OsSGT1蛋白及其编码基因在调控植物耐盐抗性中的应用的制作方法

本发明涉及一种OsSGT1蛋白及其编码基因在调控植物耐盐抗性中的应用。
背景技术：
：非生物胁迫如盐碱、干旱和低温严重地影响作物的高产和稳产，是威胁世界粮食安全的主要因素土壤盐渍化是限制农作物生长、造成粮食减产的主要非生物胁迫因子之一。近年来，土壤次生盐渍化面积在逐年增加，盐胁迫已成为世界范围内影响生物农业生产最重要的环境胁迫因子之一。盐胁迫主要表现为渗透胁迫，影响植株对Na+和K+的吸收和排斥，以及细胞正常离子的分布和动态平衡。水稻是禾本科模式植物，也是一种对盐中度敏感的作物，盐胁迫已成为中国盐碱稻区水稻稳定生产的主要制约因素。盐胁迫耐性相关基因包括参与信号传导和转录调控基因、渗透调节物质代谢相关的基因和转运蛋白基因等。水稻盐胁迫应答的分子机制研究取得了一些实质性进展，主要表现在多个与盐胁迫耐受相关的基因和调控因子被成功鉴定，部分基因的生物学功能也阐述得比较清楚。目前虽已鉴定了一些盐胁迫相关的分子标记和基因(或QTL)位点，由于盐胁迫耐性是一个数量性状，受多个基因调控。因此还需要加大水稻耐盐种质资源的发掘和利用，加强水稻耐盐分子标记的定位研究，克隆耐盐基因，并研究其作用机制。挖掘植物耐盐基因，了解盐胁迫的发生机理，寻找植物响应盐胁迫的信号途径节点，提高水稻的抗病性和耐盐性，培育耐盐性强的水稻品种，具有重要的理论意义和生产应用价值。技术实现要素：本发明的目的是提供一种OsSGT1蛋白及其编码基因在调控植物耐盐抗性中的应用。本发明提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码OsSGT1蛋白的基因导入出发植物，得到耐盐性降低的转基因植物。所述OsSGT1蛋白，获自水稻，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列2衍生的蛋白质。为了使(a1)中的OsSGT1蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a2)中的OsSGT1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的OsSGT1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。所述“编码OsSGT1蛋白的基因(简称OsSGT1基因)”为如下(b1)或(b2)或(b3)：(b1)编码区如序列表的序列1自5’末端第1-1104位核苷酸所示的DNA分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐盐性相关的蛋白质的DNA分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物耐盐性相关的蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。所述方法中，所述OsSGT1基因可以通过重组表达载体导入出发植物。所述重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用所述基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组表达载体具体可为将载体pGWB18中插入了序列表的序列1所示的双链DNA分子得到的重组质粒。以上任一所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如日本晴水稻。所述耐盐性降低具体体现为如下(d1)-(d3)中的至少一种：(d1)高盐条件下，存活率低于出发植物；(d2)高盐条件下，过氧化物酶活性低于出发植物；(d3)高盐条件下，丙二醛含量高于出发植物。所述高盐条件具体可为100mMNaCl处理。本发明还保护OsSGT1蛋白的应用，为如下(c1)或(c2)：(c1)调控植物耐盐性；(c2)降低植物耐盐性。本发明还保护以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述育种的目的是选育耐盐性低的植物。本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中OsSGT1蛋白的表达量和/或活性，得到耐盐性降低的水稻。本发明还保护一种降低植物耐盐性的方法，包括如下步骤：增加植物中OsSGT1蛋白的表达量和/或活性，从而降低植物耐盐性。以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如日本晴水稻。本发明通过研究发现OsSGT1蛋白及其编码基因具有调控植物耐盐性的功能。上调植物中OsSGT1基因的表达可以显著降低植物的耐盐性。本发明对于挖掘植物耐盐基因，了解盐胁迫的发生机理，提高植物耐盐性，培育耐盐性强的植物品种，具有重要的理论指导意义和生产应用价值。附图说明图1为部分转基因植株的PCR鉴定结果。图2为转基因植株的Westernblot结果。图3为野生型植株和转基因植株耐盐表型观察结果。图4为野生型植株和转基因植株存活率统计结果。图5为野生型植株和转基因植株MDA(丙二醛)含量统计结果。图6为野生型植株和转基因植株POD(过氧化物酶)活性统计结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。OsSGT1基因的编码区序列如序列表的序列1所示，编码序列表的序列2所示的蛋白质(OsSGT1蛋白)。水稻品系日本晴：参考文献：李磊，薛芗，左示敏，等.水稻品种日本晴最适叶片卷曲度研究[J].扬州大学学报农业与生命科学版，2013(2)：47-51.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。载体pDONR201：Invitrogen公司，货号：11798-014。载体pGWB18：BioVectorNTCC典型培养物保藏中心。诱导培养基：CaCl2·2H2O440mg，KH2PO4170mg，MgSO4·7H2O370mg，NH4NO31650mg，KNO31900mg，KI0.83mg，CoCl2·6H2O0.025mg，H3BO36.2mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，MnSO4·4H2O22.3mg，CuSO4·5H2O0.025mg，ZnSO4·7H2O8.6mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，FeSO4·7H2O27.8mg，VB10.1mg，VB60.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-D2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，去离子水加至1L。侵染培养基：配制方法参见参考文献：HieiY，OhtaS，KomariT，etal.Efficienttransformationofrice(Oryzasativa，L.)mediatedbyAgrobacterium，andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA[J].PlantJournal，1994，6(2)：271-282.。将参考文献中乙酰丁香酮的浓度替换为200μM。共培养培养基：在诱导培养基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培养基中的终浓度为200μM，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。抑菌培养基：在诱导培养基中头孢霉素，使头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。筛选培养基：在诱导培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素在培养基中的终浓度为65mg/L，头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。预再生培养基：CaCl2·2H2O440mg，KH2PO4170mg，MgSO4·7H2O370mg，NH4NO31650mg，KNO31900mg，KI0.83mg，CoCl2·6H2O0.025mg，H3BO36.2mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，MnSO4·4H2O22.3mg，CuSO4·5H2O0.025mg，ZnSO4·7H2O8.6mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，FeSO4·7H2O27.8mg，VB10.1mg，VB60.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。再生培养基：CaCl2·2H2O440mg，KH2PO4170mg，MgSO4·7H2O370mg，NH4NO31650mg，KNO31900mg，KI0.83mg，CoCl2·6H2O0.025mg，H3BO36.2mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，MnSO4·4H2O22.3mg，CuSO4·5H2O0.025mg，ZnSO4·7H2O8.6mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，FeSO4·7H2O27.8mg，VB10.1mg，VB60.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂6g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。POD反应液：在50ml0.1M磷酸缓冲液(pH6.0)中加入愈创木酚28μL，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30％(体积百分比)H2O2水溶液19μL混合。MDA反应液：0.6gTBA(硫代巴比妥酸)，先用少量1MNaOH水溶液溶解，然后用10％(体积百分比)TCA(三氯乙酸)水溶液定容至100毫升。实施例1、OsSGT1蛋白及其编码基因的功能分析一、OsSGT1基因过表达载体的构建1、提取日本晴水稻叶片的总RNA，反转录为cDNA。2、以步骤1得到cDNA为模板，采用引物attB-F1和引物attB-R1进行PCR扩增，得到扩增产物。attB-F1：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGCAACCGCCGCC-3′；attB-R1：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAGTACTCCCATTTCTTAAGCTCC-3′。3、通过BP反应，将步骤2得到的扩增产物导入载体pDONR201，得到含有序列表序列1所示的双链DNA分子的阳性入门克隆质粒pDONR201-OsSGT1。BP反应体系：扩增产物2.7μL(50-100ng)，载体pDONR2011.0μL(30-50ng)，5×BPReactionBuffer1.0μL，BPEnzymemix0.3μL。BP反应条件：25℃温浴1h。4、取步骤3得到的阳性入门克隆质粒pDONR201-OsSGT1，与载体pGWB18进行LR反应，得到含有序列表序列1所示的双链DNA分子的35S：：MYC-OsSGT1表达载体(已经测序验证)。LR反应体系：入门克隆质粒pDONR201-OsSGT11μL(50-100ng)，载体pGWB181μL(50-100ng)，LRenzymemix0.5μL。LR反应条件：25℃温浴1h。二、过表达转基因水稻的获得1、取日本晴水稻的成熟种子，机械脱壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子进行消毒。2、将步骤1消毒后的种子接种到诱导培养基28℃、暗培养14天左右，选取外观良好，生长力好的愈伤组织。3、取步骤一构建的表达载体35S：：MYC-OsSGT1，导入根癌农杆菌EHA105，得到重组菌EHA105/35S：：MYC-OsSGT1。4、取步骤3得到的重组菌EHA105/35S：：MYC-OsSGT1，用侵染培养基重悬菌体，得到菌悬液(OD600nm＝1.0)。5、将完成步骤2的愈伤组织浸泡于步骤4制备的菌悬液中，侵染20min。侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于共培养培养基上，培养28℃暗培养50-55h。6、完成步骤5后，挑选表面没有明显农杆菌的愈伤组织移至抑菌培养基中，28℃暗培养3-4天。7、完成步骤6后，将愈伤组织移至筛选培养基上28℃暗培养培养30天，每10天继代一次。8、完成步骤7后，取新鲜潮霉素抗性的愈伤组织，接于预再生培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养7天后转入再生培养基上，继续光照培养，直至生长出再生植株，得到T0代植株。T0代植株自交，得到T1代植株。T1代植株自交，得到T2代植株。T2代植株自交，得到T3代植株。三、过表达转基因水稻的鉴定1、取步骤二获得的各个株系的T2代植株，提取植株叶片的总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，采用引物Hyg-F和Hyg-R进行PCR鉴定。采用过表达载体35S：：MYC-OsSGT1作为阳性对照，采用日本晴水稻的cDNA作为阴性对照。Hyg-F：5’-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’；Hyg-R：5’-CCTGACCTATTGCATCTCCC-3’。如果对于某一T0代植株，其抽样检测的T2代植株的PCR鉴定结果均为阳性，该T0代植株及其自交后代为一个纯合的过转基因株系。部分植株的PCR鉴定结果如图1所示。图1中，M为DNAMaker，+为阳性对照，-为阴性对照，泳道1-17依次对应17个不同株系的T2代植株。结果表明，17个株系的植株均能扩增出与质粒载体潮霉素基因一致的特异条带，17个株系均为纯合的过转基因株系。2、选取步骤1鉴定正确的6个转基因株系(命名为SA11、SA22、SA24、SA28、SA35和SA36)，采用westernblot分析各株系T2代植株中OsSGT1蛋白表达量(MYC抗体)，鉴定转基因株系的过表达效率。检测结果如图2所示。结果表明：6个转基因株系中均检测到目的条带，在总蛋白上样量一致的前提下，转基因株系SA22、SA24和SA28中OsSGT1的蛋白积累量显著高于转基因株系SA11、SA35和SA36中OsSGT1的蛋白量。四、转空载体株系的获得采用载体pGWB18替代表达载体35S：：MYC-OsSGT1按照步骤二的1-8进行操作，得到转空载体株系。五、过表达转基因株系的耐盐性鉴定待测植株为：日本晴水稻(野生型)、过表达转基因株系SA24的T3代植株、过表达转基因株系SA28的T3代植株、转空载体株系的T3代植株。1、将待测植株的种子放于50℃烘箱中烘3天，用0.5％(体积百分比)次氯酸钠水溶液浸泡30分钟对种子进行表面消毒，然后在37℃培养箱中浸种、催芽至露白，期间约12h换一次水。2、选步骤1发芽一致的种子进行播种，用蒸馏水(pH＝5.5)培养一周，之后用Yoshida营养液(配制方法见参考文献：YoshidaS，FornoDA，CockJH.Laboratorymanualforphysiologicalstudiesofrice.Laboratorymanualforphysiologicalstudiesofrice.InternationalRiceResearchInstitute，1976.)28℃继续培养至三叶期，然后将植株转移至含有100mMNaCl的Yoshida营养液28℃继续培养(盐处理)，分别在盐处理的第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天和第10天统计其存活率。结果如图3和图4所示。图3为第10天的表型观察结果。图3中，左上和右上为野生型(CK)的表型观察结果，左下为转基因植株SA28的表型观察结果，右下为转基因植株SA24的表型观察结果。图4为存活率统计结果。结果表明，100mMNaCl处理第4天开始，野生型植株(CK)的存活率高于转基因植株SA24和SA28，第10天，野生型植株的存活率分别为60％和80％，而转基因植株SA24的存活率为13.3％，SA28的存活率为38％，即转基因植株对盐胁迫的敏感性显著高于野生型。转空载体植株的存活率与野生型无显著性差异。3、取步骤2使用100mMNaCl处理第7天叶龄叶位长势均相似的植物叶片，称取0.5g，剪碎置于预冷的研钵中，加入3ml预冷的PBS(21.25ml0.2M的NaH2PO4水溶液与228.25ml0.2M的Na2HPO4水溶液混匀，蒸馏水定容至1000ml，pH＝7.8)充分研磨，将研磨液倒入离心管中，再用2ml预冷的PBS洗涤研钵，并倒入离心管中，4℃，6,000rpm离心30min，吸取5ml上清液(即酶提取液)，进行POD(过氧化物酶)活性和MDA(丙二醛)含量的测定。(1)POD(过氧化物酶)活性测定：将20μL酶提取液和3mlPOD反应液加至比色皿中，快速混匀并立即测定在470nm下的吸光值，每隔1分钟读数1次，共读3次，以每分钟吸光度变化值(ΔA470/min·g·F·W)表示酶活力的大小。设置采用20μLPBS代替酶提取液的空白对照，调零。POD活性(ΔA470/min·g·F·W)＝ΔA470×V×Va×W＝ΔA470×5×0.02×0.5＝ΔA470×500ΔA470：A470在0-3min的差值；V：提取液总体积(mL)；Va：测定酶提取液体积(mL)；W：叶片干重(g)；(2)MDA测定：将1ml酶提取液和2mlMDA反应液加入到离心管中，封口沸水浴15min，迅速冷却后，12,000rpm离心10min，吸取上清液并在600、532、450nm三个波长下测定其吸光值。MDA(μmol·g-1·F-1W-1)＝〔6.45×(D532-D600)-0.56×D450〕×V/Va/WV：提取液总体积(mL)；Va：测定酶提取液体积(mL)；W：叶片干重(g)；结果如图5和图6所示。图5为MDA含量统计结果，图6为POD活性统计结果。结果表明，盐胁迫条件下，转基因植株叶片内MDA的含量显著高于野生型(CK)，细胞膜受情况比野生型严重，而POD酶活性显著低于野生型，表明转基因植株叶片内不能有效的清除体内的氧自由基，减小盐胁迫产生的氧自由基对细胞膜造成的过氧化伤害。转空载体植株的统计结果与野生型无显著性差异。<110>中国农业科学院作物科学研究所中国农业科学院深圳生物育种创新研究院<120>OsSGT1蛋白及其编码基因在调控植物耐盐抗性中的应用<160>2<210>1<211>1104<212>DNA<213>水稻（Oryzasativa）<400>1atggcaaccgccgccgcgtcggatctggagagcaaggccaaggcggccttcgtcgacgac60gacttcgagctcgccgccgagctctacacgcaggcaatcgaggccagccccgccaccgcc120gagctctacgccgaccgcgcccaggcccatatcaagctaggcaactacactgaggctgta180gctgatgctaacaaggccattgaacttgacccatcaatgcacaaggcttatcttcgtaaa240ggcgctgcatgtatacgactggaggagtatcaaactgcaaaagcagctcttgaattgggt300tactcgttcgcatctggtgactcaaggtttactcgcctaatgaaggagtgtgatgagcgc360attgctgaggagcttagtgaagtccctgttaagaaggctgaagatggagcagctgccccc420tctgttgcttcttttgttgaggaaaaggatgatgctgcaaacatggataatacaccacca480atggtagaagtgaagccaaaatacaggcacgacttctacaacagtgctacagaagttgta540ttgacaatttttgcaaagggtgttcctgctgagaatgttgttgttgattttggtgaacaa600atgttaagtgtgtcgattgaagtccctggagaggagccgtaccattttcagcctcgtctg660ttttctaagatcatccctgagaaaagcagataccaagtgctatccacgaaggttgaaata720agactggctaaagctgaacagattacatggacctcacttgattatgataaaaaaccaaag780gctgttccacaaaagataatccctccagctgaatcggcccagaggccatcatatccttcc840tcaaaatccaagaaagactgggataaactggaagctgaagttaaaaaggaggagaaggag900gagaagcttgaaggcgatgctgcattgaacaaatttttccgtgacatctacagtgatgct960gatgaagacatgcgacgagcaatgatgaaatcttttgttgaatctaacggtactgttctg1020tcgaccaattggaaagatgttggctcgaagaaggtagagggaagcccacctgatgggatg1080gagcttaagaaatgggagtactaa1104<210>2<211>367<212>PRT<213>水稻（Oryzasativa）<400>2MetAlaThrAlaAlaAlaSerAspLeuGluSerLysAlaLysAlaAla151015PheValAspAspAspPheGluLeuAlaAlaGluLeuTyrThrGlnAla202530IleGluAlaSerProAlaThrAlaGluLeuTyrAlaAspArgAlaGln354045AlaHisIleLysLeuGlyAsnTyrThrGluAlaValAlaAspAlaAsn505560LysAlaIleGluLeuAspProSerMetHisLysAlaTyrLeuArgLys65707580GlyAlaAlaCysIleArgLeuGluGluTyrGlnThrAlaLysAlaAla859095LeuGluLeuGlyTyrSerPheAlaSerGlyAspSerArgPheThrArg100105110LeuMetLysGluCysAspGluArgIleAlaGluGluLeuSerGluVal115120125ProValLysLysAlaGluAspGlyAlaAlaAlaProSerValAlaSer130135140PheValGluGluLysAspAspAlaAlaAsnMetAspAsnThrProPro145150155160MetValGluValLysProLysTyrArgHisAspPheTyrAsnSerAla165170175ThrGluValValLeuThrIlePheAlaLysGlyValProAlaGluAsn180185190ValValValAspPheGlyGluGlnMetLeuSerValSerIleGluVal195200205ProGlyGluGluProTyrHisPheGlnProArgLeuPheSerLysIle210215220IleProGluLysSerArgTyrGlnValLeuSerThrLysValGluIle225230235240ArgLeuAlaLysAlaGluGlnIleThrTrpThrSerLeuAspTyrAsp245250255LysLysProLysAlaValProGlnLysIleIleProProAlaGluSer260265270AlaGlnArgProSerTyrProSerSerLysSerLysLysAspTrpAsp275280285LysLeuGluAlaGluValLysLysGluGluLysGluGluLysLeuGlu290295300GlyAspAlaAlaLeuAsnLysPhePheArgAspIleTyrSerAspAla305310315320AspGluAspMetArgArgAlaMetMetLysSerPheValGluSerAsn325330335GlyThrValLeuSerThrAsnTrpLysAspValGlySerLysLysVal340345350GluGlySerProProAspGlyMetGluLeuLysLysTrpGluTyr355360365当前第1页1 2 3