一种检测T‑NOS终止子的RPA引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于转基因安全生物
技术领域：
，具体涉及一种检测T-NOS终止子的RPA引物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：转基因技术快速发展，目前，在我国已经有多个转基因作物品系进入安全评价阶段，申请商业化种植。与此同时，因转基因作物扩散引起的安全性问题受到了公众的广泛关注。为保护消费者的知情权和选择权，落实转基因产品标识制度、防止转基因作物未经安全批准进入生产流通环节，迫切需要建立快速简便的核酸检测方法，用于市场监管和例行监测。而在转基因检测中，目前，常规PCR检测方法存在操作繁琐、成本高、单一性等问题，不能适应现代经济的快速发展和频繁的贸易往来。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，与普通PCR不同，其模仿体内复制机理，反应不需要退火过程，整个反应简单快速，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。利用该方法建立的检测技术体系，适合于大规模的转基因植物的检测，可以极大的提高现场检测效率，并为我国在转基因产品的现场速测方面跻身世界前列奠定良好的基础。RPA方法的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，这是因为，RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基，引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。因此，RPA的引物设计难度较大。探针法的缺点则是探针设计上有难度。另外，探针法在扩增反应完毕后需要用荧光读取仪器才可以完成最后的结果显示。并且，当前转基因产品的检测显示结果采用电泳法时，需要用到高致癌性的荧光染料溴化乙锭，不仅危害操作人的健康，而且无法排除假阳性的问题，也不能进行田间的现场速测，这严重限制了转基因产品的检测效率，对转基因产品的安全管理是最大的制约。目前，国际上已经商业化生产的转基因产品中，如水稻、玉米、油菜、大豆等种子产品及以此为基础的深加工食品、制品，很多品系均是采用NOS作为终止子，即T-NOS，常规的检测手段需要将被检样品送至实验室进行检测，费时费力。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测T-NOS终止子的RPA引物、试剂盒及检测方法，无需探针，利用生物素、地高辛和FITC分别标记RPA正反向引物的5’端，能快速检测被检制品中是否含有转基因成分，具有高度专一性，灵敏度高，检测速度快，直观性强。为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一组NOS终止子的RPA引物，包括：RPA-nos-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；RPA-nos-R：5'-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。检测T-NOS终止子的RPA标记引物组，其由正向引物RPA-nos-F-地和反向引物RPA-nos-R-FITC组成，或由正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-FITC组成，或由正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-地组成；其中，所述正向引物为经生物素或地高辛对RPA引物RPA-nos-F的5'端标记的标记引物，具体为：RPA-nos-F-地：5'-Dig-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；RPA-nos-F-生：5'-Biotin-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；所述反向引物为用FITC或地高辛对RPA引物RPA-nos-R的5'端标记的标记引物，具体为：RPA-nos-R-FITC：5'-6-FAM-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'；RPA-nos-R-地：5'-Dig-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。一种检测T-NOS终止子的RPA检测试剂盒，其含有所述的RPA引物或所述的RPA标记引物组。一种检测T-NOS终止子的RPA检测方法，包括以下步骤：1)提取待测样品的DNA；2)RPA扩增以待测样品的DNA作为模板，将所述的RPA标记引物组加入到RPA扩增反应体系中，进行RPA扩增，得到双标记的核酸恒温扩增产物；3)扩增产物检测将吸附着生物素抗体及异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的核酸检测试纸条插入步骤2)的扩增产物中，侧向层析5～10分钟，根据显色条带进行判定：试纸条在检测线和对照线处都有紫色条带，则表示待测样品中含有T-NOS终止子；若仅在对照线处有紫色条带，则表示待测样品中不含有T-NOS终止子，若对照线处均无紫色条带，则表示无扩增或试纸条无效。进一步，所述的RPA反应体系中，DNA模板的终浓度为0.5～2ng/μl，正、反向标记引物的终浓度各为0.3～0.6μmol/L。优选地，所述RPA反应体系总体积为50μl，其中，浓度为10μmol/L的正、反向标记引物各加入2.4μl，浓度为20ng/μl的DNA模板加入2μl，RPA反应缓冲液29.5μl，ddH2O补足至50μl。进一步，步骤2)中，所述RPA扩增反应程序为：恒温36-38℃，16～20分钟。优选地，所述步骤2)中，RPA扩增反应程序为：恒温反应37℃4分钟，取出，混合均匀，再扩增16分钟。本发明利用重组酶聚合酶介导的等温扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)快速检测转基因产品中T-NOS终止子，根据外源基因插入调控元件的DNA序列，设计了大量的RPA特异性引物，从中筛选出一组RPA引物，再利用生物素、地高辛和异硫氰酸荧光素FITC分别标记正、反向引物的5’端后进行RPA扩增反应，反应中，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针与生物素标记的环介导等温扩增技术扩增产物特异性杂交，并与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体结合形成三元复合物结合在横向流动试纸条技术具有生物素抗体的检测线上；未杂交的异硫氰酸荧光素标记探针与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体形成不含生物素的两元复合物；通过检测线，结合在控制线上，可以快速有效检测转基因产品及制品中是否含有T-NOS终止子。本发明仅需将试纸条插入扩增后的反应液中，即可肉眼判读结果，简洁明了，所用的侧向流动试纸条检测技术，是将正向和反向引物的5’端分别标记上异硫氰酸荧光素(FITC)引物、生物素或地高辛，经过RPA反应得到双标记的核酸恒温扩增产物，将吸附着生物素抗体及异硫氰酸荧光素抗体的核酸检测试纸条插入到该扩增产物中，其会与胶体金标记的其特异性抗体相结合，在检测线处显示，反之，未杂交的引物会与其胶体金标记的特异性抗体相结合，并在对照线处显示，肉眼可以观察到显示结果，大大缩短了实验进程，简化了实验步骤，在准确性及快速检测方面得到了显著的提高，此检测方法可以省去电泳的步骤，无需引入探针，也无需用到高致癌性的荧光染料溴化乙锭。与现有技术对比，本发明具有如下有益效果：本发明的RPA引物，具有高度专一性，用生物素、地高辛和FITC分别进行标记后，在RPA扩增反应中，无需引入探针，就能快速检测被检制品中是否含有转基因成分，灵敏度高，检测速度快，直观性强。利用本发明的检测方法，无需引入探针，利用双标记核酸产物检测试纸条，仅需5～10分钟，就可以观察检测结果，省去了电泳的步骤，也无需用到高致癌性的荧光染料溴化乙锭，大大缩短了实验进程，简化了实验步骤，在准确性及快速检测方面得到了显著的提高，可以对含有T-NOS终止子的转基因产品进行田间筛查，快速检测T-NOS终止子的有无，大大节约了检测成本。附图说明图1为本发明实施例2中RPA标记引物为RPA-nos-F-地和RPA-nos-R-FITC的扩增电泳图谱；其中，M：DL2000Marker；1：NTC；2：RRS：转基因大豆；3：Bt11：转基因玉米；4：KF：转基因水稻；5：KMD：转基因水稻；6：MON531：转基因棉花；7：MS1：转基因油菜；8：RF1：转基因油菜。图2为本发明实施例2中RPA标记引物为RPA-nos-F-生和RPA-nos-R-地的扩增电泳图谱；其中，M：DL2000Marker；1：NTC；2：RRS：转基因大豆；3：Bt11：转基因玉米；4：KF：转基因水稻；5：KMD：转基因水稻；6：MON531：转基因棉花；7：MS1：转基因油菜；8：RF1：转基因油菜。图3为本发明实施例2中RPA标记引物为RPA-nos-F-生和RPA-nos-R-地的灵敏度扩增电泳图谱；其中，M：DL2000Marker；DNA采用RRS(转基因大豆)不同梯度稀释为：1：0copies；2：20copies；3：50copies；4：100copies；5：200copies；6：500copies；7：1000copies；2：2000copies。图4为本发明实施例2中克隆测序结果比对结果；其中，RPA-T-NOS-F：正向引物；MS1：转基因油菜；Bt11：转基因玉米；KF：转基因水稻；RRS：转基因大豆；MON531：转基因棉花；KMD：转基因水稻；T-NOS-V00087：T-NOS全序列；RF1：转基因油菜；RPA-T-NOS-F：反向引物。图5-6为本发明实施例中试纸条插入后结果显示结果；其中，NTC：空白对照；RRS：转基因大豆；Bt11：转基因玉米；KF：转基因水稻；KMD：转基因水稻；MON531：转基因棉花；MS1：转基因油菜；RF1：转基因油菜。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1一种检测T-NOS终止子的RPA引物的获得通过查阅文献和用BLAST软件分析，以10ng/μL的转基因大豆GTS40-3-2品系作为模板进行优化筛选，筛选出T-NOS终止子的基因核酸序列，并进行引物的设计和筛选。在RPA引物设计时考虑到以下几个要点：(1)引物长度的选择RPA引物的长度一般为30至35个核苷酸；(2)引物GC含量在40％～60％之间，碱基随机分布，5'端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤；(3)引物设计时尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成；(4)设计引物时尽量选择在终止子的构建特异性内部，以增加筛选元件的通用性。筛选后得到一对RPA引物，具体序列如下：RPA-nos-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；RPA-nos-R：5'-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。实施例2一种检测T-NOS终止子的RPA检测方法验证以常见的转基因产品大豆、玉米、棉花、水稻、油菜等作为对象，进行了扩增反应，并利用试纸条进行了检测，以电泳法为对比进行验证。1)分别提取待测样品DNA(RRS：转基因大豆；Bt11：转基因玉米；4：KF：转基因水稻；5：KMD：转基因水稻；6：MON531：转基因棉花；7：MS1：转基因油菜；8：RF1：转基因油菜)；2)标记RPA引物对实施例1中获得的RPA引物，分别在5’端进行生物素、地高辛和FITC标记，具体如表1。表1引物名称引物序列RPA-nos-F-地5’-Dig-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3’RPA-nos-R-FITC5’-6-FAM-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3’RPA-nos-F-生5’-Biotin-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3’RPA-nos-R-地5’-Dig-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3’3)恒温扩增将表1中引物利用TwistDx公司开发的RPA试剂盒进行重组酶聚合酶等温扩增，扩增反应总体积为50μl，浓度为10μmol/L的正向引物RPA-nos-F-地和反向引物RPA-nos-R-FITC(或正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-FITC、或正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-地)各加入2.4μl，浓度为20ng/μl的DNA模板加入2μl，RPA反应缓冲液29.5μl，ddH2O加入11.2μl补足至总体积50μl。扩增反应程序为：扩增温度37℃，反应时间分两部分：放入PCR仪器或恒温扩增仪中反应4分钟，拿出上下颠倒10次，再扩增16分钟。4)产物检测产物检测通过两种方法进行验证：(1)电泳法：将步骤3)的等温扩增产物按照TwistDx公司试剂盒说明进行酚氯仿纯化后电泳分析，电泳图谱如图1-2所示，图1-2中，有扩增条带则为含有T-NOS终止子的转基因产品，反之，无条带则表示该产品为不含有T-NOS终止子的转基因产品。对引物进行灵敏度扩增验证，将含有目的条带的片段克隆至质粒上，以质粒为模板，在2×103拷贝—20拷贝之间设7个梯度进行灵敏度验证，结果参见图3，由图3可知，50拷贝以上可以扩增出条带，20拷贝则无扩增。将上述扩增产物进行克隆测序后，比对结果如图4所示，由图4可以表明，扩增产物均为T-NOS终止子。(2)试纸条法：将固定有生物素抗体和异硫氰酸荧光素抗体的双标记核酸恒温扩增检测试纸条插入到步骤3)的扩增反应体系中，5-10分钟内，显示结果。检测试纸条同时在检测线和对照线处都有条带，则表示该产品为含有T-NOS终止子的转基因产品，反之，仅在对照线处有条带，则表示该产品为不含有T-NOS终止子的转基因产品，若检测线和对照线处均无条带，则表示无扩增或试纸条无效，具体如图5-6。由图5-6可以看出，利用本发明的RPA方法，准确度高，与电泳法结果相吻合，弥补了电泳法的不足，应用性更加广泛。当前第1页1 2 3