子吸附在聚苯乙烯纳米球表面，淬灭探针分子的荧光，然后，当探针分子与待测样品中的DNA分子混合，杂交形成双链时，探针分子从聚苯乙烯纳米球表面脱离，荧光淬灭效应消失，通过检测荧光信号实现对待测样品的检测，根据荧光的强度变化还可确定待测样品中靶核酸分子的含量。该方法实现起来十分简单，不需要使用昂贵的PCR仪器以及昂贵的ELISA检测试剂，仅需简单的荧光检测设备即可实现结果的检测和分析，检测时间短、灵敏度高，可以广泛用于食品安全检测，特别是基层食品卫生监督部门的食品安全检测。附图说明：图1：检测试验结果。采用实施例1的方法对阳性对照和阴性对照进行了试验，其中a为探针DNA（50nM）的荧光发射光谱，b为探针DNA（50nM）+阳性对照质粒（来自实施例3，200nM）的荧光发射光谱，c为探针DNA（50nM）+聚苯乙烯纳米球溶液+去离子水的荧光发射光谱，d为探针DNA（50nM）+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒（来自实施例3，200nM）的荧光发射光谱，e为聚苯乙烯纳米球溶液本身的荧光发射光谱。其中纵轴为荧光强度，横轴为检测波长。图2：灵敏度检测结果。其中a为探针DNA（50nM）+聚苯乙烯纳米球溶液+去离子水的荧光发射光谱，b为探针DNA（50nM）+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒（10倍稀释）的荧光发射光谱；c为探针DNA（50nM）+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒（100倍稀释）的荧光发射光谱；d为探针DNA（50nM）+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒（1000倍稀释）的荧光发射光谱，凝胶电泳的M、1-3泳道分别对应为macker，10倍稀释、100倍稀释和1000倍稀释。其中纵轴为荧光强度，横轴为检测波长。具体实施方式：实施例1：一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法，包括如下步骤：步骤一，制备探针分子：根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的基因组结构和保守序列，选取小肠结肠炎耶尔森氏菌的毒力基因ail作为检测目标片段，根据GenBank:KT209996.1公开的小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因序列，设计探针分子，所述探针分子序列为5’-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA-3’，所述探针分子的5’端采用报告荧光基团--羟基荧光素(FAM)进行标记，即探针分子结构为：FAM-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA；步骤二，将聚苯乙烯纳米球溶液与步骤一所制得的探针分子：FAM-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA混合，然后加入待测样品，检测荧光。实施例2：一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法，包括如下步骤：步骤一，制备探针分子：根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的基因组结构和保守序列，选取小肠结肠炎耶尔森氏菌的毒力基因ail作为检测目标片段，根据GenBank:KT209996.1公开的小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因序列，设计探针分子，所述探针分子序列为5’-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA-3’，所述探针分子的5’端采用报告荧光基团-异硫氰酸荧光素(FITC)进行标记，即探针分子结构为：FITC-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA；步骤二，将聚苯乙烯纳米球溶液与步骤一所制得的探针分子：FITC-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA混合，然后加入待测样品，检测荧光。实施例3：一种用于小肠结肠炎耶尔森氏菌检测的试剂盒，其包括：探针分子溶液、聚苯乙烯纳米球溶液、阳性对照质粒、阴性对照，其中所述探针分子的结构为：报告荧光基团-CATGGAAAGGTTAAGTCATCTGTA。其中阳性对照质粒是采用PCR扩增的方法，将序列为GenBank:KT209996.1的小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因序列克隆至pGEM-TEasy载体上，经验证所得到的阳性质粒；其中阴性对照组为水。实施例4：检测试验采用实施例1的方法对阳性对照和阴性对照进行了试验，以验证检测方法的准确性，其检测结果对于于说明书附图图1，其中a为探针DNA（50nM）的荧光发射光谱，b为探针DNA（50nM）+阳性对照质粒（来自实施例3，200nM）的荧光发射光谱，c为探针DNA（50nM）+聚苯乙烯纳米球溶液+去离子水的荧光发射光谱，d为探针DNA（50nM）+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照质粒（来自实施例3，200nM）的荧光发射光谱，e为聚苯乙烯纳米球溶液本身的荧光发射光谱。以上检测结果表明，在没有检测模板存在的情况下，探针分子和聚苯乙烯纳米球相互结合，发生荧光淬灭效应，其在520nm下检测到的荧光强度（c）不足探针分子溶液（a）或者探针DNA（50nM）+阳性对照质粒（b）荧光强度的一半，而当添加模板后（d），其相应的荧光值即恢复到接近探针分子溶液的荧光值，以上结果表明本发明的方法检测结果准确，能够有效地通过荧光情况判断待检测样品中是否存在小肠结肠炎耶尔森氏菌。实施例5：灵敏度检测：取阳性对照质粒（200nM），分别稀释10倍、100倍、1000倍，采用实施例1的方法进行检测，检测结果见图2；同时对相同稀释倍数的阳性对照质粒采用传统的PCR检测方法进行检测（PCR扩增AIL基因上一段长为236bp的核酸片段，其上游引物序列为5’-ACCGTTATGAACTCGATGATA-3’,下游引物为5’-CTTACTTGCACTGATTGATTC-3’，Tm=58℃）。由图2的检测将可见，在第三个稀释度，本发明的方法能够检测出来，而PCR方法不能有效地检测，说明本发明构建方法的灵敏度比传统PCR检测方法高出10倍。实施例6：样品检测取冷藏的鸡肉样品40份，每个样品分为均分为三等份，每份5g，其中第一等分中加入5g去离子水后匀浆，置于100℃水浴中水浴15min，而后8000rpm离心10min，取上清液作为检测样品；其中第二份按照常规方式增加培养后，按照GB/T4789.8-2008的方法进行检验；其中第三份按照常规方式进行增菌培养后，按照现有技术（孙飞龙等，小肠结肠炎耶尔森氏菌PCR反应体系的快速优化，《纺织高校基础科学学报》，第18卷第1期）的方法进行检测，具体检测结果见下表1：表1检测结果表序号实施例1GB/T4789现有PCR序号实施例1GB/T4789现有PCR1++—26+++2+—+27———3+++28++—4++—29+—+5———30++—6+++31+—+7++—32+++8+—+33+++9+++34———10———35+++11———36———12+++37———13+—+38+++14+——39———15+—+40+++16+++41———17———42+++18+++43———19+++44+++20+——45+++21+++46+++22+++47———23———48———24+++49+++25———50———由以上表1的结果可知，实施例1的方法检出：阳性34件，阴性16件；GB/T4789的方法检出：阳性26件，阴性24件；现有PCR方法检出：阳性27例，阴性23例，其中仅有两例经GB/T4789和PCR同时检测为阴性、而实施例1的方法检测为阳性，事后，经更换取样部位（改为取表面的样品）后，以上两件样品经GB/T4789和PCR检测也同为阳性。即，由以上结果可知，本发明实施例1的方法的检出率明显高于GB/T4789的检测方法和现有的PCR检测方法，其检测结果与GB/T4789或现有PCR的检测结果之一保持一致，并不存在误检的状况。当前第1页1 2 3