一种豆豉纤溶酶及其培制方法与流程

本发明涉及一种豆豉纤溶酶，本发明还涉及一种豆豉纤溶酶的培制方法。

背景技术：

心血管疾病是一种常见的易致死疾病，约占全球死亡率29％，而血栓的形成是导致心血管疾病的主要原因之一，血栓的形成是一个很复杂的生理过程。血栓的主要成分是纤维蛋白，纤维蛋白在血管中的过度积累，就容易形成血栓。纤溶酶可以降解纤维蛋白，常见的纤溶酶药剂有尿激酶型(u-pa)、组织型(t-pa)、细菌型和链激酶型，虽然纤溶酶对治疗血栓具有显著疗效，但是，其本身也具有一定的缺陷，比如市场供不应求、价格太贵、降解纤维蛋白的专一性较差、造成体内出血、过敏等问题，因此寻找新的可替代资源成为研究热门。

近年来，各种从发酵食品中细菌产生的纤溶酶先后被报道，这些发酵食品包括日本纳豆，韩国的可食用的蜜香菇，印尼的天贝和中国的豆豉等，这些细菌型纤溶酶具有很高的纤溶酶活力，而且大多数都比较安全，副作用小，价格低廉，具有广阔的市场前景和医学价值。本申请人与2014年成功地从传统曲霉型豆豉发酵过程中筛选到一株具有优良溶栓性能的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株jxnuwx-1，已于2014年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctccm2014638，并于2015年5月15日向国家知识产权局提交了申请号为201510250195.x的发明专利申请，该发明专利申请已经公布。本

技术实现要素：
属于对该项目的继续研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种豆豉纤溶酶，该纤溶酶分子在适宜人体ph下溶栓性质稳定，不仅可以降解纤维蛋白和纤维蛋白原，而且可以作为纤溶酶原激活因子，能够降解凝血酶，而且对人体血液中的蛋白影响较小，制备成本也很低廉。

本发明的另外一个目的在于提供一种该纤溶酶的培制方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明的豆豉纤溶酶以一株来源于豆豉、保藏号为cctccm2014638、分类学命名为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)的菌株jxnuwx-1为培养菌种，经过发酵、分离和提纯制成豆豉纤溶酶产品。

本发明的豆豉纤溶酶具有以下酶学性质：该豆豉纤溶酶相对分子质量为29kda，最适温度和最适ph分别为41℃和7.6，该豆豉纤溶酶会被pmsf、sbti、edta、fe³⁺、fe²⁺所抑制，该豆豉纤溶酶能够快速降解纤维蛋白(原)的aα亚基，紧接着是bβ和cγ亚基，该豆豉纤溶酶既可以直接降解纤维蛋白(原)又可以作为纤溶酶原激活因子，同时该豆豉纤溶酶还能降解凝血酶。

上述豆豉纤溶酶的培制方法包括以下步骤：

(1)培养方法：

斜面培养→种子培养→液体发酵培养：将保存在斜面培养基的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株jxnuwx-1挑一菌环到种子培养基中，置于摇床中培养，培养条件是37℃、170r/min，培养时间为12h；然后再将种子培养基中的菌液以2％的接种量接种到发酵培养基中，摇床培养48h。其中，斜面培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，nacl0.5％，琼脂2％，ph为7.0；种子培养基：酵母提取物5％，胰蛋白胨1％，nacl1％，ph值为7.0；发酵培养基：蔗糖2％，蛋白胨2％，nacl0.1％，k2hpo4·3h2o0.1％，mgso4·7h2o0.05％，cacl20.1％，ph值为7.0。

(2)粗提纯豆豉纤溶酶：

将发酵液在温度为4℃条件下高速离心，离心条件为10000r/min，离心时间为10min，取上清液，该上清液为粗酶液，用65％w/v饱和度硫酸铵盐析沉淀，用ph为7.0的磷酸盐缓冲液悬浮，得到粗豆豉纤溶酶液。

(3)精提取豆豉纤溶酶：

采用现代色谱技术对步骤(2)中得到的粗豆豉纤溶酶液进行纯化，主要采取以下方法获得色谱纯的豆豉纤溶酶：

a、用透析袋进行透析除盐同时进行缓冲液交换，透析缓冲液为ph为8.5的tris-hcl缓冲液，浓度为20mm。

b、将脱盐后含有豆豉纤溶酶的溶液上deae-sepharoseff柱，使用含有0～0.5mol/lnacl的ph为8.5的tris-hcl缓冲液，浓度为20mm进行洗脱，收集有纤溶活性组分。

c、然后再用superdex75柱进行凝胶层析，用ph为7.0的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液含0.3mol/lnacl，收集有纤溶活性成分，得到色谱纯的豆豉纤溶酶。

本发明的有益效果：该豆豉纤溶酶分子在适宜人体的ph下溶栓性质稳定，不仅可以降解纤维蛋白和纤维蛋白原，而且可以作为纤溶酶原激活因子，能够降解凝血酶，而且对人体血液中的蛋白影响较小，这为抗血栓药物开发利用提供了新的路径。

附图说明

图1为利用人血纤维蛋白板法证明本发明产品豆豉纤溶酶溶解纤维蛋白的图片。

图2为sds-pgae测定纤溶酶对人血纤维蛋白原(1)和人血纤维蛋白(2)的降解机理图片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：制备液体发酵培养物

以解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株jxnuwx-1(保藏号为：cctccm2014638)为培养菌种，进行斜面培养、种子培养和液体发酵培养，发酵3天后得到液体发酵培养物。

其中，培养基及培养条件：

(1)斜面培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，nacl0.5％，琼脂2％，ph为7.0。培养基的灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。培养条件为37℃，培养时间为24h，然后于4℃保藏斜面。

(2)种子培养基：酵母提取物5％，胰蛋白胨1％，nacl1％，ph值为7.0。培养基的灭菌温度为115℃，灭菌时间为30min。培养条件为摇瓶培养，170r/min，12h，37℃。

(3)发酵培养基：蔗糖2％，蛋白胨2％，nacl0.1％，k2hpo4·3h2o0.1％，mgso4·7h2o0.05％，cacl20.1％，ph值为7.0。培养基的灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。培养条件为摇瓶培养，170r/min，72h，39℃，接种量为0.5％。

实施例2：豆豉纤溶酶的分离纯化

实施例1得到的液体发酵培养物经过65％的饱和度硫酸铵盐析沉淀，用ph为7.0的磷酸盐缓冲液悬浮，得到粗酶液后，再经过：

a、用透析袋进行透析除盐同时进行缓冲液交换，透析缓冲液为ph为8.5的tris-hcl缓冲液，浓度为20mm。

b、将脱盐后含有纤溶酶的溶液上deae-sepharoseff柱，使用0～0.5mol/lnacl的ph为8.5的tris-hcl缓冲液，浓度为20mm进行洗脱，收集有纤溶活性组分。

c、然后再用superdex75柱进行凝胶层析，用ph为7.0的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液含0.3mol/lnacl，收集有纤溶活性成分，得到豆豉纤溶酶。

实施例3：测定分离纯化后的豆豉纤溶酶的性质

采用sds-page法测定法得出实施例2得到的豆豉纤溶酶相对分子质量为29kda，最适温度和最适ph分别为41℃和7.6，该豆豉纤溶酶会被pmsf、sbti、edta、fe³⁺、fe²⁺所抑制，该豆豉纤溶酶能够快速降解纤维蛋白(原)的aα亚基，紧接着是bβ和cγ亚基，该豆豉纤溶酶既可以直接降解纤维蛋白(原)又可以作为纤溶酶原激活因子，同时该豆豉纤溶酶还能降解凝血酶。

实施例4：豆豉纤溶酶纤溶活性证明

采用人纤维蛋白板法检验实施例2得到的豆豉纤溶酶对纤维蛋白的溶解性。

(a)纤维蛋白板法

巴比妥钠-hcl缓冲液：先配100ml浓度为0.04mol/l巴比妥钠溶液，再将其与11.47ml浓度为0.2mol/lhcl溶液混合，用0.2mol/l的hcl调节缓冲液的ph至7.8左右。凝血酶溶液：将凝血酶溶解于无菌巴比妥钠-hcl缓冲液中，配制成20iu/ml，保存在4℃冰箱中。纤维蛋白溶液(2mg/ml)：将一支纤维蛋白原(100mg)溶解于50ml无菌巴比妥钠-hcl缓冲液中，现配现用。琼脂糖溶液：将0.6g琼脂糖溶于50ml巴比妥钠-hcl缓冲液中，加热溶解，保存在55℃水浴锅中备用。

取8ml纤维蛋白原溶液和在55℃事先预热的8ml琼脂糖溶液充分混合之后，加入0.6ml凝血酶溶液，立刻倒入90mm培养皿中静止放置1h，再用打孔器打孔，将豆豉纤溶酶液10μl加入孔中，于37℃孵育18h，该豆豉纤溶酶将纤维蛋白溶解，在平板凝胶表面形成肉眼可见的透明圈见图1。

(b)电泳法

纤维蛋白原(46μl的2％人血纤维蛋白原溶解在20mmtris-hcl缓冲液，调节ph到7.8)同时与纯化的纤溶酶(46μl2.3×10-3mg/ml)混合。37℃反应，在不同的时间间隔终止反应(1min、2min、3min、4min、15min、30min、1h和4h)将反应完成后的样本立即放在冰上，同时加入上样缓冲液，煮沸后，用sds-page法检测纤维蛋白原降解的条带。

纤维蛋白(46μl的2％人血纤维蛋白原溶解在20mmtris-hcl缓冲液，调节ph到7.8,)，同时与10μl的凝血酶(20iu/ml)，室温下保存1h，使其充分凝结，加入纯化的纤溶酶(46μl2.3×10-3mg/ml)混合。37℃反应，在不同的时间间隔终止反应(1min、2min、3min、4min、15min、30min、1h和4h)将反应完成后的样本立即放在冰上，重复纤维蛋白原的检测方法，对纤维蛋白链的降解进行测定。

由图2可知，通过sds-page分析可知，该豆豉纤溶酶展示出了降解纤维蛋白以及纤维蛋白原的降解机理。在该豆豉纤溶酶降解纤维蛋白原的过程中(1)，纤维蛋白原的aα链在1min之内最先先被降解，其次在第4min的时候bβ链被降解，在4h的酶反应后，纤维蛋白原的cγ被完全降解。该豆豉纤溶酶降解纤维蛋白的过程(2)与降解纤维蛋白原的过程类似，首先是纤维蛋白的aα链在1min之内被降解，1h后bβ链也被降解，在4h的酶反应后，纤维蛋白的cγ也被完全降解。