一种MYLK4基因辅助检测牛生长性状的方法及其专用试剂盒与流程

本发明属于分子遗传学领域，涉及黄牛基因单核苷酸多态性(snp)作为分子遗传标记的筛选与检测，特别涉及一种检测黄牛mylk4基因单核苷酸多态性的方法及应用。

背景技术：

所谓分子遗传标记，也就是dna水平上遗传多态性的标记，它可以直接反映dna序列上的遗传变异。因为其来源为dna序列的差异，所以又叫分子标记，其在生物群体中具有遗传多样性高、稳定性强且受环境影响小的特点。分子标记辅助选择育种是现代动物分子育种的一项主要研究内容，其直接在dna水平上对性状的基因型进行选择，因此其选种的准确性大大提高，克服了传统动物育种方法的缺陷。

单核苷酸多态性(snp)是一种重要的分子遗传标记，主要是指由于dna序列中某个核苷酸的改变而引起的基因组水平上的序列多态性，形式主要为单个核苷酸的转换及颠换。snp同其它分子标记相比，有覆盖基因组范围大、密度高、分辨率高、遗传稳定和易实现分析自动化等优点。因此被广泛地应用于生物学、植物学、医学、动物育种、生物进化等研究领域。

自从botestein等第一次提出了dna限制性片段长度多态性的相关概念后，pcr-rflp法就在snp的检测中被大量使用。应用此方法的前提是snp的位点必须含有合适的限制性内切酶识别的位点。利用限制性内切酶对目的片段进行切割，然后进行凝胶电泳分析，就能准确的鉴别snp位点的基因型，是最经典的方法之一。

肌球蛋白(myosin)是构成肌肉的重要蛋白，它是由两条重链(heavychain)，两条必需轻链(essentiallightchain)和两条调节轻链(regulatorylightchain，rlc)组成的六聚体。肌球蛋白具有atp酶活性，与atp结合后能够使其构象发生改变从而驱使肌丝滑动，引起肌肉的收缩。而肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase，mylk)能够使肌球蛋白调节轻链(rlc)磷酸化，从而激活或调节肌球蛋白atp酶活性。研究表明，mylk与细胞骨架改变有关，进而可能调节细胞的运动、分泌活动、上皮细胞通透性改变和血小板形态的改变；它还能促进轴突生长锥的伸长和细胞张力纤维的发生，进而影响胞质分裂和细胞的凋亡、修复。在生命活动和生长发育过程中发挥着重要作用。

而mylk4是mylk家族成员之一，它是一种ca2+/cam非依赖性的组成型活性激酶。研究发现它可能是心肌细胞中rlc磷酸化的重要贡献者。目前，国内外对mylk4基因多态性的研究主要集中于其与心血管疾病、肿瘤等的关联性研究，而对于家畜mylk4基因单核苷酸多态性的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种mylk4基因辅助检测牛生长性状的方法及其专用试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种黄牛mylk4基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

以黄牛基因组dna为模板，以引物对p为引物，pcr扩增黄牛mylk4基因部分片段，将pcr扩增产物经限制性内切酶hhai消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定黄牛mylk4基因第61595位单核苷酸多态性位点的基因型；

所述引物对p的序列为：

上游引物f：5’-cggacacttgttctcaatcggc-3’

下游引物r：5’-gtggtctaggaatctgggtg-3’。

所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸25s，共36个循环；72℃延伸5min。

所述琼脂糖凝胶电泳使用的是质量浓度3％的琼脂糖凝胶。

所述黄牛mylk4基因第61595位单核苷酸多态性位点的基因型的电泳结果为：aa基因型表现为208bp一条条带；ag基因型表现为208bp、185bp和23bp三条条带；gg基因型表现为185bp和23bp两条条带。

上述黄牛mylk4基因单核苷酸多态性的检测方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

上述黄牛mylk4基因单核苷酸多态性的检测方法在辅助检测黄牛生长性状中的应用。

所述生长性状选自体高或体斜长。

所述黄牛选自秦川牛、皮南牛、夏南牛、南阳牛或柴达木黄牛。

一种mylk4基因辅助检测牛生长性状的专用试剂盒，包括用于进行基于pcr-rflp法的mylk4基因第61595位单核苷酸多态性位点分型的引物对p(序列如上所述)。

本发明的有益效果体现在：

针对上述第61595位的突变，本发明公开了检测方法，通过设计特定的引物，pcr扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶酶切鉴定，解决了传统的pcr-sscp方法的繁琐和不稳定，能够简单、快速、低成本、精确度高的鉴定基因的单核苷酸多态性。

本发明对突变位点的基因型进行了检测和基因频率分析，并将该位点与五个黄牛品种的生长性状进行关联分析。结果表明黄牛mylk4基因第61595位为g或a的单核苷酸多态性，可作为分子遗传辅助育种的标记，从而为黄牛的分子标记辅助选择育种提供基础资料，加快中国黄牛的种质资源改良工作。

附图说明

图1为黄牛mylk4基因第61595位(ac_000180.1：g61595a)的测序图：框出位置表示该位点。

图2为黄牛mylk4基因pcr扩增的208bp片段的电泳图。

图3为黄牛mylk4基因第61595位不同基因型pcr产物经hhai酶切后电泳结果：m为markeⅰ，分别为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细的说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

本发明根据黄牛mylk4基因序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组dna池为模板，进行pcr扩增，产物测序得到黄牛mylk4基因的部分序列。与ncbi上公布的参考序列比对，发现在黄牛mylk4基因第61595位存在a>g的突变，利用pcr-rflp方法对该突变进行检测。将黄牛mylk4基因单核苷酸多态性与黄牛生长性状关联分析，证明其可为黄牛分子育种提供依据。

一、黄牛mylk4基因部分序列的克隆及其多态性检测

1.样本采集及基因组dna提取

(1)血样的采集

本发明采用了5个黄牛品种，共计535体作为检测对象，血液的采集方法为颈静脉采血。血样的采集地区，以及各品种的数据资料情况如表1所示。

表1.实验动物情况

(2)血样基因组dna的提取

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μl血液于1.5ml离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(pbs)混匀，温和摇动，4℃，12000rpm离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明。

②在离心管中加入dna抽提缓冲液500μl，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶k至3μl(20mg/ml)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加1μl蛋白酶k混匀继续消化直至澄清。

④取出样品加入200μl的6mol/lnacl，口底摇动15次使其充分混匀，在4℃下12000rpm离心10min，取上清液至2.0ml离心管中。

⑤加tris-饱和酚1ml，放置冰上温和摇动20min，使其充分混匀；4℃，12000rpm离心10min，将上层水相用移液器转入另一灭菌2.0ml离心管中。

⑥加入0.5ml的tris-饱和酚和0.5ml的氯仿，在冰上温和摇动20min；4℃，12000rpm离心10min；将上层水相用移液器移到另一灭菌2.0ml离心管中。

⑦加入1ml的氯仿，放置冰上温和摇动20min；4℃，12000rpm离心10min；将上层水相用移液器移到另一灭菌1.5ml离心管中。

⑧加入1ml预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻口底摇晃多次至dna析出，然后-20℃放置30min；取出后，4℃，12000rpm离心10min，弃去乙醇。

⑨加入70％乙醇1ml，温和摇动10min；然后4℃，12000rpm离心10min，弃去乙醇，重复漂洗一次(用移液器将管底剩余酒精吸出)。

⑩室温下敞口放置15min，之后放入60℃烘箱30s使乙醇挥发干净；加入超纯水50μl，4℃保存至dna完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。

(3)dna池的构建

用紫外光分光光度计测定dna样品在260nm、280nm处的od值以及其dna含量。如果od260/od280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除rna纯化。dna检测完毕后，取出一定的量稀释至10ng/μl，然后从5个黄牛群体中随机选择30个稀释后的样品，每个样品取2.5μl混合均匀构建dna池。

2.扩增引物设计

以ncbi所公布的牛mylk4基因序列(ac_000180.1)为参考，利用oligo7.0软件设计能够扩增包含黄牛mylk4基因第10内含子区域的pcr引物，其引物序列如下：

上游引物10f:5’-attccgagtggcttttctca-3’(seq.id.no.1，20nt)

下游引物10r:5’-cataggatggtggtctagga-3’(seq.id.no.2，20nt)

3.pcr扩增

(1)pcr反应体系如表2所示。

表2.pcr反应体系

(2)pcr反应程序如表3所示。

表3.pcr反应程序

4.pcr产物测序

将用以上混合的dna池为模板扩增的pcr产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。对黄牛mylk4基因目的片段测序结果与参考序列进行比对，发现在第10内含子区域存在一个a>g的突变(图1，ac_000180.1：g61595a)，但不能形成任何酶切位点。故采用引物错配的方法引入突变碱基从而构成酶切位点。

5.黄牛mylk4基因pcr-rflp分析中引入酶切位点的引物p的设计

dna池扩增测序后，发现该位点(mylk4基因参考序列第61595位)的突变没有合适的酶切位点，从而人为构建了一个hhai的酶切位点，从而可以使用pcr-rflp方法进行基因型的判定，构建的引物对p如下(设计完成时间2016年10月)。

上游引物f：5’-cggacacttgttctcaatcggc-3’(seq.id.no.3,22nt)

下游引物r：5’-gtggtctaggaatctgggtg-3’(seq.id.no.4,20nt)

其中上游引物3’端起第2位引入错配碱基，即带下划线的碱基。

6.pcr产物酶切及rflp检测

pcr反应体系：参考表2，以个体单独血样提取的基因组dna为模板。

pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸25s，共计36个循环；72℃延伸5min。

pcr扩增结果产物如图2所示，扩增片段大小约为208bp。

对于pcr扩增产物首先分别进行限制性内切酶hhai酶切，然后根据电泳结果判定其snp多态性。12.5μl的hhai酶切体系为：10μlpcr产物，10×buffertango1.25μl，hhai(10u/μl)0.3μl，0.95μl灭菌双蒸水。混合样品37℃恒温培养箱中消化12～16h，3％的琼脂糖凝胶于110v、55ma及室温条件下电泳40min，用bio-rad凝胶成像仪成像。根据电泳条带的图像，判断基因型(图3)。由于引物对p的扩增产物不含其它的hhai酶切位点，因此，含“g”的pcr扩增产物片段会被切成185bp和23bp两个片段；含“a”的pcr产物不能被hhai所识别，故仍为一个208bp片段。因此，aa基因型电泳结果表现为208bp一条条带；ag基因型表现为208bp、185bp和23bp三条条带，gg基因型表现为185bp和23bp两条条带。但由于23bp太短而在电泳图中看不见，故在实际的电泳分析中，最多只能观察到两条带，但不影响分型。

二、黄牛mylk4基因snp位点的频率统计及其与生长性状的关联分析

1.基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。计算公式如下：

pbb＝nbb/n

其中pbb代表某一位点的bb基因型频率；nbb表示群体中具有bb基因型的个体数；n为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式可写成：

pb＝(2nbb+nbb1+nbb2+nbb3+nbb4+……+nbbn)/2n

式中，pb表示等位基因b频率，nbb表示群体中具有bb基因型的个体数量，nbbi表示群体中具有bbi基因型个体数量，b1～bn为等位基因b的n个互不相同的复等位基因。

各黄牛品种中的基因频率与基因型频率的统计结果如下表4所示。

表4.5个黄牛品种中mylk4基因的基因型和等位基因频率

2.相关分析统计模型

利用spss(18.0)软件分析基因位点与生长性状的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用t分析、方差分析或是多元线性模型分析基因型效应。在数据处理中，根据影响体尺和体重等生长发育指标的因素不同，考虑到环境效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整的模型如下：

yijk＝μ+gj+eijk

其中：yijk为个体表型记录；μ为群体均值；gj为各位点的基因型效应；eijk为随机误差。

利用上述方法对各黄牛品种群体相关数据进行统计，南阳牛相关数据统计结果如表5。

表5.南阳牛mylk4基因不同基因型与生长性状的关联性分析

注：字母不同表示差异显著(p<0.05)。

结果表明，在黄牛mylk4基因序列的第61595位单核苷酸多态位点上的不同基因型与南阳牛体尺和体重等生长发育指标关联分析表明：6月龄时，该突变位点对体斜长影响显著，且ag型显著高于aa型；12月龄时，该突变位点对体高影响极显著，且gg型和ag型体高显著高于aa型，而ag和gg型的体斜长也显著大于aa型。这都说明等位基因g与南阳牛的生长性状体高和体斜长密切相关，最终确定g等位基因可作为黄牛体高和体斜长早期选择的分子育种基因标记。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种mylk4基因辅助检测牛生长性状的方法及其专用试剂盒

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工合成()

<400>1

attccgagtggcttttctca20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工合成()

<400>2

cataggatggtggtctagga20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工合成()

<400>3

cggacacttgttctcaatcggc22

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工合成()

<400>4

gtggtctaggaatctgggtg20