本发明涉及一种石油降解菌的培养方法。
背景技术：
：据估计全世界每年约有1×109吨石油及其产品通过各种途径进入地下水、地表水及土壤中，随着经济的高速增长，我国石油的环境治理任务也日益紧迫投加高效石油降解菌以强化石油类污染物的降解，以达到治理石油污染环境的目的势在必行。一般情况下，化学物理的处理方法成本较高并且存在二次污染，然而微生物处理相对成本较低、绿色环保。在油田污水处理领域，微生物技术应用广泛，但是存在的最大问题是原油为底物的高效降解石油功能菌的缺乏。技术实现要素：为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种石油降解菌的培养方法，本发明的技术方案是：一种石油降解菌的培养方法，包括以下步骤：(1)制备石油降解菌培养基，具体制备方法如下：蛋白胨10份，牛肉膏粉5份，琼脂粉18份，氯化钠5份，按照成分比例制备石油降解菌培养基，并在微波炉加热，加热时间：2min，加热温度：80℃，至琼脂完全融化为止，放入高压灭菌锅进行灭菌，灭菌温度121℃，时间30min，然后在生物安全柜内倒入已灭菌的干燥培养皿内，每个培养皿倒入15ml，将倒好培养基的培养皿放在安全柜内至冷却，冷却时间：5h，冷却温度：室温25℃，冷却后可放入冰箱冷藏备用；(2)将石油降解菌活化在石油降解菌培养基中，然后在超净工作台内对石油降解菌进行平板涂布，同时将石油降解菌溶液浓度进行梯度稀释，分别稀释到10的-2次方，10的-4次方、10的-6次方以及10的-8次方。(3)用移液枪取稀释好的石油降解菌溶液分别200微升，分别注入在培养皿内的石油降解菌培养基上，用涂布棒将石油降解菌溶液涂布均匀，并用记号笔在培养皿的底部进行标注，然后放入35℃的恒温培养箱中，进行培养，1-2天后，观察石油降解菌的生长情况，用记号笔分别划出培养基上生长的不同形态的石油降解菌，并标注序号，然后对标注的石油降解菌进行平板划线；(4)将划好的平板放入恒温培养箱，35℃，培养1-2天，观察平板上石油降解菌的生长，并对生长好的石油降解菌进行染色镜检，记录其形态特征，重复该操作，直至显微镜下观察的石油降解菌形态完全纯化为止，将纯化的石油降解菌进行在试管斜面培养基中进行斜面划线保藏。所述的步骤(2)中具体稀释方法为：用注射器取10ml蒸馏水放入试管中，将蒸馏水进行灭菌，在生物安全柜内，用移液枪取100微升的菌株溶液，注入到无菌蒸馏水的试管中，此时，该试管中的菌株溶液浓度为10的-2次方，同样方法，将菌株溶液分别稀释到10的-4次方、10的-6次方以及10的-8次方。所述的步骤(3)平板划线方法如下：在生物安全柜内，点燃酒精灯，用接种环顶部轻触标序号的石油降解菌，划在石油降解菌培养基上，每一序号的石油降解菌在培养基上划四区，每划一区将接种环放在酒精灯上燃烧，重复操作。所述的步骤(4)试管斜面培养基的制备方法：称取蛋白胨10g/l，牛肉膏粉5g/l，琼脂粉18g/l，氯化钠5g/l，按照配比进行混合，混合后在微波炉中加热，加热时间：1-2min，加热温度：70-80℃，至琼脂粉完全融化为止，用10ml的注射器取5ml注入试管中，将试管放入2l的烧杯进行包扎，然后放入高压灭菌锅进行灭菌，灭菌121℃，时间30min，灭菌后，将试管取出摆斜面，斜面的摆放标准是斜面上营养琼脂培养基的长度不超过整个试管长度的2/3，静置8h，待冷凝后，放入冰箱冷藏即可。本发明的优点是：经过本发明培养的石油降解菌，抗低温性能好，耐盐性能好，适合于油田污水处理的实际情况，而且不会污染环境。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明涉及一种石油降解菌的培养方法，包括以下步骤：(1)制备石油降解菌培养基，具体制备方法如下：蛋白胨10g/l，牛肉膏粉5g/l，琼脂粉18g/l，氯化钠5g/l，按照成分比例制备石油降解菌培养基，并在微波炉加热，加热时间：2min，加热温度：80℃，至琼脂完全融化为止，放入高压灭菌锅进行灭菌，灭菌温度121℃，时间30min，然后在生物安全柜内倒入已灭菌的干燥培养皿内，每个培养皿倒入15ml，将倒好培养基的培养皿放在安全柜内至冷却，冷却时间：5h，冷却温度：室温25℃，冷却后可放入冰箱冷藏备用；(2)将石油降解菌活化在石油降解菌培养基中，然后在超净工作台内对石油降解菌进行平板涂布，同时将石油降解菌溶液浓度进行梯度稀释，分别稀释到10的-2次方，10的-4次方、10的-6次方以及10的-8次方。(3)用移液枪取稀释好的石油降解菌溶液分别200微升，分别注入在培养皿内的石油降解菌培养基上，用涂布棒将石油降解菌溶液涂布均匀，并用记号笔在培养皿的底部进行标注，然后放入35℃的恒温培养箱中，进行培养，1-2天后，观察石油降解菌的生长情况，用记号笔分别划出培养基上生长的不同形态的石油降解菌，并标注序号，然后对标注的石油降解菌进行平板划线；(4)将划好的平板放入恒温培养箱，35℃，培养1-2天，观察平板上石油降解菌的生长，并对生长好的石油降解菌进行染色镜检，记录其形态特征，重复该操作，直至显微镜下观察的石油降解菌形态完全纯化为止，将纯化的石油降解菌进行在试管斜面培养基中进行斜面划线保藏。所述的步骤(2)中具体稀释方法为：用注射器取10ml蒸馏水放入试管中，将蒸馏水进行灭菌，在生物安全柜内，用移液枪取100微升的菌株溶液，注入到无菌蒸馏水的试管中，此时，该试管中的菌株溶液浓度为10的-2次方，同样方法，将菌株溶液分别稀释到10的-4次方、10的-6次方以及10的-8次方。所述的步骤(3)平板划线方法如下：在生物安全柜内，点燃酒精灯，用接种环顶部轻触标序号的石油降解菌，划在石油降解菌培养基上，每一序号的石油降解菌在培养基上划四区，每划一区将接种环放在酒精灯上燃烧，重复操作。所述的步骤(4)试管斜面培养基的制备方法：称取蛋白胨10g/l，牛肉膏粉5g/l，琼脂粉18g/l，氯化钠5g/l，按照配比进行混合，混合后在微波炉中加热，加热时间：1-2min，加热温度：70-80℃，至琼脂粉完全融化为止，用10ml的注射器取5ml注入试管中，将试管放入2l的烧杯进行包扎，然后放入高压灭菌锅进行灭菌，灭菌121℃，时间30min，灭菌后，将试管取出摆斜面，斜面的摆放标准是斜面上营养琼脂培养基的长度不超过整个试管长度的2/3，静置8h，待冷凝后，放入冰箱冷藏即可。实施例1：分别取100ml矿化度为6500mg/l、ph为6.0、含油量200mg/l的模拟含油污水于四只150ml锥形瓶中，编号a、b、c、d，向a、b、c三只锥形瓶中接入0.2ml纯化后的除油菌的菌液，d做空白对照，25，分别培养24h，以d空白为基准，用紫外分光光度计测定有含量，计算含油降解率，结果如下表：编号培养温度/(℃)含油降解率/(％)a1581.2b2589.5c3586.8实施例2：分别取100ml矿化度为6500mg/l、含油量200mg/l、ph按照下表配置的模拟含油污水于五只150ml锥形瓶中，编号a、b、c、d、e，向a、b、c、d三只锥形瓶中接入0.2ml纯化后的除油菌的菌液，e做空白对照，25℃条件下，分别培养24h，以e空白为基准，用紫外分光光度计测定有含量，计算含油降解率，结果如下表：编号ph含油降解率/(％)a5.077.6b6.081.8c7.082.9d8.079.5实施例3：分别取100ml含油量200mg/l、ph7.0、矿化度按下表设置的拟含油污水于四只150ml锥形瓶中，编号a、b、c、d，向a、b、c三只锥形瓶中接入0.2ml高效除油菌的菌液，d做空白对照，25℃条件下，分别培养24h，以d空白为基准，用紫外分光光度计测定有含量，计算含油降解率，结果如下表：编号矿化度/(mg/l)含油降解率/(％)a600088.6b700082.9c800080.8实施例4：分别取100ml矿化度为6500mg/l、含油量200mg/l、ph7.0的拟含油污水于四只150ml锥形瓶中，编号a、b、c、d，向a、b、c三只锥形瓶中按下表的接菌量接入纯化后的除油菌的菌液，d做空白对照，按下表所示的温度，分别培养24h，以d空白为基准，用紫外分光光度计测定有含量，计算含油降解率，结果如下表：编号接菌量/(ml)含油降解率/(％)a180.7b389.2c581.9当前第1页12