可雾化吸入的抗流感病毒感染的siRNA及其应用的制作方法

本发明涉及医药生物
技术领域：
中可雾化吸入的抗流感病毒感染的sirna及其应用。
背景技术：
：流感病毒是引起人类急性呼吸道传染病最主要的病原，主要通过空气飞沫传播，具有传播速度快、发病率高和常常引发严重并发症等特点。流感每年在温带的秋冬季节大量流行，造成相当高的发病率和死亡率，严重威胁人类健康。据估计，全世界每年会有大约25万-50万人丧生于季节性流感。由于流感病毒可以在不同宿主之间直接或间接传播，容易发生基因重组产生新的亚型，可能会带来灾难性的后果，如人类历史上的几次流感大爆发，导致全球数百万人丧生。而2013年在我国出现的h7n9禽流感病毒更是以相当高的死亡率再次引起了对流感病毒高度的恐慌和关注。流感病毒属于正粘病毒科，分为甲、乙、丙三型。其中，甲型流感病毒危害最大，至今为止的流感大流行都是由甲型流感病毒引发。甲型流感病毒基因组由8条单股负链rna组成，可以在宿主体内转录形成互补的正链mrna，分别编码病毒的各种结构蛋白和非结构蛋白。目前流感的防治主要依靠药物以及疫苗。常见的药物有m2离子通道阻断剂(金刚烷胺和金刚乙胺)和na抑制剂(扎那米韦和奥司他韦)，以及一些其他的新型药物；流感疫苗主要有三种类型：灭活疫苗，减毒活疫苗和dna疫苗。但是由于药物频发的耐药性以及疫苗作用的局限性，使得药物和疫苗的研发成了一个永无止境的过程。因此，探寻一种新型，有效的流感防治方法迫在眉睫。rna干扰技术，作为一种新型的生物技术，已广泛应用于探索基因功能以及传染性疾病和恶性肿瘤的治疗，同时在抗病毒研究领域也体现出独特的优势。rna干扰作用通过一类较稳定的作用分子实现，主要包括小干扰rna(sirnas)，核糖核酸酶dicer，rna诱导沉默复合体(risc)。sirna是大小约为21-25nt的双链rna分子。rnaseⅲ型核酸酶dicer具有解旋酶活性，含有dsrna结合区，可以在细胞中将dsrna裂解为sirnas。risc含dcr-2蛋白，r2d2蛋白以及argonaute蛋白。研究表明argonaute家族蛋白具有rna内切酶活性，rnai机制正是由argonaute家族蛋白的rna内切酶活性主导。与药物和疫苗作用于蛋白不同，rnai通过向细胞中导入与病毒mrna编码区同源的短双链sirna使该mrna发生降解，从而沉默该病毒基因的表达。目前rnai技术在抗流感中的应用主要包括两个方面：一方面是寻求有效的针对病毒蛋白基因的sirna从而阻断流感病毒的转录和复制；另一方面则是通过rnai技术沉默宿主靶蛋白的表达从而筛选出与流感病毒转录复制相关的宿主因子。2003年ge等发现，用靶向np(1496-1514)或者pa(2087-2106)的特异性sirna处理mdck细胞后感染流感病毒，发现这两条sirnas均能阻断病毒的复制。tomkins等人进一步的动物实验结果表明这些sirnas不仅能够在小鼠体内减弱流感病毒的致病性，并且对其他的高致病性流感毒株同样具有效果。采用sirna治疗较常规的药物研发有明显的优势。例如，sirna的设计仅依据病毒基因序列，在季节性流感爆发时，可以根据流行株的基因序列，短时间内即可合成大量的sirna。同时，可以针对同一毒株的不同靶点合成多条sirna实现多靶点治疗。除了ge等最初设计的两条sirna之外，针对流感病毒蛋白的sirna还有pb1(1632-1652)，pa(ps-pa496)，m2(psm-950)和m(331-351)，但是随着流感病毒的不断变异以及高致病性禽流感的出现，已知的sirna已经无法满足人们对抗流感病毒的需求。因此，需要设计新型的抗流感病毒sirna，以期能够应对日益严峻的流感形势。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何抑制a型流感病毒和b型流感病毒。为解决上述技术问题，本发明首先提供了sirna、其修饰物、或其药学上可接受的盐，该sirna是名称为sipb2-1、sipb2-2、sipb1-2或sins-1的双链rna分子；所述sipb2-1的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为序列表中seqidno.1，所述sipb2-1的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为序列表中seqidno.2；所述sipb2-2的一条链序列从5’端至3’端为序列表中seqidno.3，另一条链序列从3’端至5’端为序列表中seqidno.4；所述sipb1-2的一条链序列从5’端至3’端为序列表中seqidno.5，另一条链序列从3’端至5’端为序列表中seqidno.6；所述sins-1的一条链序列从5’端至3’端为序列表中seqidno.7，另一条链序列从3’端至5’端为序列表中seqidno.8。其中，seqidno.1由19个核糖核苷酸组成，seqidno.2由19个核糖核苷酸组成，seqidno.1的第1-19位核糖核苷酸与seqidno.2的第1-19位核糖核苷酸反向互补，将二者形成的双链rna命名为sipb2-1。seqidno.3由19个核糖核苷酸组成，seqidno.4由19个核糖核苷酸组成，seqidno.3的第1-19位核糖核苷酸与seqidno.4的第1-19位核糖核苷酸反向互补，将二者形成的双链rna命名为sipb2-2。seqidno.5由19个核糖核苷酸组成，seqidno.6由19个核糖核苷酸组成，seqidno.5的第1-19位核糖核苷酸与seqidno.6的第1-19位核糖核苷酸反向互补，将二者形成的双链rna命名为sipb1-2。seqidno.7由19个核糖核苷酸组成，seqidno.8由19个核糖核苷酸组成，seqidno.7的第1-19位核糖核苷酸与seqidno.8的第1-19位核糖核苷酸反向互补，将二者形成的双链rna命名为sins-1。术语“修饰物”是指对所述双链rna分子进行修饰得到的产物，各种修饰方法均可选用，包括选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合等。术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，s.m.berge,etal.,j.pharmaceuticalsciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。下述b1)-b12)所示的与所述双链rna分子相关的生物材料也属于本发明的保护范围：b1)编码所述双链rna分子的dna分子；b2)含有b1)所述dna分子的表达盒；b3)含有b1)所述dna分子的重组载体；b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；b5)含有b1)所述dna分子的重组微生物；b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；b9)含有b1)所述dna分子的转基因动物细胞系；b10)含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系；b11)含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系；b12)含有b4)所述重组载体的转基因动物细胞系；b13)含有b1)所述dna分子的转基因植物细胞系。为解决上述技术问题，本发明还提供了流感病毒抑制剂和预防或/和治疗流行性感冒的药物。本发明所提供的流感病毒抑制剂，含有所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐。本发明所提供的预防或/和治疗流行性感冒的药物，含有所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐。上述流感病毒抑制剂或药物的剂型可为气雾剂、片剂、胶囊、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂或冻干粉针剂。上文中，所述流感病毒抑制剂和所述预防或/和治疗流行性感冒的药物的活性成分可为所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐，所述流感病毒抑制剂和所述预防或/和治疗流行性感冒的药物的活性成分还可含有其他物质，其他物质本领域技术人员可根据所述流感病毒抑制剂和所述预防或/和治疗流行性感冒的药物的效果确定。上文中，所述流感病毒抑制剂和所述预防或/和治疗流行性感冒的药物，除含有所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。下述p1至p4中的任一应用也属于本发明的保护范围：p1、所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐，或所述的生物材料在制备流感病毒抑制剂中的应用；p2、所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐，或所述的生物材料在制备治疗或/和预防流行性感冒产品中的应用；p3、所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐，或所述的生物材料在抑制流感病毒中的应用；p4、所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐，或所述的生物材料在治疗或/和预防流行性感冒中的应用。本发明还提供了抑制流感病毒感染动物的方法。本发明所提供的抑制流感病毒感染动物的方法，包括给受体动物施用所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐以抑制流感病毒感染动物。本发明还提供了治疗或/和预防流行性感冒的方法。本发明所提供的治疗或/和预防流行性感冒的方法，包括给受体动物施用所述的双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐进行治疗或/和预防流行性感冒。上述方法中，所述施用可为雾化吸入给药。上文中，所述流感病毒可为a型流感病毒和/或b型流感病毒，所述流行性感冒可由a型流感病毒和/或b型流感病毒引起。本发明中，所述动物可为哺乳动物，如人；所述动物还可为除哺乳动物以外的a、b和c型流感病毒感染的其他动物，如禽。本发明的双链rna分子sipb2-1、sipb2-2、sipb1-2或sins-1具有以下优点：(1)成本低：其ec50和小鼠体内实验的用量小于文献报道，作为抗流感病毒药物将大大降低使用成本。(2)适用范围广：不仅针对a型流感病毒，对于b型流感病毒同样具有抑制作用。其靶向的流感病毒rna聚合酶基因(pb2-1，pb2-2，pb1-2)保守度较高，在流感大爆发的时候，可以作为一种合理，有效的预防和治疗药物。(3)可靠性高：该sirna未采用任何修饰，避免了sirna在给药过程中出现的不兼容问题。在动物体内实验中，本发明设计了一套雾化给药系统，将包裹脂质体的sirna以雾化颗粒的形式吸入式给药。这样一方面避免了传统滴鼻给药的复杂过程以及麻醉过程对小鼠呼吸系统的抑制；另一方面也为推动sirna作为一种有效的，便捷的常规治疗方式做出有益的尝试。附图说明图1为a549-5ps细胞系的特征。a549和a549-5ps细胞在6孔板中培养48h。(a)上清中gluc活性检测；(b)a549和a549-5ps的形态学特征；(c)细胞内pb2、pb1、pa和npmrna以及模拟vrna的检测，plasmid为a549-5ps细胞中所含的质粒。图2为sinc的验证。a549-5ps二次转染sirna后60h换液，继续培养24h后收集上清检测gluc活性。blank为未转染sirna的a549-5ps。图3为sirna活性的初步验证。nctrl表示sinc，pb2-1表示sipb2-1，pb2-2表示sipb2-2，pb1-1表示sipb1-1，pb1-2表示sipb1-2，pa-1表示sipa-1，pa-2表示sipa-2，m-1表示sim-1，m-2表示sim-2，ns-1表示sins-1，ns-2表示sins-2。图4为sirna活性的再次验证。nctrl表示sinc，pb2-1表示sipb2-1，pb2-2表示sipb2-2，pb1-1表示sipb1-1，pb1-2表示sipb1-2，pa-1表示sipa-1，pa-2表示sipa-2，m-1表示sim-1，m-2表示sim-2，ns-1表示sins-1，ns-2表示sins-2。图5为sirna在病毒蛋白水平和mrna水平抑制流感病毒复制的作用。a：免疫印迹检测np蛋白的表达；b:qrt-pcr检测np蛋白的mrna水平。mock为未转染sirna只转染lipofectaminernaimax的293t细胞，iav为1.2.2的流感病毒。nctrl表示将sinc转入293t细胞得到的细胞，pb2-1表示将sipb2-1转入293t细胞得到的细胞，pb2-2表示将sipb2-2转入293t细胞得到的细胞，pb1-2表示将sipb1-2转入293t细胞得到的细胞，ns-1表示将sins-1转入293t细胞得到的细胞。图6为不同浓度梯度的sirna的抑制效率。图7为sirna对不同流感病毒毒株的抑制作用。a为a/pr/8/34(h1n1),b为b/beijing-haidian/1386/2013。图8为雾化给药原理示意图。图9为sirna体内抗流感活性。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、sirna及其抗流感病毒活性1材料与方法1.1材料1.1.1sirna通过比对甲型流感病毒毒株a/wsn/33的基因序列，从头逐个提取符合sirna设计要求的片段，接着blast确定片段的同源性，从中选取了10条sirna进行下一步的实验。各条sirna的一条链序列如表1，另一条链的序列与表1中的列出的相应序列完全反向互补。其中，sipb2-1的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为序列表中seqidno.1，sipb2-1的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为序列表中seqidno.2；sipb2-2的一条链序列从5’端至3’端为序列表中seqidno.3，另一条链序列从3’端至5’端为序列表中seqidno.4；sipb1-2的一条链序列从5’端至3’端为序列表中seqidno.5，另一条链序列从3’端至5’端为序列表中seqidno.6；sins-1的一条链序列从5’端至3’端为序列表中seqidno.7，另一条链序列从3’端至5’端为序列表中seqidno.8。表1.sirna的名称及序列名称序列靶向的病毒基因sipb2-15’-caagcaguguguacauuga-3’pb2基因sipb2-25’-ggagacgugguguugguaa-3’pb2基因sipb1-15’-cauggaguaugaugcuguu-3’pb1基因sipb1-25’-caaugaucuugguccagca-3’pb1基因sipa-15’-guuggauucagaaugaguu-3’pa基因sipa-25’-cacauugcaagcaugagaa-3’pa基因sim-15’-gacaagaccaauccuguca-3’m基因sim-25’-cuguauaggaagcuuaaga-3’m基因sins-15’-ggaagaaucugaugaggca-3’ns基因sins-25’-gaugguugauugaagaagu-3’ns基因本发明选择随机双链rna作为阴性对照sirna，该随机双链rna的名称为sinc，sinc的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为(5’-uucuccgaacgugucacgu-3’)，nc的一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为(3’-aagaggcuugcacagugca-5’)。sirna序列由广州锐博生物科技有限公司合成。1.1.2质粒甲型流感病毒(iav)8质粒反向遗传系统phw181-pb2、phw182-pb1、phw183-pa、phw184-ha、phw185-np、phw186-na、phw187-m、phw188-ns获赠于dr.robertg.webster(hoffmann,e.,g.neumann,etal.adnatransfectionsystemforgenerationofinfluenzaavirusfromeightplasmids[j].procnatlacadsciusa,2000,97:6108-6113)。1.1.3主要试剂gaussia荧光素酶(gaussialuciferase,gluc)底物腔肠素h(coelenterazine-h)购自美国promega公司；tpck处理的胰蛋白酶(tpck-treatedtrypsin)、抗生素氨苄青霉素(ampicillin，amp)、tween-20、temed购自美国sigma-aldrich公司；抗生素杀稻瘟菌素(blasticidin，bsd)、蛋白分子量markerpagerulertmplusprestainedproteinladder购自美国lifetechnologies公司；flu-np鼠单克隆抗体(货号：sc-101352)、β-actin鼠单克隆抗体(货号：sc-47778)购自美国santacruz公司；辣根过氧化物酶(hrp)标记山羊抗小鼠igg二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ripa裂解液购自碧云天生物技术有限公司。dna片段回收和纯化试剂盒、质粒小提试剂盒、pcr产物纯化试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司；质粒大提试剂盒hi-speedplasmidmaxikit购自qiagen公司。1.1.4仪器酶标仪centroxs3lb960购自德国berthold公司；victorx5多功能酶标仪购自美国perkinelmer公司；凝胶成像仪molecularimagergeldoctmxr、pcr仪mjminitmgradientthermalcycler购自美国bio-rad公司；nanodrop2000分光光度计购自美国thermoscientific公司；小鼠雾化给药装置购自上海晟廷生物科技有限公司。1.2方法1.2.1细胞培养犬肾上皮细胞(madin–darbycaninekidney,mdck)，获赠于北京协和医学院医学生物学研究所。人胚肾上皮细胞293t，293t衍生细胞系293t-gluc克隆(gaoq,wangz,liuz,etal.acell-basedhigh-throughputapproachtoidentifyinhibitorsofinfluenzaavirus[j].actapharmaceuticasinicab,2014,4(4):301-306)，a549衍生细胞系a549-5ps克隆(zhenwang.etal.，establishmentofahigh-throughputassaytomonitorinfluenzaavirusrnatranscriptionandreplication，plosone|doi:10.1371/journal.pone.0133558july21,2015)均培养于含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基中。其中293t-gluc和a549-5ps的培养基中加入杀稻瘟菌素blasticidin，使其在培养基中的浓度为10μg/ml。细胞维持液为含2％胎牛血清的dmem培养基。1.2.2流感病毒的制备在直径为10cm的细胞培养皿中以3:1比例接种1.8×106个293t细胞和0.6×106个mdck细胞。培养24h后，使用lipofectamine2000转染甲型流感病毒(iav)a/wsn/33(h1n1)的8质粒(phw181-pb2，phw182-pb1，phw183-pa，phw184-ha，phw185-np，phw186-na，phw187-m，phw188-ns)，每种质粒的转染量为1.2μg。转染后6h，将培养液更换为新鲜的dmem培养基。转染后24h在培养基中加入终浓度为1μg/ml的tpck-trypsin。培养48h后收上清，1000rpm离心5min去掉细胞碎片，上清用0.45μm滤膜过滤，分装成小份，保存于-80℃冰箱。1.2.3流感病毒滴度测定(tcid50测定)参照文献报道的方法进行检测。将mdck细胞接种到96孔板，每孔接种104个细胞。培养24h细胞长成单层后，吸出上清，用pbs清洗2遍，每孔加入100μl用细胞维持液10倍系列稀释的病毒稀释液；同时设细胞对照组，只加100μl细胞维持液。置于35℃孵箱中培养，逐日观察细胞病变效应(cpe)并记录结果，一般于3-5d后终止观察，根据reed-muench两氏法计算病毒的滴度。1.2.4免疫印迹(westernblotting)检测收集6孔板中的细胞，加入ripa裂解液在冰上裂解30min后，12000rpm在4℃离心10min，收集上清制备细胞裂解液蛋白样品。样品经10％sds-page分离后，进行转膜、封闭和抗体孵育。抗体的使用浓度分别为：flu-np鼠单克隆抗体(1:5000)、β-actin鼠单克隆抗体(1:5000)，山羊抗小鼠二抗(1:5000)。最后用ecl发光液进行显色。1.2.5gaussia荧光素酶(gluc)活性检测gluc活性检测依照tannous等提供的方法操作。首先，在pbs溶液中溶解腔肠素h(coelenterazine-h)，配制浓度为16.7μm的底物工作液，室温避光孵育30min。取10μl待测上清到白色不透明96孔板中，使用酶标仪centroxs3lb960自动进样器将避光孵育的底物工作液按每孔60μl的进样量逐孔加入，持续收集信号0.5s，测量结果以相对光单位relativelightunits(rlu)表示。实验设三次重复。1.2.6实时荧光定量pcr(qrt-pcr)根据invitrogen公司的trizol使用说明书，提取细胞总rna。使用一步法荧光定量pcr反应试剂盒以管家基因gapdh为内参，用2－δδct法对编码np蛋白基因的mrna水平进行相对定量。np的rt-pcr引物为np-f(gggtcagttgctcacaagtcc)和np-r(ttgaagcagtctgaaagggtct)；gapdh的rt-pcr引物为gapdh-f(ggtatcgtggaaggactcatgac)和gapdh-r(atgccagtgagcttcccgttcag)。反应条件为：42℃逆转录5min；95℃，10sec；95℃，5sec和60℃，34sec共40次循环。实验设三次重复。2结果2.1阴性对照sirna(sinc)的验证首先借助实验室已有的a549-5ps细胞系验证阴性对照的可靠性，保证阴性对照sirna不会对后续的活性验证工作产生干扰。a549-5ps细胞系可以模拟流感病毒的转录复制系统，表达依赖病毒rna聚合酶特异性启动的分泌型gluc蛋白。首先通过逆转录pcr检测证实了a549-5ps细胞系中pb2、pb1、pa以及np基因mrna水平的表达及模拟的vrna的存在(图1)。由于a549-5ps细胞系中不存在m和ns蛋白的mrna，那么阴性对照sirna和靶向m和ns蛋白的sirna都不会对gluc信号产生明显的影响。图2结果显示，在转染了sinc、sim-1、sim-2、sins-1和sins-2的实验组中，gluc信号与未转染sirna的blank组相比没有明显的差异，证明实验中使用的阴性对照sinc不会对验证工作产生干扰。实验方法为接种a549-5ps细胞于6孔板中，每孔接种6×105个细胞。细胞接种24h后使用lipofectaminernaimax转染试剂转染sirna进入细胞，转染12h后进行第二次转染。二次转染后60h换液去除细胞之前分泌到上清液中的gluc蛋白。继续培养24h后取上清液按照1.2.5的方法检测gluc活性。其中，每次转染的sirna终浓度均为30nm；sirna分别为表1中的sim-1、sim-2、sins-1、sins-2和sinc。2.2sirna抗流感病毒活性的初步筛选用293t-gluc细胞系进行sirna抗流感病毒活性的初步筛选。293t-gluc可以表达由甲型流感病毒聚合酶特异性启动的分泌型gluc，在流感病毒感染后可以通过检测上清中的gluc活性来测定病毒的感染性。通过2次转染的方式对合成的10条sirna的抗病毒效果进行了初步验证(图3)。结果发现其中7条sirna抑制病毒的活性达到50％左右。实验方法为将293t-gluc细胞接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，细胞接种12h后使用lipofectaminernaimax转染sirna，12h后进行二次转染，二次转染sirna后24h加入1.2.2的流感病毒(moi＝2.5)，继续培养24h后收集上清按照1.2.5的方法检测gluc活性。其中，每次转染的sirna终浓度均为30nm；sirna分别为表1中的10种sirna和sinc。2.3sirna抗流感病毒活性的再次筛选为了避免筛选过程中出现的假阳性结果，又借助单轮感染流感病毒系统，在293t细胞中对sirna的抗流感活性进行了再次验证(图4)。结果发现初步筛选得到的7条sirna中，只有4条sirna抑制病毒的活性达到50％以上。最终，选取了sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2和sins-1这四种sirna进行下一步的验证工作。实验方法为将293t细胞接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，细胞接种12h后使用lipofectaminernaimax转染sirna，12h后进行二次转染，二次转染sirna后24h加入1.2.2的流感病毒(moi＝2.5)，继续培养12h后收集上清按照1.2.5的方法检测gluc活性。其中，每次转染的sirna终浓度均为30nm；sirna分别为表1中的10种sirna和sinc。2.4在病毒蛋白水平和mrna水平检测sirna抑制流感病毒复制的作用为了验证转染进入细胞的sirna抑制流感病毒复制的作用，分别收集样品进行病毒mrna水平和蛋白水平的检测。对于不同的sirna，统一采用了流感病毒标志性的np蛋白作为检测标准。免疫印迹(图5中a)和qrt-pcr(图5中b)实验结果显示，转染sirna的实验组(将sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2或sins-1转入293t细胞得到的细胞)中np蛋白表达量和mrna水平与阴性对照组(sinc转入293t细胞得到的细胞)相比都有明显的降低。而这一结果也与之前的筛选结果相吻合，证明sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2和sins-1可以有效地抑制流感病毒的复制。实验方法为将293t细胞接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，细胞接种12h后使用lipofectaminernaimax转染sirna，12h后进行二次转染，二次转染sirna后24h加入1.2.2的流感病毒(moi＝2.5)，继续培养12h后收集细胞，按照1.2.4的方法进行免疫印迹(westernblotting)检测，按照1.2.6的方法进行实时荧光定量pcr。其中，每次转染的sirna终浓度均为30nm；sirna分别为sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2，sins-1和sinc。2.5sirna的ec50测定通过测定不同浓度梯度下sirna的抑制效率，借助graphpadprism5软件对4条sirna的ec50值进行了计算和评估，结果表明sipb2-1的ec50为0.69nm(图6中a)，sipb2-2的ec50为0.40nm(图6中b)，sipb1-2的ec50为0.88nm(图6中c)，sins-1的ec50为1.3nm(图6中d)。与之前已发表的sirna序列相比，本发明设计的sirna的ec50值远小于文献中的报道，说明本发明的sirna(sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2和sins-1)有更为良好的抑制流感病毒的效果。实验方法为：接种293t-gluc细胞于24孔板，每孔接种1×105个细胞。细胞接种24h后使用lipofectaminernaimax转染不同浓度梯度的sirna进入细胞，转染12h后进行第二次转染。二次转染后12h感染1.2.2的流感病毒(moi＝2.5)，细胞继续培养24h后取上清液按照1.2.5的方法检测gluc蛋白活性。同时设空白组，不感染病毒；阴性对照组，转染sinc。抑制率＝(1-(样品组gluc蛋白活性-空白组gluc蛋白活性)/(阴性对照组gluc蛋白活性-空白组gluc蛋白活性))×100％。其中，每次转染的sirna浓度均相同，浓度梯度如图6所示；sirna分别为sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2，sins-1和sinc。实验设三次重复。2.6sirna对不同流感病毒毒株的抑制效果为了验证sirna是否具有广谱抗流感病毒作用，通过噬斑实验，分别对a/pr/8/34(h1n1),b/beijing-haidian/1386/2013两株流感病毒进行了sirna抑制效果的验证。图7结果显示sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2，sins-1对两种不同型别的流感病毒均具有抑制作用，这些sirna具有广谱的抗流感病毒作用。sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2和sins-1对a/pr/8/34(h1n1)的抑制效率分别为90.6％、87.3％、84.4％和62.8％；sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2和sins-1对b/beijing-haidian/1386/2013的抑制效率分别为50.4％、46.4％、35.4％和40.2％。实验方法如下：接种mdck细胞于12孔板，每孔接种3×105个细胞。细胞接种后24h，使用lipofectaminernaimax转染终浓度为30nm的sirna进入细胞，转染12h后进行第二次转染。二次转染后12h感染病毒。每孔加入400μl用dmem培养基稀释的病毒液，每个稀释度设2个复孔，置37℃，5％co2培养箱吸附2h。吸附完成后吸去上清，用37℃预热的pbs清洗1次，每孔加入1ml含有0.3％bsa和1.5μg/mltpck-trypsin的1％低熔点琼脂。待琼脂层凝固后，将细胞板倒置于35℃，5％co2培养箱中培养3-4天。当有肉眼可见的白色斑点出现后每孔加入1ml浓度为0.16mg/ml的中性红溶液进行染色，37℃避光作用4h后吸去染液计数空斑。实验设三次重复。其中病毒分别为a/pr/8/34(h1n1)(唐静,辛丽,郭俊峰,等.流感病毒a/pr/8/34重配母本株高免疫原性ha蛋白制备及鉴定[j].病毒学报,2016,32(2):141-144)和b型流感病毒b/beijing-haidian/1386/2013(成艳辉等.2013-2014年中国b型流感病毒抗原性及基因特性分析.中华实验和临床病毒学杂志.2015年10月第29卷第5期)。sirna分别为sipb2-1，sipb2-2，sipb1-2，sins-1和sinc。2.7sirna小鼠体内抗流感病毒活性2.7.1sirna雾化给药系统的建立在传统的体内实验中，通常采用滴鼻的方式给药，耗时耗力。为了提高给药效率，优化给药途径，设计了一套雾化给药系统(图8)。为了有效地评估每只小鼠的雾化给药量，对雾化给药装置进行了参数的测定。在保证小鼠不死亡的前提下，通过测定单位时间雾化装置内药物体积的变化来计算小鼠的给药体积。经计算，每组小鼠(2只)平均给药速率约为261μl/min。考虑到药物的管路损失，以250μl/min作为给药速率，以0.5ml的给药体积，给药2min作为此雾化装置的最佳给药参数。2.7.2体内抗流感病毒活性实验按照如下方法制备脂质体包裹的pbs、脂质体包裹的sipb2-1和脂质体包裹的sinc：将lipofectaminernaimax分别与ph为7.4的pbs、sipb2-1溶液和sinc溶液混合冰上孵育10分钟进行脂质体包裹，得到脂质体包裹的pbs、脂质体包裹的sipb2-1和脂质体包裹的sinc。其中，sipb2-1溶液的溶剂为ph为7.4的pbs，sipb2-1溶液中sipb2-1的浓度为1μm；sinc溶液的溶剂为ph为7.4的pbs，sinc溶液中sinc的浓度为1μm。30只balb/c小鼠(4-5周龄，sfp级，雄性，体重(23±2)g，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号：scxk-(军)2012－0004。饲养环境：室温(23±1)℃，相对湿度：(45±10)％)随机分为3组，每组10只，分别为(1)溶剂对照组(pbs+v)；(2)实验组(sipb2-1+v)；(3)阴性sirna对照组(sinc+v)。溶剂对照组的每只小鼠在实验开始给药一次脂质体包裹的pbs，24小时后第二次给药一次脂质体包裹的pbs；实验组的每只小鼠在实验开始给药一次脂质体包裹的sipb2-1，24小时后第二次给药一次脂质体包裹的sipb2-1；阴性sirna对照组的每只小鼠在实验开始给药一次脂质体包裹的sinc，24小时后第二次给药一次脂质体包裹的sinc。这3组balb/c小鼠均雾化给药，每次给药速率均为250μl/min，每次给药体积均为500μl，每次给药时间为2min。第二次给药后当天每只小鼠滴鼻接种40μl滴度为7-lgtcid50/ml的步骤1.2.2的流感病毒，连续观察记录小鼠的存活率和体重变化情况，死亡小鼠的体重记为零。实验结果显示实验组(sipb2-1+v)至流感病毒感染第14天存活7只，死亡3只，存活率为70％，阴性sirna对照组(sinc+v)至流感病毒感染第14天存活4只，死亡6只，存活率为40％；溶剂对照组(pbs+v)至流感病毒感染第14天存活2只，死亡8只，存活率为20％。雾化给入sipb2-1的实验组与溶剂对照组和阴性sirna对照组相比，流感病毒感染小鼠的存活率明显升高，分别是溶剂对照组和阴性sirna对照组的3.5倍和1.75倍，小鼠体重的变化也呈相对平稳的趋势(图9)，证明sipb2-1在动物体内具有抗流感活性，可以预防给药抵抗流感病毒的侵袭。<110>中国医学科学院医药生物技术研究所<120>可雾化吸入的抗流感病毒感染的sirna及其应用<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223><400>1caagcaguguguacauuga19<210>2<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223><400>2guucgucacacauguaacu19<210>3<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223><400>3ggagacgugguguugguaa19<210>4<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223><400>4ccucugcaccacaaccauu19<210>5<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223><400>5caaugaucuugguccagca19<210>6<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223><400>6guuacuagaaccaggucgu19<210>7<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223><400>7ggaagaaucugaugaggca19<210>8<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223><400>8ccuucuuagacuacuccgu19当前第1页12