内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法与流程

本发明涉及一种内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法，属于动物模型及其应用领域。

背景技术：

趋化因子受体ccr5(chemokinereceptor5)是一类g蛋白7次跨膜受体，分子量约为40.6kda，由352个氨基酸残基组成，结构上可分为：胞外n末端、3个胞外环(extracellularloop)区域(ecl1、ecl2、ecl3)、3个胞内环区域、7个跨膜α螺旋和胞内c末端(szpakowskam,perezbercoffd,chevignea.closingthering:afourthextracellularloopinchemokinereceptors.sciencesignaling,2014,7(341):pe21.)，主要表达在单核细胞和某些t细胞亚群。ccr5的配体主要为趋化因子ccl3(chemokinec-cmotifligand3)、ccl4(chemokinec-cmotifligand4)和ccl5(chemokinec-cmotifligand5)。ccr5作为一种g蛋白偶联受体，通过胞外环与配体结合后，使g蛋白上α亚基与β、γ亚基分离，变为激活状态，激活下游信号通路，参与机体生理与病理调节过程如刺激淋巴细胞增生，调节巨噬细胞侵润和mi/m2型极化等。高糖条件下，ccr5在单核/巨噬细胞中表达明显升高，高浓度水平的ccr5可促进巨噬细胞侵润，加重机体炎症反应。长期以来，ccr5一直被看作是调控巨噬细胞迁移、加重糖尿病微血管损伤的重要因子。然而我们前期研究发现：ccr5基因功能性缺失会导致糖尿病患者微血管并发症发病风险增加(zhangzw,zhangxq,dongjj,etal.associationofccl5/ccr5genepromoterpolymorphismswithdiabeticmicrovascularcomplications:ameta-analysis.journalofdiabetesinvestigation,2016,mar；7(2):212-8.)，我们进一步研究证实，ccr5不仅表达于单核/巨噬细胞中，也特异性表达于内皮/内皮祖细胞中，敲除ccr5虽然能减轻炎症反应，但是也加重了内皮损伤(zhangz,dongj,lobecg,etal.ccr5facilitatesendothelialprogenitorcellrecruitmentandpromotesthestabilizationofatheroscleroticplaquesinapoe-/-mice.stemcellresearch&therapy,2015,6(1):36.)，而内皮细胞特异表达的ccr5是组织血管再生的重要调节因子。与ccr5基因沉默的细胞相比，表达ccr5基因的内皮祖细胞有更强的促血管生成能力。靶向敲除ccr5会导致内皮祖细胞向受损部位聚集减少，促血管生成因子vegf表达量降低，皮肤损伤愈合延迟(ishiday,kimuraa,kuninakay,etal.pivotalroleoftheccl5/ccr5interactionforrecruitmentofendothelialprogenitorcellsinmousewoundhealing.thejournalofclinicalinvestigation,2012,122(2):711-721.)。我们前期研究进一步证实，高糖条件下，小鼠微血管内皮细胞中转染ccr5表达质粒后，细胞促血管新生能力增强，而靶向敲除ccr5后这一促血管新生能力又被明显抑制。上述证据提示ccr5在巨噬/内皮细胞的功能存在异质性，ccr5是介导微血管内皮细胞发挥血管新生功能的关键分子。

基于ccr5在不同的细胞中具体独特的调控机理和特异的功能活性，有必要构建一种动物模型以便于实验和研究，但是国内外尚无ccr5条件性敲除鼠的构建，也无人开展在内皮细胞特异性敲除ccr5的研究。申请人首次证实ccr5在巨噬/内皮细胞中存在“双刃剑”作用，该动物模型一旦构建成功，能为研究ccr5在内皮细胞特异性奠定技术基础，阐明ccr5同一基因在不同细胞、组织中存在异质性，为下一步干预或减缓微血管并发症的进展提供精准分子靶点，符合精准医学的范畴。因此，本发明拟构建条件性内皮细胞基因敲除小鼠，在小鼠体内以一种细胞特异性方式引入突变,从而使ccr5靶基因的缺失发生在试验动物的某一特定的组织器官，最大限度达到机理研究的可控性，克服了常规基因敲除术不区分不同组织或细胞，在小鼠体内行所有组织或细胞剔除靶基因的弊端。本发明现就条件性内皮细胞ccr5基因敲除小鼠制备及繁育方法进行详细的介绍和探讨。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一种内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法。本发明填补了现有技术在内皮细胞中特异性敲除ccr5基因小鼠的空缺，为微血管病变的机制研究提供一个可信的小鼠模型及该小鼠模型的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法：首先，获得ccr5^loxp/loxp小鼠，然后与tie-2-cre/ert2小鼠(携带有tie2-cre基因的cre工具小鼠，该品系小鼠的cre重组酶由小鼠内皮特异性受体酪氨酸激酶tie2启动子驱动，经他莫昔芬诱导可在内皮细胞中特异表达cre重组酶)交配，得到在内皮细胞中特异性敲除ccr5基因的杂合子小鼠(ccr5^flox/+,cre)，然后该杂合子小鼠进行相互交配，从而得到在内皮细胞中特异性敲除ccr5基因的纯合子小鼠(ccr5^flox/flox,cre)；

其中，ccr5^loxp/loxp小鼠的构建方法包括以下步骤：

(1)使用显微注射仪将cas9mrna、grna和donordna按一定浓度比例混匀后，注射入小鼠的受精卵中，则cas9蛋白在grna的靶向作用下对ccr5基因的dna双链进行切割(如图5所示)，从而诱发同源重组修复机制以donordna为模板对损伤的ccr5基因进行修复，将loxp序列整合到小鼠基因组中的特定位点；然后将受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中，通常注射150～200枚受精卵，并移植到2只假孕母鼠中；

所述grna的序列为：

上游靶点：ccr5-l4：gggtgctaattactgttcta；反向互补序列：tagaacagtaattagcaccc；

下游靶点：ccr5-r：gaagaaagttttacggttgt；

所述donordna的序列如seqidno.20所示；

(2)上述胚胎移植的小鼠出生后，选取雄性的5’端和3’端均有floxp插入的小鼠，待7周龄后，与野生型异性小鼠(c57bl/6雌性小鼠)交配，得到f1代loxp杂合子小鼠(ccr5^flox/+)；

(3)将上述f1代loxp杂合子小鼠进行相互近交，得到f2代小鼠，从f2代小鼠中选取ccr5loxp纯合子小鼠(ccr5^flox/flox)，ccr5loxp纯合子小鼠相互近交产生f3代，得到稳定的ccr5loxp纯合子小鼠品系。

本发明的内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法，是在小鼠体内以一种细胞特异性方式引入突变,从而使ccr5靶基因的缺失发生在试验动物的某一特定的细胞，最大限度达到机理研究的可控性。本发明构建的内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠，将其诱导成糖尿病模型后，与对照组小鼠相比，血管完整性被破坏，内皮细胞密度降低，促血管生成因子如vegf表达明显降低，微循环功能障碍，该模型构建成功后，可以用于糖尿病微血管并发症如糖尿病心肌病的发病机制研究，也可用于药物的药效观察和药效评价，以及开发相应的微循环治疗药物和治疗方法的研究。

本发明使用的各种术语和短语，若无特别说明，具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：grna载体示意图。

图2：cas9蛋白表达载体示意图。

图3：报告质粒示意图。

图4：grna的活性检测结果柱形图。

图5：grna/cas9的工作原理示意图。

图6：5’端floxp插入情况鉴定结果图。

图7：3’端floxp插入情况鉴定结果图。

图8：5’端插入floxp序列的小鼠鉴定结果图。

图9：3’端插入floxp序列的小鼠鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

对于以下全部实施例，可以使用本领域技术人员已知的标准操作和纯化方法。除非另有说明，所有温度以℃(摄氏度)表示。所有反应均中室温下进行，除非另有说明。所涉及的序列，均为5’-3’。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实验利用crispr/cas9技术进行ccr5基因条件性敲除小鼠的构建

一、guiderna(grna)靶序列设计

(1)floxp序列插入位置设计：

根据生物信息学分析：ccr5基因有2个转录本可编码蛋白。以ccr5-001转录本为例，该转录本包括2个外显子(exon)，编码354aa，因为蛋白翻译起始于exon2，终止于exon2。故选exon2作为flox区，用同源重组的方式将loxp位点定点整合到exon2编码区上下游约100-200bp的序列中。

(2)grna靶序列设计：

在要插入floxp的外显子两端，设计grna靶点，剪切基因组dna。mouse小鼠ccr5基因组序列如下(如seqidno.1所示)：

注：mouseccr5基因组序列：exon2；灰色背景：外显子exon2；下划线：ccr5基因编码区序列；双下划线：cas9/grna剪切基因组dna的大致位置。

根据基因编码区上下游的序列，设计grna靶点，一般在上下游各设计3～6个靶点。在设计靶点时，通常在待删除目标外显子两侧的内含子中或非翻译区寻找合适的靶序列，grna靶序列的长度一般选择20bp，其3’端以ngg结尾。其中，设计的ccr5基因grna靶序列如下所示(如seqidno.2～16所示)：

注：灰色背景为pam序列，上述带有反向互补序列的靶点，表示该靶点序列位于上述基因组序列的互补链上；

二、grna的活性检测

将上述设计好的grna靶点构建入grna表达载体中(如图1所示)，并与cas9蛋白表达质粒(如图2所示)以及报告质粒(如图3所示)一同转入细胞中，在细胞中进行活性验证。选择活性较高的靶点进行后续实验，并根据所选靶点的序列设计同源臂。实验步骤如下：

(1)合成上述设计的grna靶点(不包含3’端的ngg序列)，并在退火形成双链后，连接入grna表达载体中(图2)，然后转入大肠杆菌中进行扩增，并提取质粒备用；

(2)合成上述设计的grna靶序列(包含3’端的ngg序列)，并在退火形成双链后，连接入luciferase报告质粒中(图3)，然后转入大肠杆菌中进行扩增，并提取质粒备用；

(3)将上述提取的grna质粒、luciferase报告质粒和cas9蛋白表达质粒共转入293细胞中，转染24h后裂解细胞，检测luciferase的表达水平；

grna的活性检测结果如图4所示。

通过以上结果分析，分别选用ccr5-l4和ccr5-r5作为上、下游靶点(如seqidno.2所示)，进行后续实验：

上游靶点：ccr5-l：gggtgctaattactgttcta(如seqidno.17所示)；反向互补序列：tagaacagtaattagcaccc(如seqidno.18所示)；

下游靶点：ccr5-r：gaagaaagttttacggttgt(如seqidno.19所示)。

三、同源重组模板(donor)的构建

(1)根据上述活性较高的上下游grna靶点序列(ccr5-landccr5-r)的位置，设计并构建donordna，序列描述如下：

ccr5-exon2-loxp-donor(如seqidno.20所示)：

注：ccr5基因组序列，exon2；双下划线：cas9/grna剪切基因组dna的大致位置；斜体：floxp序列ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat；灰色背景：同源臂序列；下划线：ccr5基因编码区。

(2)克隆灰色背景间并包括灰色背景的基因组dna序列作为同源臂；

(3)在同源臂上的指定位置插入floxp序列；

(4)将上述构建或合成好的序列，克隆进donor质粒上，转入大肠杆菌扩增后，提取备用；

四、ccr5-floxpfounder小鼠的建立

将步骤二中所构建的grna表达质粒(ccr5-l4andccr5-r)和cas9蛋白表达质粒线性化后，通过体外转录试剂盒转录出相应的grna和cas9mrna，使用显微注射仪将上述cas9mrna、grna和donordna按一定浓度比例混匀后，注射入小鼠的受精卵中，cas9蛋白在grna的靶向作用下对ccr5基因的dna双链进行切割(如图5所示)，从而诱发同源重组修复机制以donordna为模板对损伤的ccr5基因进行修复，将loxp序列整合到小鼠基因组中的特定位点。之后将受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中。通常注射150～200枚受精卵，并移植到2只假孕母鼠中。

五、founder小鼠鉴定

(1)胚胎移植的小鼠将在手术后19天左右出生，待小鼠出生20天后剪尾提取dna并进行基因型鉴定。鉴定结果如图6、图7所示。图6示5’端floxp插入情况鉴定结果图；共出生4只小鼠，分别标记为1#，2#，3#，4#，如上图红色箭头所示，1#和3#小鼠为5’端插入floxp序列的小鼠。图7示3’端floxp插入情况鉴定结果图；总共出生4只小鼠，分别标记为1#，2#，3#，4#，如上图红色箭头所示，3#小鼠为3’端插入floxp序列的小鼠。

(2)综合以上跑胶结果，初步判断3#为5’端和3’端均有floxp插入的ki小鼠。

六、founder小鼠与野生型小鼠交配得到f1代

(1)待雄性founder小鼠(上述鉴定结果为ki的3#小鼠)到7周龄，与野生型异性小鼠交配，得到f1代loxp杂合子小鼠(ccr5^flox/+)9只，小鼠出生20天后取鼠尾，对基因组dna进行基因型鉴定(如图8、图9所示)。若有阳性小鼠出生，则表示敲入基因已经整合到生殖细胞，标志品系建立成功，确保测序结果与f0代相同。

图8示5’端插入floxp序列的小鼠鉴定结果图；共出生9只小鼠，分别标记为3-1，3-2，3-3，3-4，3-5，3-6，3-7，3-8，3-9。如图箭头所示，3-2,3-3,3-4,3-7四只小鼠均为5’端插入floxp序列的小鼠。

图9示3’端插入floxp序列的小鼠鉴定结果图；共出生9只小鼠，分别编号为3-1，3-2，3-3，3-4，3-5，3-6，3-7，3-8，3-9。如图箭头所示，3-2,3-3,3-4,3-7小鼠均为3’端插入floxp序列的小鼠；

(2)综合以上跑胶结果，判断编号为3-2,3-3,3-4,3-7小鼠为5’端和3’端均有floxp插入的f1代小鼠。

七、内皮细胞特异性敲除ccr5基因小鼠的获得

首先将f1代杂合子小鼠(上述鉴定结果为ki的小鼠，编号分别为3-2,3-3,3-4,3-7)进行相互近交，得到f2代小鼠，从f2代小鼠中选取ccr5loxp纯合子小鼠(ccr5^flox/flox)，ccr5loxp纯合子小鼠相互近交产生f3代，得到稳定的ccr5loxp纯合子小鼠品系，再与携带有tie2-cre基因的cre工具小鼠(tie2-cre/ert2，该品系小鼠的cre重组酶由小鼠内皮特异性受体酪氨酸激酶(tie2)启动子驱动，经他莫昔芬诱导可在内皮细胞中特异表达cre重组酶)交配即可得到在内皮细胞中特异性敲除ccr5基因的杂合子小鼠(ccr5^flox/+,cre)，然后再将在内皮细胞中特异性敲除ccr5基因的杂合子小鼠(ccr5^flox/+,cre)进行相互交配从而得到在内皮细胞中特异性敲除ccr5基因的纯合子小鼠(ccr5^flox/flox,cre)。

＊＊＊＊＊

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110>山东省千佛山医院

<120>内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法

<141>2017-11-15

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>9939

<212>dna

<213>musmusculus

<400>1

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