二芳香基亚甲基二硫醚类化合物及其制备方法与应用与流程

本发明涉及药物技术领域，尤其涉及二芳香基亚甲基二硫醚类化合物及其制备方法与应用。

背景技术：

“脑卒中”(cerebralstroke)又称“中风”、“脑血管意外”(cerebralvascularaccident，cva)。是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病。

在世界范围内，脑中风是全球排名第三的死因，也是导致成年人残疾的首要病因。据统计，美国每年有50～75万人发病。在中国，脑中风发病人数达250万/年，死亡人数达160万/年。脑卒中已超过心肌梗塞，成为国人死亡的首要病因。脑中风不仅致死率高，而且存活的患者也会留下神经行为功能损伤和认知障碍等后遗症，造成沉重的社会和家庭经济负担，具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点。

脑中风主要分为两种类型。70％以上为缺血性脑中风，其是指各种血栓在不同脑区引起脑血管堵塞，从而造成缺血性脑损伤，其中最常见的为大脑中动脉堵塞。颈内动脉和椎动脉闭塞和狭窄可引起缺血性脑卒中，年龄多在40岁以上，男性较女性多，严重者可引起死亡。另外不到30％是由脑血管破裂导致的脑出血，最终也造成脑供血不足及缺血性脑损伤。脑缺血也是心脏骤停导致的后果之一。

与脑中风的严重性和危害程度相比，目前脑中风的治疗药物还非常有限。现在临床上的药物治疗主要有溶栓药、扩血管药、抗血小板聚集药以及神经保护剂。例如，对于缺血性脑中风，国际公认的唯一药物治疗手段是以组织纤溶酶原激活物急性期溶栓。但由于组织纤溶酶原激活物的治疗窗短且副作用显著(如导致脑出血及加剧兴奋性神经毒性等)，目前能以组织纤溶酶原激活物治疗的脑缺血患者不到患者总数的5％。现有研究还表明，脑卒中可引起脑内一系列细胞和分子应答机制，这些机制交织在一起最终导致脑损伤。例如，缺血性脑卒中导致的神经元死亡或损伤的机制主要有过度活性氧自由基产生的神经毒性、过量兴奋性氨基酸如谷氨酸释放导致的神经元损伤机制、多聚adp核糖聚合酶过度激活导致的神经元死亡以及脑缺血引起的脑内过度炎症应答而导致的神经炎症损伤机制。这些病理损伤机制对脑中风治疗药物的研制和开发具有重要意义，而寻找针对同时具有多种病理损伤机制相应的药物已成为研发新型脑卒中治疗药物的重要策略。

综上，鉴于脑卒中危害大，而当前治疗手段又极其有限，因而研发新型的脑卒中预防和/或治疗药物一直是本领域前沿学者广泛关注的焦点，具有重要意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供二芳香基亚甲基二硫醚类化合物及其制备方法与应用。本发明提供的化合物不但能够在神经细胞模型具有更好抑制过量谷氨酸导致的神经毒性作用和清除过量自由基作用，具有抑制血小板聚集作用，而且具有对脑缺血再灌注损伤的小鼠大脑具有很好的保护作用，因而在针对脑卒中具有预防或治疗作用。

本发明提供了式i所示结构化合物：

其中，ar为3,5,6-trimethylpyrazinyl或4-cooch3-ph。

本发明提供的化合物为1,2-二[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基]二硫醚或4,4'-二硫烷二基双(亚甲基)二苯甲酸甲酯。这两种化合物的结构在此前并未公开，本发明制备得到这两种化合物，并验证它们能够通过多种途径实现对脑卒中的预防或治疗作用。

本发明所述式i所示结构化合物在制备保护神经元细胞的制剂中的应用；

其中，ar为3,5,6-trimethylpyrazinyl、ph、4-cooch3-ph、2-brph、3-brph、4-brph、3-fph、4-fph、2-no2ph、3-no2ph、4-no2ph、4-clph、4-ch3ph或4-cnph。

所述对神经元细胞的保护作用包括对谷氨酸导致的神经毒性的保护作用或对过氧化氢导致的神经毒性的保护作用。所述神经元细胞为小鼠海马神经元ht-22细胞。所述保护具体指：保护谷氨酸诱导损伤ht22细胞，或保护h2o2诱导损伤ht22细胞，说明式i化合物具有减少兴奋性氨基酸毒性和清除h2o2产生的自由基作用。其中，1,2-二[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基]二硫醚的效果抗谷氨酸毒性作用最佳，与谷氨酸组相比，其细胞存活率显著性增加。

式i所示结构化合物在制备抑制血小板聚集的制剂中的应用；

其中，ar为3,5,6-trimethylpyrazinyl、ph、4-cooch3-ph、2-brph、3-brph、4-brph、3-fph、4-fph、2-no2ph、3-no2ph、4-no2ph、4-clph、4-ch3ph或4-cnph。

本发明实验表明，本发明提供的化合物能够显著降低血小板的最大聚集率，具体的，加入0.1、0.5、1mm的1,2-二[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基]二硫醚，血小板最大聚集率显著下降(p<0.05，p<0.01)，提示1,2-二[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基]二硫醚具有很好的抗血小板聚集活性。

式i所示结构化合物在制备防治脑缺血再灌注后脑损伤的制剂中的应用；

其中，ar为3,5,6-trimethylpyrazinyl、ph、4-cooch3-ph、2-brph、3-brph、4-brph、3-fph、4-fph、2-no2ph、3-no2ph、4-no2ph、4-clph、4-ch3ph或4-cnph。

所述防治脑缺血再灌注后脑损伤具体包括降低皮层、纹状体及大脑半球梗死体积。实验表明，在大脑中动脉堵塞24小时后，与溶剂组小鼠相比，再灌注3小时注射的1,2-二[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基]二硫醚能够显著降低皮层、纹状体及大脑半球梗死体积，表明1,2-二[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基]二硫醚对大脑中动脉堵塞造成的缺血脑损伤有显著的保护作用。

除1,2-二[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基]二硫醚或4,4'-二硫烷二基双(亚甲基)二苯甲酸甲酯外，本发明还发现，其他二芳香基亚甲基二硫醚类化合物也具有防治脑卒中的作用。其作用机理为抑制过量谷氨酸导致的神经毒性。

式i所示结构化合物在制备防治脑卒中的制剂中的应用；

其中，ar为3,5,6-trimethylpyrazinyl、ph、4-cooch3-ph、2-brph、3-brph、4-brph、3-fph、4-fph、2-no2ph、3-no2ph、4-no2ph、4-clph、4-ch3ph或4-cnph。

本发明中，脑卒中为由脑血管栓塞导致的脑卒中和/或脑出血导致的脑卒中。

优选的，所述脑卒中包括脑血栓、脑栓塞、脑梗塞、短暂性脑缺血发作、心脏骤停导致脑缺血、脑溢血和脑动脉硬化中的一种或多种导致的脑卒中。

本发明中，所述式i化合物的剂量为0.05mg/kg～90mg/kg。

优选的，式i化合物为1,2-二[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基]二硫醚。

一种药物，其特征在于，包括式i化合物和药学上可接受的辅料；

其中，ar为3,5,6-trimethylpyrazinyl、ph、4-cooch3-ph、2-brph、3-brph、4-brph、3-fph、4-fph、2-no2ph、3-no2ph、4-no2ph、4-clph、4-ch3ph或4-cnph。

优选的，所述制剂的剂型为口服制剂、注射剂、栓剂、吸入剂或可直接应用于脑缺血部位的剂型。

优选的，所述制剂的剂型为胶囊、微囊、片剂、颗粒剂、丸剂、分散粉末、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、糖浆剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂、脂质体、口服液、静脉注射液或肌肉注射液。

本发明所述式i所示结构化合物的制备方法为：将化合物a与硫脲在二氧化锰和peg存在条件下反应，制得式i化合物；

其中，ar为3,5,6-trimethylpyrazinyl、ph、4-cooch3-ph、2-brph、3-brph、4-brph、3-fph、4-fph、2-no2ph、3-no2ph、4-no2ph、4-clph、4-ch3ph或4-cnph；

所述化合物a为1-溴代川芎嗪、苄溴、4-(溴甲基)苯甲酸甲酯、2-溴苄溴、3-溴苄溴、4-溴苄溴、3-氟苄溴、4-氟苄溴、2-硝基苄溴、3-硝基苄溴、4-硝基苄溴、4-氯苄溴、4-甲基苄溴或4-氰基苄溴。

所述反应在碱性条件下进行。本发明采用碳酸钠条件获得碱性环境。

所述化合物a与硫脲的摩尔比为0.97:1.45。

所述碳酸钠与硫脲的摩尔比为1:1。

所述二氧化锰与化合物a的摩尔比为1:1。

所述peg为peg200；优选为wet-peg200；具体的，所述wet-peg200中，peg200与h2o的体积比为10:1。

所述反应温度为40℃，搅拌反应3h。

制得式i化合物后，还包括纯化的步骤。具体的，纯化包括：反应产物以乙酸乙酯萃取，萃取液经水洗涤后，干燥、抽滤、柱层析(洗脱剂[石油醚：乙酸乙酯(v:v)＝10:1])获得式i化合物。

本发明提供了二芳香基亚甲基二硫醚类化合物，并研究表明这些化合物能够通过多种途径起到防止脑卒中的作用。实验结果，本发明提供的二芳香基亚甲基二硫醚类化合物，在细胞模型上具有抑制过量谷氨酸导致的神经毒性的作用；还具有抑制过氧化氢导致的神经毒性的作用；抗血小板聚集的作用；以及在小鼠mcao模型中能减少脑梗死面积的作用。这些结果表明本发明提供的这类二芳香基亚甲基二硫醚类化合物可针对脑卒中多种病理机制具有预防和/或治疗的作用。

附图说明

图1-a示lyy-i1对谷氨酸诱导损伤的小鼠海马神经元细胞存活率的影响；图1-b示川芎嗪对谷氨酸诱导损伤的小鼠海马神经元细胞存活率的影响；其中**示与谷氨酸组相比存在极显著差异，p<0.01；

图2-a示lyy-i1对过氧化氢诱导损伤的小鼠海马神经元细胞存活率的影响；图2-b示川芎嗪对过氧化氢诱导损伤的小鼠海马神经元细胞存活率的影响；其中**示与过氧化氢组相比存在极显著差异，p<0.01；

图3示lyy-i1对血小板聚集率的影响；其中：*示与adp组相比存在显著性差异，p<0.05；**示与adp组相比存在极显著差异，p<0.01；

图4示在小鼠mcao模型中再灌注3h后腹腔给药0.22mmol/kglyy-i1的脑梗死体积百分率，其中*示与溶剂组相比存在显著性差异，p<0.05；**示与溶剂组相比存在极显著差异，p<0.01。

具体实施方式

本发明提供了二芳香基亚甲基二硫醚类化合物及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例11,2-二[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基]二硫醚(lyy-ι1)

1-溴代川芎嗪(0.210g，0.97mmol)、硫脲(0.111g,1.45mmol)、碳酸钠(0.154g、1.45mmol)、二氧化锰(0.084g，0.97mmol)加到100ml反应瓶中，再加入wet-peg200(20ml)(peg200：h2o＝10:1)，加热到40℃，搅拌反应3h。冷却至室温，加入水(20ml)，乙酸乙酯(20ml)萃取三次，水(50ml)洗涤三次，无水硫酸镁干燥，抽滤，柱层析[洗脱剂石油醚：乙酸乙酯(v:v)＝10:1]，得黄色固体。产率45％。mp:73～75℃。

¹hnmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):3.99(s,4h,ch2),2.54(s,6h,ch3),2.49(s,12h,ch3).

¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):150.17,148.94,148.64,146.61,42.67,21.62,21.40,21.09.

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实施例21,2-二苄基二硫醚(lyy-ι2)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由苄溴与硫脲制备，得白色固体。产率57％。mp:64～68℃。

¹hnmr(400mhz,cdcl3,δ(ppm):7.35-7.32(m,2h,arh),7.32-7.28(m,4h,arh),7.24(dd,j＝5.8,4.3hz,4h,arh),3.60(s,4h,ch2).

¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):137.60,129.65,128.72,127.66,43.03.

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实施例34,4'-二硫烷二基双(亚甲基)二苯甲酸甲酯(lyy-ι3)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由4-(溴甲基)苯甲酸甲酯与硫脲制备，得白色固体。产率51％。mp:81～85℃。

1hnmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):8.01–7.97(m,4h,arh),7.28(d,j＝8.3hz,4h,arh),3.92(s,6h,och3),3.62(s,4h,ch2).

13c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):166.80,142.61,129.86,129.41,129.35,52.21,42.91.

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实施例41,2-二(2-溴苄基)二硫醚(lyy-ι4)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由2-溴苄溴与硫脲制备，得白色固体。产率36％。mp:93～96℃。

¹hnmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):7.56(d,j＝7.8hz,2h,arh),7.29-7.26(m,4h,arh),7.16-7.11(m,2h,arh),3.80(s,4h,ch2).

¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):136.66,133.06,131.63,129.11,127.35,124.56,43.74.

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实施例51,2-二(3-溴苄基)二硫醚(lyy-ι5)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由3-溴苄溴与硫脲制备，得淡黄色固体。产率41％。mp:57～60℃。

¹hnmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):7.44-7.39(m,2h,arh),7.38(dd,j＝7.7,1.8hz,2h,arh),7.23-7.17(m,2h,arh),7.17-7.13(m,2h,arh),3.55(s,4h,ch2).

¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):139.53,132.32,130.57,130.07,127.98,122.43,42.54.

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实施例61,2-二(4-溴苄基)二硫醚(lyy-ι6)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由4-溴苄溴与硫脲制备，得白色固体。产率33％。mp:91～95℃。

¹hnmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):7.45(d,j＝8.2hz,4h,arh),7.09(d,j＝8.3hz,4h,arh),3.56(s,4h,ch2).

¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):136.30,131.62,130.99,121.47,42.53.

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实施例71,2-二(3-氟苄基)二硫醚(lyy-ι7)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由3-氟苄溴与硫脲制备，得黄色液体。产率37％。

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实施例81,2-二(4-氟苄基)二硫醚(lyy-ι8)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由4-氟苄溴与硫脲制备，得白色固体。产率28％。mp:67～71℃。

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¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):163.02,133.09,130.86,115.30,42.40.

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实施例91,2-二(2-硝基苄基)二硫醚(lyy-ι9)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由2-硝基苄溴与硫脲制备，得白色固体。产率21％。mp:108～111℃。

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实施例101,2-二(3-硝基苄基)二硫醚(lyy-ι10)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由3-硝基苄溴与硫脲制备，得白色固体。产率47％。mp:97～101℃。

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实施例111,2-二(4-硝基苄基)二硫醚(lyy-ι11)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由4-硝基苄溴与硫脲制备，得白色固体。产率24％。mp:141～145℃。

¹hnmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):8.19(d,j＝8.6hz,4h,arh),7.43(dd,j＝12.9,6.3hz,4h,arh),3.68(s,4h,ch2).

¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):129.71,129.63,123.85,123.74,35.18.

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实施例121,2-二(4-氯苄基)二硫醚(lyy-ι12)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由4-氯苄溴与硫脲制备，得白色固体。产率29％。mp:33～40℃。

¹hnmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):7.27(t,j＝7.9hz,4h,arh),7.19(d,j＝8.3hz,4h,arh),3.54(s,4h,ch2).

¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):136.34,130.63,130.25,128.62,34.84.

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实施例131,2-二(4-甲基苄基)二硫醚(lyy-ι13)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由4-甲基苄溴与硫脲制备，得白色固体。产率34％。mp:52～55℃。

¹hnmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):7.14-7.12(m,4h,arh),7.12-7.10(m,4h,arh),3.60(s,4h,ch2),2.33(s,6h,ch3).

¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):137.11,134.28,129.28,129.15,43.04,21.16.

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实施例141,2-二(4-氰基苄基)二硫醚(lyy-ι14)

参照化合物lyy-ι1的合成方法由4-氰基苄溴与硫脲制备，得黄色固体。产率34％。mp:136～139℃。

¹hnmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):7.63(d,j＝8.2hz,4h,arh),7.33(d,j＝8.2hz,4h,arh),3.64(s,4h,ch2).

¹³c-nmr(600mhz,cdcl3),δ(ppm):142.65,132.31,129.96,118.51,111.45,42.58.

hr-ms:[m+h]⁺,calcd:297.0520,found:297.0513.

实施例152,2-[(3-羟基-4-羟甲基-2-甲基-5-吡啶基)-甲基]二硫化物(lyy-i15)

吡硫醇盐酸盐(0.200g，0.5mmol)溶于水中，滴加饱和碳酸钠水溶液，析出白色固体，产率70％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):δ8.35(s,2h,oh),7.70(s,2h,arh),4.76(s,4h,och2),3.83(s,4h,ch2),2.34(s,6h,ch3).

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实施例16lyy-i类化合物对谷氨酸诱导损伤的小鼠海马神经元ht-22细胞系的保护作用

试验方法参照文献[chengj,etal.neurochemistryinternational,2013,62(8):1072–1078.]。

样品用dmso溶解。试验分为空白对照组、谷氨酸组、样品组。谷氨酸组加入5mm的谷氨酸；样品组同时加入5mm的谷氨酸和终浓度分别为1、5、10、50、100μm的lyy-i1-15或川芎嗪；空白对照组加入同体积的dmso。加药24小时后，以mtt法检测存活细胞。每组进行三次平行试验，结果见表1。

表1lyy-i类化合物对谷氨酸诱导损伤ht22细胞存活率的影响

**示与谷氨酸组相比，存在显著性差异，p<0.01

5mm谷氨酸可诱导ht22细胞损伤，存活率<30％。由表1结果可见，终浓度为1～100μm的实施例1～15合成的化合物可显著地提高谷氨酸导致的ht22细胞存活率(p<0.05,p<0.01)，减少神经细胞损伤。其有效保护浓度范围10～100μm，检测到最低有效保护浓度为10μm。其中lyy-i1对谷氨酸诱导损伤ht22细胞的保护作用最强，在10～100μm时细胞存活率达到91.77～95.40％，与其他化合物相比存在显著性差异(p<0.01)；但是同样浓度下川芎嗪没有抗谷氨酸毒性的作用，见图1。

实施例17lyy-i1对过氧化氢诱导损伤的小鼠海马神经元ht-22细胞系的保护作用

试验方法参照文献[chenz,etal.cancerletters,2013,336(2):281-289.]。

试验分为空白对照组、过氧化氢组和样品组。过氧化氢组加入100μm的过氧化氢处理；样品组同时加入100μm的过氧化氢和终浓度分别为1、5、10、50、100μm的lyy-i1或川芎嗪；对照组加入同体积的dmso。加药24小时后，以mtt法检测存活细胞。每组重复三次，实验结果见图2。

由图2显示，在h2o2组，ht-22细胞的存活率位15.23％，说明100μmh2o2造成了ht-22细胞的损伤。经50、100μm的lyy-i1处理，ht-22细胞的存活率显著下降(p<0.01)，说明lyy-i1具有清除h2o2产生的自由基作用，对h2o2损伤的ht-22细胞具有良好保护作用。然而同样浓度下川芎嗪没有清除h2o2自由基作用。

实施例18lyy-i1对adp诱导大鼠血小板聚集的拮抗作用

实验方法参照文献[pauljurasz,etal.plosone,2013；8(3):e59281.]。

试验分为adp(腺苷二磷酸)组，lyy-i1组(加adp和0.1、0.5、1mmlyy-i1)，川芎嗪组(加adp和0.1、0.5、1mm川芎嗪)，各组均设3个平行管。血小板取自sd大鼠。在血小板聚集仪上测定各组的最大聚集率(pagm)。

由图3显示，adp组血小板最大聚集率为78.77％。当加入0.1、0.5、1mmlyy-i1处理时，血小板最大聚集率显著下降(p<0.05，p<0.01)，提示lyy-i1具有很好的抗血小板聚集活性。然而同样浓度下川芎嗪没有抗血小板聚集作用。

实施例19lyy-i1在小鼠大脑中动脉堵塞模型中的脑保护作用

icr小鼠，雄性，体重30±2.0g，购自中科院上海实验动物中心。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)(sigma)。

试验在小鼠大脑中动脉堵塞(mcao)模型进行，分为lyy-i1组和溶剂对照组。每组8只小鼠。溶剂组注射含25％dmso的玉米油。lyy-i1组在缺血再灌注3h后，腹腔给药本发明制作的0.22mmol/kglyy-i1。缺血再灌注24h后处死小鼠，以ttc染色法测定脑梗死区域大小。图4为mcao中再灌注24h后小鼠脑梗死体积百分率。由图4结果可见在大脑中动脉堵塞24h后，与溶剂组小鼠相比，小鼠缺血再灌注3h后注射lyy-i1显著降低皮层、纹状体及大脑半球梗死体积，表明lyy-i1对大脑中动脉堵塞造成的缺血脑损伤有显著的保护作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。