一种转猪链球菌2型MRP基因工程菌的保存方法与流程

本发明涉及转基因工程技术领域，具体而言，涉及一种转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法。

背景技术：

猪链球菌是具有荚膜的一种革兰氏阳性球菌。可根据其细胞壁抗原成分将其大致归类为兰氏分群(lancefieldgroupd)d群链球菌。根据其荚膜抗原(cps)的不同，猪链球菌被分为35(1～34型，1/2型)种血清型，其中1，2，7，9型是猪的致病菌。猪链球菌的定植部位为猪的上呼吸道，尤其是扁桃体和鼻腔。部分血清型的猪链球菌具有致病性，主要通过伤口感染。可引起猪的急性败血症(septicemiawithsuddendeath)、脑膜炎(meningitis)、关节炎(arthritis)、心内膜炎(endocarditis)、肺炎(pneumonia)等疾病。部分菌株可引起人类感染，造成细菌性脑炎(bacterialmeningitis)或引起中毒样休克综合征(toxicshock-likesyndrome)。

因此，对猪链球菌的深入研究和防制在公共卫生方面具有重要意义。在研究猪链球菌的过程中，通常需要利用转基因工程技术对猪链球菌2型的各种基因进行深入研究。需要将导入有外源猪链球菌2型基因的基因工程菌进行保存，以供后期研究、交换和使用等需求。

而菌种在保存过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，这样才能在一定的时间内不发生变异而又保持生物活性。目前比较常用的菌种保存方法包括真空冷冻干燥法、琼脂斜面低温保存法、脱纤维羊血冷冻保存法，液体石蜡保存法。其中真空冷冻保存法效果最好，但对于设备要求高，成本高，制备过程复杂。琼脂斜面低温保存法，操作简便、易于推广，适用范围广，缺点是需经常传代，且易发生污染，保藏期短，而且不适用于对营养要求高的细菌。脱纤维羊血冷冻保存法，这一方法使用的羊血对一般实验室来说不易获得，不能广泛推广使用。液体石蜡保存法，对细菌保存效果差。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法，该保存方法可以有效地提高目标工程菌的存活率，延长其保存时间，可长时期地维持工程菌中外源质粒的稳定性以及工程菌自身的活力和纯度，且该保存具有操作简单、成本低等特点。

本发明是这样实现的：

一种转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法，其包括：

将保存试剂加入至含目标菌的菌液中，得到目标菌保存液；

将目标菌保存液分装于已灭菌的ep管中，并立即置于-80℃～-20℃条件下进行低温保存；

其中，目标菌为转化有外源质粒的转基因工程菌，外源质粒含有猪链球菌2型mrp基因序列；

保存试剂为含有甘油的生理盐水。

采用甘油-生理盐水保存法，其可以维持工程菌细胞内外的渗透压平衡，避免工程菌因失水或吸水溶胀两种现象而导致的死亡，提高存活率；同时，在生理盐水中加入的甘油可以避免在低温状态下因水分结冰对菌体造成的物理伤害，提高菌体的存活率；而将目标菌保存液置于-80℃～-20℃低温条件保存，可以减缓菌体体内的酶活，降低其新陈代谢，延缓其衰老的时间，进而实现其长期保藏的目的；

小量分装保存可减少菌种传代次数，保证菌种性状稳定，不易变异；并能够缩小贮存空间，确保菌种保存环境安全可靠；减少或避免杂菌污染，操作简便，易于推广，有利于提高生产效率和质量；

总之，本发明提供的保存方法为微生物实验教学和科研单位的菌种保藏工作开展提供依据。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在保存试剂中，甘油的浓度为20％～60％。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，甘油的浓度可以是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％等中的任一者或任意两者例如20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％或55％-60％之间的范围。

具有合适浓度范围的甘油的保存试剂可以使得使用者在保存的过程快速、方便地选取保存试剂的体积与待保存的含目标菌的菌液进行合理搭配，控制甘油的终浓度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在目标菌保存液中，甘油的浓度为10％～30％。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在目标菌保存液中，甘油的浓度为15％～25％。

通过以适宜范围内的甘油浓度保藏菌种，一方面确保在能够实现降低在低温状态下因水分结冰对菌体造成的物理伤害的目的前提下，减少甘油的使用，缩小成本，另一方面，避免甘油浓度过大造成的目标菌保存液过于粘稠，影响其中菌体的性能恢复，再有，甘油浓度过低，不能有效地保存菌体免于在低温状态下因水分结冰造成的物理伤害。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在目标菌保存液中，甘油的浓度可以是10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％等中的任意一者或任意两者例如10％-14％、16-20％、22-26％或26％-30％等之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，低温保存的温度为-80℃、-70℃或者-20℃。

将目标菌保存液置于-80℃～-20℃低温条件保存，可以减缓菌体体内的酶活，降低其新陈代谢，延缓其衰老的时间，进而实现其长期保存的目的，且基因工程菌菌体仍然具有一个较高的活力；

将目标菌保存液置于-80℃、-70℃或者-20℃条件下，其保存效果更好。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，转基因工程菌为大肠杆菌。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，大肠杆菌为大肠杆菌top10细胞、dh5α细胞和bl21(de3)细胞中的任意一种。

大肠杆菌作用基因工程技术中常用的宿主菌，其具有生长速度快，培养条件简单，易于传代等特点，这些特点为深入研究猪链球菌2型mrp基因的功能提供了便利。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法，其将转猪链球菌2型mrp基因工程菌保存于含有甘油的生理盐水的保存试剂中，在分装于已灭菌的ep管中，并立即置于-80℃～-20℃条件下进行低温保存；

该保存方法采用甘油-生理盐水保存法，小量分装保存可减少菌种传代次数，保证菌种性状稳定，不易变异；并能够缩小贮存空间，确保菌种保存环境安全可靠，减少或避免杂菌污染；该保存方法具有操作简便，易于推广，有利于提高生产效率和质量等特点，为微生物实验教学和科研单位的菌种保藏工作开展提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同时间后的工程菌的pcr鉴定结果图；

图2为本发明试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同时间后的工程菌的菌落形态照片；

图3为本发明试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同6个月后生物学特性(靛基质试验、vp试验、mr试验以及柠檬酸盐试验)鉴定结果；

图4为本发明试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同9个月后生物学特性(靛基质试验、vp试验、mr试验以及柠檬酸盐试验)鉴定结果；

图5为本发明试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同12个月后生物学特性(靛基质试验、vp试验、mr试验以及柠檬酸盐试验)鉴定结果；

图6为本发明试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同18个月后生物学特性(靛基质试验、vp试验、mr试验以及柠檬酸盐试验)鉴定结果；

图7为本发明试验例中的采用实施例1提供的保存方法保存不同24个月后生物学特性(靛基质试验、vp试验、mr试验以及柠檬酸盐试验)鉴定结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法，其操作如下。

1获取含有猪链球菌2型mrp基因序列的工程菌菌液

取转化有猪链球菌2型部分基因序列的转猪链球菌2型部分基因大肠杆菌(目标菌)的菌液按5％(体积)的接种量接种于200ml的lb肉汤培养基(含100mg/l氨苄青霉素)中，37℃，180rpm/min振荡培养4h。

2取培养后的菌液按1:1的体积比与保存试剂混合，得到目标菌保存液，然后将其分装至已灭菌的1.5mlep管(每个ep管装1ml目标菌保存液)中，并迅速放置于-20℃条件下保存。

其中，所用保存试剂为含有甘油的生理盐水，nacl浓度为0.9％，甘油浓度为60％。目标菌保存液中，甘油浓度30％。

其中，转猪链球菌2型部分基因大肠杆菌构建过程是以质粒puc-57为载体，通过pcr扩增目的基因(猪链球菌2型mrp基因)，酶切后将目的基因与载体链接，然后转化到dh5α大肠杆菌中而获得的。

猪链球菌2型mrp基因核苷酸序列如下：

5’-tatttactgggtatgattatgtggcaactacaactaaagccgttcaaggtccatatccaaagggaacggtataccttgctggtacggttcaaaaggatacagtacaatataaagttattcgtgaaattgtggagaacgaccaagcagttcttaaattctattatttagatcctacctataagggtgaagtagattggagaggaactgatacgactgggtttattgagttgcttacaacttccccaacaacctataaagttggtactatatacgattacaatattaattcaaaaattacagctccatttactattgatcctaccaagaatgttatggttttcaaggaaagtgaacagaacgagcaaggtagcaaatatc-3’。

实验例1

分别于保存后不同时间点(6个月、9个月、12个月、18个月、24个月)取出转基因大肠杆菌进行稳定性考察。具体如下。

1菌株存活率

于不同时间点将由实施例1保存方法保存的转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌从-20℃环境中取出，每次取30管，于37℃水浴中快速解冻，然后进行平板划线将菌株复苏，一个管划线一个平板，共划线30个平板，观察每个平板上是否有菌落长出，如有菌落长出则记为存活，若无菌落长出，则记为死亡，计算保存不同时间后菌株复苏后的存活率(存活平板数/总划线平板数)，结果如下表1。

对照例：采用与实施例基本相同的方法保存转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌；不同的是对照例以采用甘油和纯化水组合形成的对照试剂(甘油浓度30％，不含有nacl)作为保存试剂。

表1采用实施例1的保存方法进行保存不同时间后的转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌的存活率

表1结果显示，采用实施例1的保存方法进行转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌在保存24个月，转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌的存活率仍然可达100％，高于对照例的90％。

2pcr鉴定

于不同时间点将采用实施例1保存方法保存的转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌从-20℃环境中取出，每次取3管，于37℃水浴中快速解冻，然后进行菌落pcr鉴定，检测保存不同时间后菌株中是否存在目的基因。

pcr鉴定方法：

取菌液2μl，加入0.2mlpcr薄壁管中，另加入10倍taq酶浓缩缓冲液2.5μl，dntp0.5μl(浓度为10mm)，上游引物mrpf及下游引物mrpr各0.25μl(引物浓度为25μm)，taq酶0.25μl，加水补足总体积至25μl，将pcr薄壁管置迷你离心机瞬时离心。以无菌水作为阴性对照。

上游引物mrpf序列：5’actgggtatgattatgtggc3’；

下游引物mrpr序列：5’taccttgctcgttctgttcac3’。

按如下程序置pcr扩增仪上扩增：94℃变性3min；94℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸3min，即得pcr扩增产物。产物大小为364bp。

将pcr产物用浓度为1.5％的琼脂糖(含0.5μg/mleb)凝胶电泳，每孔加入扩增产物和加样缓冲液混合物6μl(pcr扩增产物和6×loadingbuffer比例为5:1)，另取标准dnamarker6μl直接上样，电压130v，电泳40min。电泳结束后用凝胶成像系统观察。

电泳结束后用凝胶成像系统观察。结果如图1所示(图中：m代表marker，1代表保存的菌液，2代表阴性对照(即无菌水))，结果显示保存24个月后，在364bp位置有条带，说明转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌含有猪链球菌2型mrp基因，质粒稳定地存在于大肠杆菌中。

3生物学特性鉴定

于不同时间点将采用实施例1保存方法保存的转基因大肠杆菌从-20℃环境中取出，每次取1管，37℃水浴中快速解冻，接种相应选择培养基(曙红亚甲蓝琼脂培养基)观察菌落形态；革兰氏染色后镜检菌体形状；检测相关生化特征即靛基质试验、vp试验、mr试验(甲基红试验)以及柠檬酸盐试验。结果如下。

3.1菌落形态观察结果如图2所示，图2结果显示，由实施例1提供的方法保存24个月后，转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌的菌落形态良好，紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。

3.2革兰氏染色后经显微镜观察可知，采用实施例1提供的保存方法在一年的保存时间内菌体形态良好，染色后均为红色杆状或短棒状结构。

3.3靛基质试验结果如图3-图7所示，图3-7结果显示，采用实施例1提供的保存方法保存24个月，转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌的靛基质试验结果呈阳性。

3.4vp试验结果如图3-图7所示，图3-7结果显示，采用实施例1提供的保存方法保存24个月，转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌的vp试验结果呈阳性。

3.5mr试验结果如图3-图7所示，图3-图7结果显示，采用实施例1提供的保存方法保存24个月，转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌的mr试验结果呈阴性。

3.6柠檬酸盐试验结果如图3-图7所示，图3-图7结果显示，采用实施例1提供的保存方法保存24个月，转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌的柠檬酸盐试验结果呈阴性。

以上试验结果充分说明，采用实施例1提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法可以长期保存转猪链球菌2型mrp基因大肠杆菌，保证菌种性状稳定，不易变异；并能够缩小贮存空间，确保菌种保存环境安全可靠，减少或避免杂菌污染；该保存方法具有操作简便，易于推广，有利于提高生产效率和质量等特点，为微生物实验教学和科研单位的菌种保藏工作开展提供依据。

实施例2

本实施例提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法，其操作如下。

1获取含有猪链球菌2型mrp基因序列的工程菌菌液

取转化有猪链球菌2型部分基因序列的转猪链球菌2型部分基因大肠杆菌(目标菌)的菌液按5％(体积)的接种量接种于200ml的lb肉汤培养基(含100mg/l氨苄青霉素)中，37℃，200rpm/min振荡培养4h。

2取培养后的菌液按1:1的体积比与保存试剂混合，得到目标菌保存液，然后将其分装至已灭菌的1.5mlep管(每个ep管装1ml目标菌保存液)中，并迅速放置于-80℃条件下保存。

其中，所用保存试剂为含有甘油的生理盐水，nacl浓度为0.9％，甘油浓度为50％。目标菌保存液中，甘油浓度25％。

采用本实施例的保存方法保存不同时间后的转基因大肠杆菌的存活率结果见表2。

实施例3

本实施例提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法，其操作如下。

1获取含有猪链球菌2型mrp基因序列的工程菌菌液

取转化有猪链球菌2型部分基因序列的转猪链球菌2型部分基因大肠杆菌(目标菌)的菌液按5％(体积)的接种量接种于200ml的lb肉汤培养基(含100mg/l氨苄青霉素)中，37℃，200rpm/min振荡培养4h。

2取培养后的菌液按1:1的体积比与保存试剂混合，得到目标菌保存液，然后将其分装至已灭菌的1.5mlep管(每个ep管装1ml目标菌保存液)中，并迅速放置于-80℃条件下保存。

其中，所用保存试剂为含有甘油的生理盐水，nacl浓度为0.9％，甘油浓度为36％。目标菌保存液中，甘油浓度18％。

采用本实施例的保存方法保存不同时间后的转基因大肠杆菌的存活率结果见表2。

实施例4

本实施例提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法，其操作如下。

1获取含有猪链球菌2型mrp基因序列的工程菌菌液

取转化有猪链球菌2型部分基因序列的转猪链球菌2型部分基因大肠杆菌(目标菌)的菌液按5％(体积)的接种量接种于200ml的lb肉汤培养基(含100mg/l氨苄青霉素)中，37℃，200rpm/min振荡培养4h。

2取培养后的菌液按1:1的体积比与保存试剂混合，得到目标菌保存液，然后将其分装至已灭菌的1.5mlep管(每个ep管装1ml目标菌保存液)中，并迅速放置于-70℃条件下保存。

其中，所用保存试剂为含有甘油的生理盐水，nacl浓度为0.9％，甘油浓度为24％。目标菌保存液中，甘油浓度12％。

采用本实施例的保存方法保存不同时间后的转基因大肠杆菌的存活率结果见表2。

实施例5

本实施例提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法，其操作如下。

1获取含有猪链球菌2型mrp基因序列的工程菌菌液

取转化有猪链球菌2型部分基因序列的转猪链球菌2型部分基因大肠杆菌(目标菌)的菌液按5％(体积)的接种量接种于200ml的lb肉汤培养基(含100mg/l氨苄青霉素)中，37℃，200rpm/min振荡培养4h。

2取培养后的菌液按1:1的体积比与保存试剂混合，得到目标菌保存液，然后将其分装至已灭菌的1.5mlep管(每个ep管装1ml目标菌保存液)中，并迅速放置于-20℃条件下保存。

其中，所用保存试剂为含有甘油的生理盐水，nacl浓度为0.9％，甘油浓度为20％。目标菌保存液中，甘油浓度10％。

采用本实施例的保存方法保存不同时间后的转基因大肠杆菌的存活率结果见表2。

对比例2

本对比例提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法与实施例1的保存方法基本相同，不同的是本对比例所使用的保存试剂中的甘油浓度为70％，在目标菌保存液中，甘油浓度控制为35％。

采用本对比例的保存方法保存不同时间后的转基因大肠杆菌的存活率结果见表2。

对比例3

本对比例提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法与实施例1的保存方法基本相同，不同的是本对比例所使用的保存试剂中的甘油浓度为8％，在目标菌保存液中，甘油浓度控制为4％。

采用本对比例的保存方法保存不同时间后的转基因大肠杆菌的存活率结果见表2。

对比例4

本对比例提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法与实施例1的保存方法基本相同，不同的是本对比例所使用的保存试剂中不含有nacl，仅由甘油和纯化水组成，且甘油浓度为30％，在目标菌保存液中，甘油浓度控制为15％。

采用本对比例的保存方法保存不同时间后的转基因大肠杆菌的存活率结果见表2。

表2由实施例2-5以及对比例2-4提供的保存方法保存不同时间后的转基因工程菌的存活率

由表2数据可知，相较于对比例2-4，采用本发明实施例提供的保存方法可以长期保存转猪链球菌2型mrp基因工程菌，提高菌体成活率，尤其是实施例2提供的保存方法，在保存36个月后，菌体成活率依然可以达到100％。

综上，本发明实施例提供的转猪链球菌2型mrp基因工程菌的保存方法具有操作简单、存放时间长、占用空间小、成本低廉、一次冻存多管小量分装，方便管理，防止反复冻融造成菌体死亡和杂菌污染，提高菌体成活率，且经过长时间的保存仍然保持与原代菌种相同的活力和纯度，维持菌种和质粒的稳定性起到重要的保存作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保存范围之内。