一种靶向PDPN基因的人源嵌合抗原受体及其用途的制作方法

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种靶向pdpn基因的人源嵌合抗原受体及其用途。

背景技术：

设计活体外产生的自体抗原特异性t细胞，通过肿瘤特异性t细胞介导的免疫反应是治疗肿瘤的有前景的方法。目前，已证实肿瘤特异性t细胞的分离及转移在治疗黑色素瘤、血液肿瘤取得了良好的临床结果。

嵌合抗原受体(car，chimericantigenreceptor)通过外源性基因转导技术获得t细胞新颖的特异性。car作为合成受体，由一个能够识别肿瘤相关特异性抗原的scfv(单链抗体，由抗体vl区氨基酸序列和vh区氨基酸序列经linker连接而成)，通过铰链结构与能够活化t细胞的单一融合分子中的一个或多个信号转导结构域相关联的靶向部分结合，这样scfv通过跨膜区与t细胞胞内的活化增殖信号域偶联，通过scfv识别肿瘤特异性抗原，产生t细胞活化的信号，经过回输患者体内，活化增殖t细胞，能够以非mhc限制性的模式表达较强的抗肿瘤作用。

第一代car的信号转导结构域衍生自cd3ζ的细胞质区域或fc受体伽马链。然而，第一代car受体缺乏t细胞的共刺激信号，导致t细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少的不足。第二代car在第一代car的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供了t细胞活化的两种信号，包括如cd28，cd134/ox40，cd137/4-1bb，来提高car改造的t细胞存活率及增殖率，并增加了细胞因子分泌功能，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制。

pdpn(podoplanin)是一种在淋巴内皮中表达的i型跨膜粘蛋白样糖蛋白，被认为是肿瘤研究中较特异的淋巴标志物。在多种实体瘤中高表达，如非小细胞肺癌，鳞状细胞癌，恶性间皮瘤，卡波西肉瘤，睾丸精原细胞瘤，脑肿瘤等。pdpn的表达与肿瘤恶性程度进展、上皮间质转化及转移相关。在胶质瘤中，pdpn的表达与肿瘤恶性程度相关。pdpn主要在间充质胶质母细胞瘤中高表达。因此，pdpn是一种用于免疫治疗胶质瘤等肿瘤的吸引人的靶抗原。而鼠源的scfv在输注人体后，会产生宿主抗移植物反应(hama)，严重影响修饰后的t细胞对pdpn阳性肿瘤细胞的杀伤作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种靶向pdpn基因的人源嵌合抗原受体及其用途，采用了人源化的scfv，能够避免宿主抗移植物反应，该嵌合抗原受体中的scfv具有抗人pdpn的特异性，能特异性结合到靶抗原上，发挥针对胶质瘤细胞的细胞毒效应，所述的嵌合抗原受体能够用于修饰t淋巴细胞，修饰后的t细胞用于pdpn阳性的肿瘤治疗，尤其对表面pdpn阳性的胶质瘤细胞具有特异杀伤作用。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种靶向pdpn基因的人源嵌合抗原受体，其含有针对人pdpn抗原的单链抗体hpdpnscfv和t细胞刺激信号转导结构，其中，所述单链抗体hpdpnscfv的轻链可变区和重链可变区之间由连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列如seqidno.5示。

进一步，所述单链抗体hpdpnscfv中，其重链的氨基酸序列如seqidno.1所示，其轻链的氨基酸序列如seqidno.3所示。

又进一步，所述所述单链抗体hpdpnscfv中，其重链的核苷酸序列如seqidno.2所示，其轻链的核苷酸序列如seqidno.4所示。

进一步，所述t细胞刺激信号转导结构为以人cd137铰链区和人cd3ζ胞内区结构串联组成的结构域，其氨基酸序列如seqidno.9所示。

优选地，靶向pdpn基因的人源嵌合抗原受体由针对人pdpn抗原的单链抗体hpdpnscfv、人cd137胞内区和人cd3ζ胞内区串联组成hpdpnscfv-cd137-cd3ζ，其氨基酸序列如seqidno.7所示。

进一步，所述靶向pdpn基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列如seqidno.8所示。

又优选地，所述靶向pdpn基因的人源嵌合抗原受体由抗人pdpn单克隆抗体scfv、人cd28胞内区、人cd137(即4-1bb)胞内区和人cd3ζ胞内区结构串联组成。

进一步，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有信号肽cd8a，该信号肽的氨基酸序列如seqidno.11所示，其核苷酸序列如seqidno.12所示。

本发明提供携带上述靶向pdpn基因的人源嵌合抗原受体编码基因的表达载体，尤其是嵌合抗原受体pdpnscfv-cd137-cd3ζ编码基因的表达载体。

本发明所述的嵌合抗原受体能够用于修饰t淋巴细胞，修饰后的t细胞用于pdpn阳性的肿瘤治疗，尤其是表面pdpn阳性的胶质瘤。

鼠源的单链抗体在输注人体后，会产生宿主抗移植物反应(hama)，严重影响修饰后的t细胞对pdpn阳性肿瘤细胞的杀伤作用，本发明针对抗鼠pdpn单克隆抗体的scfv基因序列，采用框架置换及随机突变的方案，分别将重链和轻链中cdr区氨基酸与人源的框架进行组合，构建人源化的抗体重链和轻链序列，并通过重叠延伸pcr技术加入linker形成抗人pdpn特异性scfv，人源化的单链抗体hpdpnscfv将抗体中的框架区替换为人源的氨基酸序列，可以最大程度额避免hama。

本发明利用抗人pdpn单链抗体构建出嵌合抗原受体即hpdpn-car，使用信号肽cd8α引导嵌合抗原受体跨膜表达，使用p2a将截短型的egfr与嵌合抗原受体阅读框连接起来(参见图1)，实现在一个启动子的调控下控制两个基因的表达，能以egfrt的表达水平间接反映hpdpn-car的表达水平，可以通过检测egfr的表达间接反映嵌合抗原受体的表达效率，表达该嵌合抗原受体的t细胞具有独特性，其具有肿瘤特异性杀伤功能，能够在临床中用于肿瘤表面pdpn阳性的肿瘤治疗，尤其是表面pdpn阳性的胶质瘤。

进一步，本发明利用基因工程编辑技术获得编码嵌合抗原受体hpdpnscfv-cd137-cd3ζ的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，感染人t细胞，使t细胞表达该嵌合抗原受体。

通过流式细胞术、ldh细胞毒性分析实验、elisa检测t细胞分泌的细胞因子，证明经本发明的嵌合抗原受体修饰的t细胞对胶质瘤细胞具有特异杀伤作用，能够特异性识别并杀伤表面pdpn阳性的肿瘤细胞，因此，本发明所述的嵌合抗原受体可应用于胶质瘤免疫治疗中。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的靶向pdpn基因的人源嵌合抗原受体，将具有较强免疫原性的鼠源框架区域替换为人源氨基酸序列，最大程度的避免hama反应，人源后的嵌合抗原受体，具有抗人pdpn的特异性，特异性结合到靶抗原上，并发挥针对胶质瘤细胞的细胞毒效应，经所述嵌合抗原受体能用于修饰t淋巴细胞，修饰后的t细胞用于表面pdpn阳性的肿瘤治疗，尤其对表面pdpn阳性的胶质瘤具有特异杀伤作用。

附图说明

图1为本发明的抗人hpdpn嵌合抗原受体(hpdpn-car)与p2a-egfrt的结构示意图。

图2为本发明实施例1的hpdpn单链抗体表达载体酶切电泳图。

图3为本发明实施例1的hpdpn单链抗体sds-page结果图。

图4为本发明实施例1流式细胞仪检测鼠源pdpnscfv单链抗体与靶蛋白结合水平结果图。

图5为本发明实施例1流式细胞仪检测hpdpnscfv单链抗体与靶蛋白结合水平结果图。

图6为本发明实施例2的hpdpn-car慢病毒表达载体示意图。

图7为本发明实施例2的hpdpn-car慢病毒质粒的部分测序结果峰值图。

图8为本发明实施例2的嵌合抗原受体慢病毒表达载体的经过酶切电泳图；其中，1：人源化抗体二代嵌合抗原受体，2：ecori-smai酶切人源化抗体二代嵌合抗原受体；m：dna分子量标记。

图9为本发明实施例3的慢病毒滴度测定中，alb的标准曲线图。

图10为本发明实施例3的慢病毒滴度测定中，ltr的标准曲线图.

图11为本发明实施例4中流式细胞仪检测慢病毒感染原代t细胞的car表达水平。

图12为本发明实施实例5中car-t细胞与靶细胞进行共培养，car-t细胞在不同效靶比的情况下对靶细胞的杀伤作用。

图13-14为本发明实施实例5中car-t细胞与靶细胞进行共培养，car-t细胞在不同效靶比的情况下分泌表达白介素2及伽马干扰素的能力。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1嵌合抗原受体hpdpn单链抗体的获得

通过生物信息学手段对鼠源抗体进行人源化设计，以获取人源化抗体的编码核苷酸序列，纯化单链抗体scfv，并进行实验验证，具体如下：

1.设计人源化的抗体重链和轻链序列

根据已有的anti-podoplanin鼠源抗体序列采用框架置换及随机突变的方案，分别将重链和轻链中cdr区氨基酸与人源的framework进行组合，构建人源化的抗体重链和轻链序列，获得的人源化抗体重链的氨基酸序列为seqidno.1，核酸序列为seqidno.2；人源化抗体轻链的氨基酸序列为seqidno.3，人源化的轻链核酸序列为seqidno.4。

2.构建人源化抗体的表达载体

根据上述设计的人源化抗体重链和轻链核苷酸序列信息，分别进行基因合成，重链和轻链之间通过g4s3linker(氨基酸序列seqidno.5、核苷酸序列seqidno.6)进行连接，合成后使用ecori-bglii亚克隆至单链抗体表达载体pfuse-higg1-fc2中，重组载体经酶切鉴定，电泳图参见图2，确定无误后，送至金唯智生物科技有限公司进行测序，测序用引物序列为：5'-tctgttctgcgccgttacaga-3'。测序验证序列准确无误后，采用无内毒素质粒大抽试剂盒，制备转染级别的质粒。

3.人源化单链抗体的表达及纯化

具体步骤如下：

1)从液氮中复苏293tbe细胞，使用freestyle293培养基、37℃、5％co2培养箱、110rpm进行培养，将细胞连续传代5次。

2)进行转染的前一天，将细胞更换为新鲜的培养基，并调整细胞密度至5×10⁵个/ml，过夜培养；

3)从-80℃冰箱中取出100μm的pei和质粒，室温解冻后，按照pei/vector＝3:1的比例配置转染复合物，调整质粒的用量为2.5μg/ml，将pei加入至质粒中后，迅速用移液器吹打混匀，室温静置15min后，将转染复合物逐滴加入到293tbe细胞中，继续培养8小时。

4)向培养瓶中加入1倍体积的新鲜培养基，继续摇瓶培养过夜。

5)从培养箱中取出细胞，向其中加入终浓度为0.5％的tryptone，继续培养5天。

6)从培养箱中取出细胞，2000×g4℃离心15分钟，将上清转移至一个新的50ml离心管中，并加入1倍体积的pbs进行稀释。

7)从4℃冰箱中取出proteina柱子，设置流速为1ml/min，使用5倍体积的pbs缓冲液洗涤柱子，然后将收集的上清过柱子，流速设置为1ml/min；样品全部过柱之后，使用ph值为3.0的甘氨酸缓冲液将柱子上结合的单链抗体洗脱下来，并迅速使用ph值为9.0的tris缓冲液进行中和。

8)将纯化的单链抗体使用15kda的半透膜透析过夜，透析介质为pbs。

9)将透析袋中的液体转移至一个截留分子量为15kda的centrifugalfilter中，3000×g离心10分钟，浓缩获得人源化单链抗体。

4.将人源化的单链抗体进行sds-page电泳

1)制备凝胶

制备分离胶：

配制20ml10％的聚丙烯酰胺(paa)溶液，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板之间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入，约3～4mm高，以进行水封。30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。

制备浓缩胶：

配制10ml3％的paa，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离玻璃板上缘约0.5cm处轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30min后凝胶聚合，再放置20～30min。小心拔去样品槽模板，将ph值为8.3的tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下储槽中，准备加样。

2)处理样品

取步骤3中浓缩后的单链抗体溶液100μl，加入10μl100×的上样缓冲液后，在100摄氏度沸水浴中保温5min，取出冷却后取样电泳。

3)加样

在电极槽中倒入ph值为8.3的tris-hcl电极缓冲液(内含0.1％的sds)，向上样孔中加入约50μl样品，开始时电流为10ma；待样品进入分离胶后，改为30ma；当染料前沿距硅胶框底边1.5cm时，停止电泳，关闭电源。

4)显色

电泳结束后，取下凝胶，加入染色液染色过夜，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，参见图3，由图3可知纯化的单链抗体条带清晰，无杂蛋白污染。

5.人源化单链抗体的facs检测

步骤如下：

1)从液氮中复苏u87细胞，置于37℃5％co2培养箱中培养；并连续传代5次，调整细胞至对数生长期。

2)使用0.25％的胰酶消化u87细胞，制备细胞悬液，使用pbs调整细胞密度至1×10⁶个/ml。

3)按照10μg/1×10⁶个细胞分别加入上述制备的人源化单链抗体，室温孵育30min中。

4)使用pbs洗涤细胞3次，每次5分钟；最后一次洗涤后，加入100μlpbs重悬细胞团。

5)加入10ulpe-anti-humanigg，移液器吹打混匀后，室温孵育30min。

6)使用pbs洗涤细胞3次，每次5分钟；最后一次洗涤后，加入500μlpbs重悬细胞团。

7)进行流式细胞分析，对获得的人源化单链抗体scfv进行比较分析结果如图4、图5所示。

由图4可见，鼠源的单链抗体与靶细胞u87共孵育后，可以显著结合细胞表面的靶蛋白；由图5可以看出，在进行人源化之后，获得的人源单链抗体同样可与靶细胞表面的靶蛋白进行结合。

实施例2构建嵌合抗原受体抗人pdpnscfv-cd137-cd3ζ慢病毒质粒

根据实施例1中获得的人源化单链抗体scfv序列信息，构建pdpnscfv-cd137-cd3ζ慢病毒表达载体，为慢病毒生产制备载体，包括如下步骤：

根据facs的结果，选择能够与靶标蛋白结合的单链抗体序列作为模板，构建抗人hpdpn嵌合抗原受体(hpdpn-car，简称car，下同)，t细胞刺激信号转导结构为以人cd137铰链区和人cd3ζ胞内区结构串联组成的结构域，其氨基酸序列如seqidno.9所示，核苷酸序列如seqidno.10所示，获得的hpdpn-car的结构示意如图1所示，其氨基酸序列如seqidno.7所示、核苷酸序列seqidno.8所示。

使用cd8a的信号肽(其氨基酸序列如seqidno.11所示、核苷酸序列seqidno.12所示)引导car跨膜表达，使用p2a将截短型的egfr与car阅读框连接起来，可以通过检测egfr的表达间接反映car的表达效率。将合成后的car序列亚克隆至慢病毒表达载体lenti-ef1a-puro中，得到car慢病毒表达载体lenti-ef1a-car，送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的hpdpnscfv-cd137-cd3ζ序列比对，证实正确。

制备无内毒素慢病毒包装质粒lenti-ef1a-car质粒，质粒信息见图6，car的表达由ef1a启动子驱动，并通过2a肽段与表皮因子生长受体进行连接，car序列构成包括cda信号肽，人源化的单链抗体scfv序列、cd137胞内区和cd3ζ胞内区。慢病毒表达质粒部分测序结果峰值图见图7，由图7可知，与参考序列进行比对，构建的hpdpnscfv-cd137-cd3ζ慢病毒表达载体中，插入的car序列准确无误。

测序用引物序列为：5'-gtggagactgaagttaggccagc-3'及5'-ccaagagcagcaggctctgc-3'。

将上述制备的car慢病毒表达载体lenti-ef1a-car使用限制性内切酶ecori和smai进行双酶切鉴定，鉴定结果参见图8，由图8可以看出car慢病毒表达载体经ecori和smai双酶切后，产生了两个较小的片段，证明该重组载体中正确的插入了目的序列。

实施例3慢病毒的包装、浓缩及滴度测定

生产hpdpnscfv-cd137-cd3ζ慢病毒，为制备重组car-t细胞做准备。

1.制备慢病毒

准备15cm细胞培养皿，接种5*10⁶个细胞/皿，加入完全培养基(dmem高糖、10％fbs)，置于37℃、5％co2培养箱，过夜培养。

从冰箱中取出pei及慢病毒包装质粒(car慢病毒表达载体和慢病毒包装辅助质粒)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出pbs或hbss缓冲液，温热至室温。取2mlpbs至6孔板的一个孔，分别加入10μglenti-ef1a-car、11μglenti-mix，移液枪上下吹打充分混匀后，加入26μl100μmpei，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

将上述dna/pei复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％co2培养箱，培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基，将培养皿重新放回培养箱中继续培养。

连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，配平后，50000×g4℃离心2小时浓缩。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μlpbs缓冲液将沉淀重悬，将浓缩后的病毒置于-80℃保存。

2.测定慢病毒滴度

从液氮中复苏ht1080细胞，并将细胞状态调整至对数生长期。

取一块新的24孔板，按照每孔50000个细胞的数据量接种ht1080细胞，补充培养基至终体积为500μl，将24孔板置于37℃、5％co2培养箱中，过夜培养。

将上述浓缩后的慢病毒按照10^-2、10^-1、1、10μl的量加入至上述24孔板中，同时添加终浓度为6μg/ml的聚凝胺

将24孔板重新放回37℃、5％co2培养箱中，连续培养96小时。培养结束后，使用pbs洗涤每孔的细胞，然后使用基因组dna提取试剂盒(lifetech，cat#k0512)提取基因组dna，并使用nanodrop2000测定所提取的基因组dna的浓度。

从冰箱中取出puc-wpre和puc-alb质粒，分别按照10倍稀释，准备荧光定量pcr所需的标准曲线样品。

按照表1所示的pcr反应体系，制备pcr反应预混液，所用引物的序列及荧光基团如表2所示，取96孔pcr反应板，按照每孔加入5μl基因组样品或标准曲线样品，然后向每孔加入15μl上述制备的pcr反应预混液，使用封膜密封后，短暂离心1分钟，根据表3所示pcr程序进行荧光定量pcr反应，pcr反应结束后，获得样品的ct值，以alb基因和wpre基因做为内参基因，并采用慢病毒滴度计算公式计算所获取的慢病毒滴度。

将alb基因的ct值和拷贝数的log值分别作为横纵坐标，绘制标准曲线(图9)；然后将wpre基因的ct值和拷贝数的log值分别作为横纵坐标，绘制标准曲线(图10)。

表1

表2

表3

使用浓缩后的慢病毒感染ht1080细胞后，提取细胞基因组dna进行qpcr实验，获得慢病毒滴度结果，如表4所示：

表4

由表4可见，从ht1080细胞基因组中可扩增出稳定整合至ht1080细胞基因组中的慢病毒序列。

根据病毒滴度公式计算慢病毒的滴度：

病毒滴度(tu/ml)＝((wpre拷贝数/alb拷贝数×2)×接种细胞数)/病毒体积

由表4和上述公式计算出的慢病毒滴度为6.07×10⁸tu/ml。

实施例4car-t细胞的获得

分离健康供体的外周血淋巴细胞，并进一步分离其中的t细胞进行重组car-t细胞的制备。

1.分离原代t细胞

1)将淋巴细胞分离液上下颠倒数次，充分混匀淋巴细胞分离液。

2)在生物安全柜中，向50ml离心管(或15ml离心管，视分离血样的体积而定)中加入15mllymphoprep试剂，备用。

3)将血样使用等体积的pbs+2％fbs进行稀释。

4)使用移液枪将稀释后的血样沿管壁缓慢添加至分离试剂的上层，避免分离试剂与血样的混合。

5)将离心机设置为800×g，转速下降速度设为最慢，室温离心20分钟(若血样贮存时间超过2小时，将离心时间延长至30分钟)。

6)离心结束后，收集上层浅黄色血清至另一个无菌离心管中，-80℃贮存。

7)将处于血清与分离试剂界面的单核细胞层吸至离心管中，使用培养基洗涤细胞一次。

8)将细胞密度调整至1×10⁸细胞/ml(总体积不超过2.5ml)，重悬于5ml的圆底管中。

9)加入100μl/ml的抗体cocktail，充分混匀后，室温孵育15分钟。

10)取出磁珠，用移液枪上下吹打至少5次，充分混匀。

11)吸取50μl磁珠/ml至上述样品中，充分混匀后，室温孵育10分钟。

12)添加完全培养基至管内总体积为2.5ml，将管子(开盖)插入磁极中，室温静置5分钟。

13)孵育完毕后，管子继续留在磁极中，轻轻倒置，将管内的原代t细胞倒出。

14)将原代t细胞重悬于x-vivo15培养基中，并添加10％fbs，300u/mlil-2，5ng/mlil-15和10ng/mlil-7。

2.原代t细胞的激活与慢病毒感染

原代t细胞处于未激活状态，较难使用慢病毒进行感染；通过激活处理后，更易于被慢病毒感染。

1)调整原代t细胞密度至1×10⁶细胞/ml，加入细胞因子及抗体复合物(终浓度为300u/ml的il-2、10ng/mlil-7、5ng/mlil-15、500ng/mlanti-cd3(okt3)、2μg/mlanti-cd28)，连续培养48小时。

2)按照moi＝20，计算所需要的病毒量，计算公式如下：

所需病毒量(ml)＝(moi*细胞数量)/病毒滴度

3)从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为6μg/ml的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800×g离心1小时。

4)离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃、5％co2的培养箱中，继续培养24小时。

5)250×g离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养3-6天，获得car-t细胞。

将获得的car-t细胞收集起来，与egfrt的抗体进行孵育半小时后，使用流式细胞仪检测egfrt的表达水平，结果如图11所示，其中，纵坐标为细胞数，横坐标为结合力的log对数值，由图11可知，制备的car-t细胞可以表达egfr，说明所制备的car-t细胞可以同时高表达car。

实施例5car-t细胞对靶细胞的裂解

通过建立car-t细胞与靶细胞的共培养体系，评估car-t细胞对靶细胞的杀伤作用。

1)调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代5次；

2)用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5×10⁵个/ml，取一块新的96孔板，按照100μl/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μl无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％co2、37℃培养箱中，过夜培养。

3)离心收集实施例4制备的car-t细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌pbs轻轻将细胞洗涤一遍，然后分别按照效靶比0.5：1、1：1、2：1、5：1、10：1，加入car-t细胞，并将最终体积补至100μl/孔；maxilysis和minilysis为接种同样数量的靶细胞，但是不加car-t细胞。将孔板置于5％co2、37℃培养箱中，培养6小时。

4)培养结束后，将孔板从培养箱中取出，向maxilysis孔加入ldh检测试剂盒中的裂解液，将其中的靶细胞完全裂解后，1200×g室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μl至另一个新的96孔板中，加入ldh检测试剂后，使用酶标仪读取

其中，公式中各参数的意义如下：

lysis％：car-t细胞对靶细胞的裂解百分数；

odeachwell：每个样品孔的od值；

odminilysis：背景对照孔的od值；

odmaxilysis：最大裂解对照孔的od值；

6)将上述处理后的靶细胞裂解数据使用graphpad6.0进行作图。

结果如图12所示，由图12可见，在靶效比为10：1时，对照未转染t细胞对靶细胞存在一定程度的非特异性杀伤作用，裂解率为20％，而本发明car-t细胞的靶细胞可特异性的识别并杀伤靶细胞，裂解率可达60％以上，裂解率增加了200％，因此，本发明的car-t细胞可以对靶细胞产生显著的杀伤作用，且随着效靶比的提高，杀伤作用更为明显。

实施例6检测car-t细胞分泌细胞因子白介素2和伽马干扰素的分泌水平，具体包括如下步骤：

1)调整靶细胞u87状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代5次。

2)用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5×10⁵个/ml，取96孔板，按照100μl/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μl无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％co2、37℃培养箱中，过夜培养。

3)离心收集实施例4制备的car-t细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌pbs轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照对应的效应细胞/靶细胞比例，即效靶比为1：1、5：1、10：1，加入car-t细胞，并将最终体积补至100μl/孔；将孔板置于5％co237℃培养箱中，培养6小时，同时设置对照t细胞组。

4)培养结束后，将孔板从培养箱中取出，1200×g室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μl培养基上清，使用elisakit检测il-2的表达，使用酶标仪读取od值，结果如图13-14所示。

由图13-14可见，与靶细胞共培养后，car-t细胞可产生大量的白介素2和伽马干扰素，并且，随着靶细胞量的提高，上述两种细胞因子的分泌表达水平显著升高，且与靶细胞的比例增加呈现剂量效应，而对照t细胞对靶细胞虽然存在一定程度的非特异性杀伤作用，但是，其细胞因子的分泌水平显著低于car-t细胞在受到靶细胞激活后所产生的细胞因子，且无明显的剂量效应。因此，本发明的重组car-t细胞分泌细胞因子白介素2和伽马干扰素的能力显著提高。

<110>上海神因生物科技有限公司

<120>一种靶向pdpn基因的人源嵌合抗原受体及其用途

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