一种特异性检测风疹病毒核酸的荧光PCR方法及试剂盒与流程

本发明属于微生物体外核酸检测领域，具体涉及一种特异性检测风疹病毒核酸的荧光pcr方法及试剂盒，能够对风疹病毒核酸进行定性检测，可以作为有效的检测工具。
背景技术：
：风疹病毒(rubellavirus，rv)，是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，人是其唯一的自然宿主。感染风疹对人体的危害并不大，但rv对公众健康威胁最大的是它具有致畸性。孕妇感染rv后可对婴儿产生先天性损害，病毒可通过垂直传播侵犯胎儿，导致流产、死产或胎儿感染，从而引起严重的出生缺陷，包括白内障、耳聋、心脏病或智力低下，即为先天性风疹综合征(congenitalrubellasyndromes，crs)。虽然风疹病毒通过疫苗接种是可以预防的，但一旦感染，临床上暂无特效治疗，因此在临床上对风疹病毒的感染、实验室诊断及其流行特征极为重视。风疹病毒是单股，正链rna病毒，全长约9.7kbp。rv的基因组rna包括两个长的开放读码框架(orf)，一个是5’-近端的orf，编码两种非结构蛋白p150和p90，参与病毒的复制；另一个是3’-近端的orf，编码结构蛋白。其编码的3种结构蛋白为衣壳蛋白c和2种包膜糖蛋白e1、e2，其分子量分别为33、58、42～47kd，它们是rv的主要蛋白抗原。抗原表位主要存在于e1膜蛋白上。目前，临床实验室检测多采用血清学试验，如elisa、ria和ifa等，检测特异性抗体。血清风疹病毒-igm阳性证明近期感染己持续2～4个月。血清风疹病毒-igg阳性则提示既往感染。由于风疹病毒抗原来源困难，血清学试验尚难普及，而且某些人群感染病毒后抗体反应很弱或不产生抗体，因此仅以抗体检测结果不能准确判定风疹病毒感染情况，需辅以抗原或核酸检测结果作为诊断和治疗的依据。目前比较成熟的核酸检测方法是用荧光pcr方法，该方法克服了常规pcr法特异性差、易污染、结果分析操作步骤多等缺点，采用taqman方法或称双标探针法(荧光淬灭探针或称fq探针)，即在其5’端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个淬灭基团。靶序列的特异性探针和特异性的pcr引物同时使用，设计的该探针在上下游pcr引物的范围内退火，由三个寡核苷酸共同结合于目的基因片段，使其特异性大大增强。在pcr的延伸阶段，taqdna聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着pcr循环数的增加，游离报告基团的数量不断的增加，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定性分析。该pcr反应在封闭系统内进行，分析结果也无需开封，因此，避免了pcr产物污染的发生。目前，也有荧光pcr方法用于检测风疹病毒的报道，但是开发更多有效、快速、准确、灵敏度高、特异性强的荧光pcr方法用的引物和探针，并将此引物和探针用于检测试剂盒也是本领域追求的目标。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异性检测风疹病毒核酸的荧光pcr试剂盒，该试剂盒具有灵敏、特异和高效率的特点，从而实现检测样本中风疹病毒的核酸，实现定性检测。为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：一种特异性检测风疹病毒核酸的荧光pcr试剂盒，包括特异性引物对和荧光探针，所述特异性引物对和荧光探针如下：正向引物：5’-tgcaacgtcaccactgaaca-3’反向引物：5’-ggacctggacctcgagttgtc-3’荧光探针：5’-ccgttctgcaacacgccgca-3’。所述的荧光探针的两端分别标记报告荧光素或荧光染料、淬灭基团。标记的报告荧光素或荧光染料为fam或其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料，例如hex、tet、joe、yakimayellow、cy3、cy3.5、cy5、ned、vic、pet、rox、liz、red、texasred；淬灭基团为tamra或其它任何可以作为淬灭基团的化学物质，例如dabcyl、bhq1、bhq2。进一步地，所述试剂盒还包括pcr反应液、阳性质控品和阴性质控品。更进一步地，所述pcr反应液包括taq酶、dntp、缓冲液等成分。更进一步地，所述的阳性质控品含人工合成序列，所述的人工合成序列为人工合成含所述风疹病毒特异性引物对扩增产物片段的序列。该人工合成序列的内容为：ttgcgcgcgcatctggaatggcacacagcgcgcgtgcaccttctgggctgtcaacgcctactcctctggcgggtacgcgcagctggcctcttacttcaaccctggcggcagctactacaagcagtaccaccctaccgcgtgcgaggttgaacctgccttcggacacagcgacgcggcctgctggggcttccccaccgacaccgtgatgagcgtgttcgcccttgctagctacgtccagcaccctcacaagaccgtccgggtcaagttccatacagagaccaggaccgtctggcaactctccgttgccggcgtgtcgtgcaacgtcaccactgaacacccgttctgcaacacgccgcacggacaactcgaggtccaggtcccgcccgaccccggggacctggttgagtacattatgaattacaccggcaatcagcagtcccggtggggcctcgggagcccgaattgccacggccccgattgggcctccccggtttgccaacgccattcccctgactgctcgcggcttgtgggggccacgccagagcgcccccggctgcgcctggtcgacgccgacgaccccctgctgcgcactgcccctggacccggcgaggtgtgggtcacgcctgtcataggctctcaggcgcgcaagtgcggactccacatacgcgctggaccgtacggccatgctaccgtcgaaatgcccgagtggatccacgcccacaccaccagcgacccctggcatccaccgggccccttggggctgaagttcaagacagttcgcccggtggccc。优选地，所述的阳性质控品是通过在puc57质粒载体中插入所述人工合成含所述特异性引物对扩增产物片段的序列重组制得。具体地，所述阳性质控品所含的重组puc57载体质粒浓度为1ng/μl。更进一步地，所述的阴性质控品含人工合成的人类管家基因gapdh部分片段的序列。更进一步地，所述的阴性质控品是通过在ptg19-t质粒载体中插入所述人工合成人类管家基因gapdh部分片段的序列重组制得。具体地，所述的阴性质控品所含的重组ptg19-t载体质粒浓度为1ng/μl。更进一步地，用于扩增所述的人工合成人类管家基因gapdh部分片段的引物对如下：正向引物：5’-caaaggccaggctgtaaatg-3’反向引物：5’-agagacaagaggcaagaagg-3’。更进一步地，所述的人工合成人类管家基因gapdh部分片段的序列为：caaaggccaggctgtaaatgtcaccgggaggattgggtgtctgggcgcctcggggaacctgcccttctccccattccgtcttccggaaaccagatctcccaccgcaccctggtctgaggttaaatatagctgctgacctttctgtagctgggggcctgggctggggctctctcccatcccttctccccacacacatgcacttacctgtgctcccactcctgatttctggaaaagagctaggaaggacaggcaacttggcaaatcaaagccctgggactagggggttaaaatacagcttcccctcttcccacccgccccagtctctgtcccttttgtaggagggacttagagaaggggtgggcttgccctgtccagttaatttctgacctttactcctgccctttgagtttgatgatgctgagtgtacaagcgttttctccctaaagggtgcagctgagctaggcagcagcaagcattcctggggtggcatagtggggtggtgaataccatgtacaaagcttgtgcccagactgtgggtggcagtgccccacatggccgcttctcctggaagggcttcgtatgactgggggtgttgggcagccctggagccttcagttgcagccatgccttaagccaggccagcctggcagggaagctcaagggagataaaattcaacctcttgggccctcctgggggtaaggagatgctgcattcgccctcttaatggggaggtggcctagggctgctcacatattctggaggagcctcccctcctcatgccttcttgcctcttgtctct。根据本发明，所述试剂盒的反应体系为20μl-50μl，当所述试剂盒的反应体系为20μl体系，所述试剂盒包括：pcr反应液(2x)10μl，正向引物0.5μl(10μmol/ml)，反向引物0.5μl(10μmol/ml)，荧光探针0.5μl(10μmol/ml)，被检测物细胞、组织、体液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4μl，灭菌超纯水加至20μl；当所述试剂盒的反应体系为50μl体系，所述试剂盒包括：pcr反应液(2x)25μl，正向引物1.25μl(10μmol/ml)，反向引物1.25μl(10μmol/ml)，荧光探针1.25μl(10μmol/ml)，被检测物细胞、组织、体液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4-10μl，灭菌超纯水加至50μl。根据本发明，所述的试剂盒的荧光pcr扩增的反应时间和温度为：50℃，2min1个循环(如果pcr反应液不含ung酶则省略)；95℃，2-10min(依据不同来源的pcr反应液而定)1个循环；95℃，15s，60℃，1min，40个循环并收集荧光信号。本发明采取的另一技术方案是：一种特异性检测风疹病毒核酸的荧光pcr方法，采用上述试剂盒进行检测。由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明试剂盒通过对大量临床样本进行检测，能够有效检测出风疹病毒，大量临床样本的检测也对试剂盒的有效性、大规模使用性提供了保障。本发明试剂盒，风疹病毒荧光pcr检测的反应效率高达88.9％，具有较高的反应效率。附图说明图1为风疹病毒荧光pcr引物对的质检电泳图；图中，1：风疹病毒荧光pcr反应正向引物；2：风疹病毒荧光pcr反应反向引物；m：电泳marker，长度由上到下依次为20，24，36(单位：碱基)。图2为风疹病毒荧光pcr探针的质检hplc图。图3为puc57重组质粒构成示意图。图4为ptg19-t质粒载体构成示意图。图5为阳性质控品荧光pcr的扩增反应图；图中从左至右的曲线分别对应阳性质控品的浓度从高到低。图6为图5中扩增反应对应的标准曲线图。具体实施方式本发明的试剂盒采用自主设计的荧光pcr反应特异性引物对和荧光探针、人工合成的阳性质控品、人工合成的阴性质控品，具有灵敏度高、特异性强、反应效率高的特点，可以实现对风疹病毒的定性检测，能够成为有效的辅助检测工具。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，应当说明一点，实施例仅用于具体说明本发明而不用于限制本发明。实施例1：特异性检测风疹病毒核酸的pcr试剂盒的制备1、特异性引物对和荧光探针的设计和合成使用primerexpress3.0软件，用风疹病毒e1基因的序列设计特异性引物对和其特异性的荧光探针，引物和探针均由上海捷瑞生物有限公司合成，在合成的探针上进行了双荧光和淬灭基团标记。其中，引物为page纯化，探针为hplc纯化。设计出的特异性引物对和探针如下：正向引物：5’-tgcaacgtcaccactgaaca-3’(seqidno.1)反向引物：5’-ggacctggacctcgagttgtc-3’(seqidno.2)荧光探针：5’-ccgttctgcaacacgccgca-3’(seqidno.3)。引物和探针合成后均制备成冻干粉状，然后用1×tebuffer稀释至100μm的浓度作为母液，-20℃保存。工作液为母液通过无菌水稀释10倍制得，用于常规使用。对特异性引物对和荧光探针进行质检分析，结果如图1和图2所示。2、阳性质控品和阴性质控品的制备阳性质控品的制备：含本发明的特异性引物对扩增产物的特异性序列片段由南京金斯瑞生物有限公司合成，然后用重组dna基因工程方法人工装入puc57质粒载体中，再通过转化大肠杆菌、质粒扩增和质粒提取等步骤获得重组质粒dna，此质粒dna就是本发明试剂盒中所使用的阳性质控品，该阳性质控品所含的特异性序列如seqidno.4所示。puc57重组质粒构成示意图如图3所示。阴性质控品的制备：是以人类管家基因gapdh基因为模板，设计常规pcr引物，从人类组织细胞提取的基因组dna中进行pcr扩增，获得扩增产物，然后用重组dna基因工程的方法将扩增产物人工装配到ptg19-t质粒载体中，再通过转化大肠杆菌、质粒扩增和质粒提取等步骤获得重组质粒dna，此质粒dna就是本发明试剂盒中所使用的阴性质控品，该阴性质控品所含的特异性序列如seqidno.7所示。ptg19-t质粒载体构成示意图如图4所示。其中，阴性质控品制备中的设计的常规pcr引物如下：正向引物：5’-caaaggccaggctgtaaatg-3’(seqidno.5)；反向引物：5’-agagacaagaggcaagaagg-3’(seqidno.6)。3、pcr反应液pcr反应液包括taq酶、dntp、缓冲液等成分，可以使用购自abi公司的荧光pcr反应混合液，名称是universalmastermixii,withung。实施例2：样本总rna的提取和逆转录1、样本总rna的提取使用的是qiagen公司的minikit(货号74104)rna提取试剂盒，具体步骤参照说明书。2、逆转录反应将提取完的样本的rna进行逆转录反应。逆转录所用试剂购自invitrogen公司的m-mlv反转录酶(货号28025-021)。反应体系20μl。具体步骤为：1)65℃，5min，冰敷，短暂离心。2)加入4μl5xfirst-strandbuffer，2μl0.1mdtt，1μlrnaseouttm。3)轻微混匀，37℃孵育2min。4)加入1μlm-mlv逆转录酶，用移液枪轻轻吹打均匀，25℃，10min。5)37℃，50min。6)70℃，15min。7)反应结束后，将产物放-20℃保存。实施例3：标准曲线的制作选取阳性质控品作为标准物，稀释浓度至1μg/ml，然后继续以10倍梯度稀释五个浓度，一共是6个浓度梯度，即1μg/ml、10-1μg/ml、10-2μg/ml、10-3μg/ml、10-4μg/ml、10-5μg/ml。然后进行荧光pcr扩增反应，用与abi7500仪器配套的软件生成标准曲线。结果如图5和图6所示，且仪器的系统显示，反应效率达88.9％。实施例4：风疹病毒荧光pcr扩增反应和结果分析1、荧光pcr扩增反应采用的反应体系如表1所示，在荧光pcr专用八联管中配置好每个体系后，放入abi7500荧光pcr仪器中(或其它类型的开放式荧光定量pcr仪器)，准备进行反应。每次实验都需要配置1个阳性质控品的反应管作为阳性对照和一个阴性质控品的反应管作为阴性对照。表1体系内容体积(μl)pcr反应液10正向引物0.5反向引物0.5荧光探针0.5无菌水4.5待测样本4总计20表1中的待测样本为通过实施例2的方式制备得到的待测样本。2、荧光pcr扩增反应采用的反应条件表2所示。表23、结果分析1)反应结束后，首先，基线的选取设置为“自动”。阈值(threshold)设定的原则是阈值线刚好超过阴性质控品的扩增曲线的最高点，使其ct值＝40或“undetermined”。2)设置好阈值后，观察阳性质控品的扩增曲线是否为正常的s型对数增长曲线，且ct值≤37。满足上述条件则说明本次实验反应正常，否则，需要重做。3)结果判定。ct值≤37，表示该样本结果为阳性，ct值>37或“undetermined”，表示该样本结果为阴性。应用实施例使用本发明试剂盒对收集到的124例组织样本进行了检测。124例样本为临床收集的胎儿组织，分两组：正常引产组(对照组)41例，自发性流产组(患病组)83例。按照上述实施例2：样本总rna的提取和逆转录的程序进行操作，分别提取所有样本的rna并逆转录成cdna。随后按照上述实施例4：风疹病毒荧光pcr扩增反应和结果分析，使用本发明试剂盒在abi7500荧光pcr仪进行荧光pcr检测，结果如下表3所示。表3从表中的结果可以得出，本发明试剂盒能够成功检测出风疹病毒，并且从正常组和患病组的阳性率结果来看，本发明试剂盒可以很好地区分正常对照组和患病组,两者阳性率的比率是1比8.89,也就是说患病组风疹病毒的感染率是正常对照组的接近9倍,结果显示本发明试剂盒具有很好的灵敏度和特异性，能够作为检测风疹病毒的有效工具。大量临床样本的检测对试剂盒的有效性、大规模使用性提供了保障。本发明试剂盒，风疹病毒的反应效率高达88.9％，具有较高的反应效率。以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>张家港蓝苏生物工程有限公司<120>一种特异性检测风疹病毒核酸的荧光pcr方法及试剂盒<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>检测风疹病毒的正向引物<400>1tgcaacgtcaccactgaaca20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>检测风疹病毒的反向引物<400>2ggacctggacctcgagttgtc21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>检测风疹病毒的荧光探针<400>3ccgttctgcaacacgccgca20<210>4<211>791<212>dna<213>人工序列<220><223>试剂盒阳性质控品所含的特异性序列<400>4ttgcgcgcgcatctggaatggcacacagcgcgcgtgcaccttctgggctgtcaacgccta60ctcctctggcgggtacgcgcagctggcctcttacttcaaccctggcggcagctactacaa120gcagtaccaccctaccgcgtgcgaggttgaacctgccttcggacacagcgacgcggcctg180ctggggcttccccaccgacaccgtgatgagcgtgttcgcccttgctagctacgtccagca240ccctcacaagaccgtccgggtcaagttccatacagagaccaggaccgtctggcaactctc300cgttgccggcgtgtcgtgcaacgtcaccactgaacacccgttctgcaacacgccgcacgg360acaactcgaggtccaggtcccgcccgaccccggggacctggttgagtacattatgaatta420caccggcaatcagcagtcccggtggggcctcgggagcccgaattgccacggccccgattg480ggcctccccggtttgccaacgccattcccctgactgctcgcggcttgtgggggccacgcc540agagcgcccccggctgcgcctggtcgacgccgacgaccccctgctgcgcactgcccctgg600acccggcgaggtgtgggtcacgcctgtcataggctctcaggcgcgcaagtgcggactcca660catacgcgctggaccgtacggccatgctaccgtcgaaatgcccgagtggatccacgccca720caccaccagcgacccctggcatccaccgggccccttggggctgaagttcaagacagttcg780cccggtggccc791<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>扩增阴性质控品人工合成片段的正向引物<400>5caaaggccaggctgtaaatg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>扩增阴性质控品人工合成片段的反向引物<400>6agagacaagaggcaagaagg20<210>7<211>800<212>dna<213>人工序列<220><223>试剂盒阴性质控品所含的特异性序列<400>7caaaggccaggctgtaaatgtcaccgggaggattgggtgtctgggcgcctcggggaacct60gcccttctccccattccgtcttccggaaaccagatctcccaccgcaccctggtctgaggt120taaatatagctgctgacctttctgtagctgggggcctgggctggggctctctcccatccc180ttctccccacacacatgcacttacctgtgctcccactcctgatttctggaaaagagctag240gaaggacaggcaacttggcaaatcaaagccctgggactagggggttaaaatacagcttcc300cctcttcccacccgccccagtctctgtcccttttgtaggagggacttagagaaggggtgg360gcttgccctgtccagttaatttctgacctttactcctgccctttgagtttgatgatgctg420agtgtacaagcgttttctccctaaagggtgcagctgagctaggcagcagcaagcattcct480ggggtggcatagtggggtggtgaataccatgtacaaagcttgtgcccagactgtgggtgg540cagtgccccacatggccgcttctcctggaagggcttcgtatgactgggggtgttgggcag600ccctggagccttcagttgcagccatgccttaagccaggccagcctggcagggaagctcaa660gggagataaaattcaacctcttgggccctcctgggggtaaggagatgctgcattcgccct720cttaatggggaggtggcctagggctgctcacatattctggaggagcctcccctcctcatg780ccttcttgcctcttgtctct800当前第1页12