一种基于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒的制作方法

技术特征：

1.一组用于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性PCR引物组合，其特征在于，包括一对甲基化引物和一对非甲基化引物，甲基化引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示，非甲基化引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示。

2.权利要求1所述的甲基化特异性PCR引物组合在制备基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒中的应用。

3.一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的甲基化特异性PCR引物组合。

4.根据权利要求3所述的癌症早期筛查试剂盒，其特征在于，还含有甲基化特异性PCR试剂、修饰基因组DNA试剂、脱盐脱磺酸基试剂、外周血白细胞DNA 提取试剂和/或DNA纯化试剂。

5.根据权利要求4所述的癌症早期筛查试剂盒，其特征在于，甲基化特异性PCR试剂包括：Taq酶，10×含Mg²⁺ 的PCR 缓冲液，dNTP mixture，ddH₂O。

6.根据权利要求5所述的癌症早期筛查试剂盒，其特征在于，甲基化特异性PCR试剂的反应体系为：Taq酶0.1 μl，10×含Mg2+ 的PCR 缓冲液2μl，dNTP mixture 1.6μl，上游引物1μl，下游引物1μl，待测样本DNA 1μl，ddH₂O 13.3μl，总计反应体系20μl，其中上游引物和下游引物的浓度为10nM。

7.根据权利要求3所述的癌症早期筛查试剂盒，其特征在于，甲基化引物的退火温度为64℃。

8.根据权利要求7所述的癌症早期筛查试剂盒，其特征在于，甲基化引物的扩增反应程序为：预变性94℃ 5分钟，变性94℃ 30秒，退火64℃ 30秒，延伸72℃ 45秒，30个循环反应。

9.根据权利要求3所述的癌症早期筛查试剂盒，其特征在于，非甲基化引物的退火温度为61℃。

10.根据权利要求9所述的癌症早期筛查试剂盒，其特征在于，非甲基化引物的扩增反应程序为：预变性94℃ 5分钟，变性94℃ 30秒，退火61℃ 30秒，延伸72℃ 45秒，30个循环反应。